CN104774782A - 鸡源粪肠球菌分离株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鸡源粪肠球菌分离株及其应用。本发明从20周龄健康鸡盲肠中分离得到一株性能优异的粪肠球菌分离株B10，其微生物保藏编号为：CCTCC No：M2014488，分类命名为MDXEF-1。该分离株有优异的耐酸性能和耐胆盐性能，抑菌谱广，对常见致病菌均有明显的抑制作用；分离株MDXEF-1对多种抗生素敏感，将该菌饲喂给肉仔鸡后可以显著增加鸡的体重，促进鸡的生长，能够作为促进禽类生长的饲料添加剂。本发明分离株MDXEF-1可以作为宿主菌而且在不外加nisin诱导物的情况下高效表达异源蛋白，适宜于生产中大规模发酵应用，能作为饲用乳酸菌疫苗运送载体。

Description

鸡源粪肠球菌分离株及其应用
技术领域
本发明涉及粪肠球菌菌株，尤其涉及鸡源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)分离株，本发明还涉及该分离株在禽类养殖、表达外源蛋白以及作为饲用乳酸菌疫苗运送载体等方面的应用，属于粪肠球菌菌株的分离及其应用领域。
背景技术
乳酸菌是人及动物肠道内一类重要的优势益生菌，无毒副作用的乳酸菌微生态制剂近年来受到了广泛关注。肠球菌属在1984年被列为独立的新菌属。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是肠球菌属内的代表种，为革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一(Malik RK，Montecalvo MA，Reale MR，et al.Epidemiology and control of vancomycin-resistant enterococci in a regional neonatal intensive care unit.Pediatr Infect Dis J，1999，18(4)：352.)，其能产生天然抗生素，有利于机体健康(Malik RK，Montecalvo MA，Reale MR，et al.Epidemiology and control of vancomycin-resi stant enterococci in a regional neonatal intensive care unit.Pediatr Infect Dis J，1999，18(4)：352.)；同时还能产生细菌素等抑菌物质，具有抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境等功能(David FM，Arthur EB，Gary JN，et al.An investigation of vancomycin-resistant enterocicci faecium within the pediatric service of a large urban medical center.Pediatr Infect Dis J，1998，17(3)：184.)；粪肠球菌还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。
粪肠球菌(E.faecalis)作为一种肠道益生菌，在医学和食品工程领域得到广泛应用。另外，因为动物源的粪肠球菌是动物消化道内正常存在 的一类微生物，所以在肠道内具有较强的耐受胃酸和胆盐作用的特点，是一种兼性厌氧的乳酸菌，其与培养保存条件苛刻的厌氧双歧杆菌相比，更适合于在生产中应用(李光辉，肠球菌感染研究进展，国外医学内科学分册，1999，26：471)。
因此，从动物源材料中分离获得性能优良且可以作为宿主菌表达异源蛋白的鸡源粪肠球菌分离株将具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株耐酸和耐胆盐性能优异、抑菌谱广、无致病性、能够有效促进禽类生长、可以作为宿主菌表达异源蛋白的鸡源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)分离株；
本发明的目的之二是将所分离的鸡源粪肠球菌分离株应用于禽类养殖、表达外源蛋白等方面。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先从20周龄健康鸡盲肠中分离得到菌株共计13株，分别命名B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13。
本发明将分离获得的13株菌株进行耐酸实验和耐胆盐实验。根据耐酸实验结果可见：本发明所分离的13株菌株可以耐受肠道低pH值，在pH2.0～7.0范围内可存活，pH 5.0存活率可达98.3％；其中，相比于其它的11株分离株，分离株B10以及B11的耐酸性能最为优异；根据耐胆盐实验结果可见：本发明的分离13株菌株可以耐肠道高胆盐，在胆盐浓度0.1％～0.8％范围内可存活；其中，分离菌株B6，B7，B9以及B10在0.1％胆盐培养基中的存活率超过了90％，并且在0.8％胆盐培养基中的存活率均较其它各分离株明显要高。综合耐酸实验和耐胆盐实验结果可见，分离株B10不仅具有优异的耐酸性能，还具有优异的耐胆盐性能，是在分离的13株菌株中性能最为优异的一株菌株。因此，本发明将分离株B10提交专利认可的机构进行保藏， 其微生物保藏编号为：CCTCC No:M 2014488；分类命名是：粪肠球菌MDXEF-1(Enterococcus faecalis MDXEF-1)；保藏时间是：2014年10月16日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉武汉大学。
本发明将耐酸和耐胆盐性能优异的分离株B10(MDXEF-1)进行抑菌谱测定；抑菌谱测定结果表明，分离株B10对常见致病菌(如大肠埃希氏菌，鸡白痢沙门氏菌，多杀性巴氏杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌等)均具有明显的抑制作用。
本发明通过实验进一步发现，分离株B10对多种抗生素敏感，将该菌饲喂给肉仔鸡后，与正常饲喂组相比，可以显著增加鸡的体重，因此，可以将本发明分离株B10掺入到鸡等禽类的饲料中用于促进禽类的生长。
本发明通过检测发现，分离株B10粪肠球菌菌株中不合有质粒。将含有鸡柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)3-1E基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达质粒pTX8048-3-1E电转化入MDXEF-1中筛选获得重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1，重组菌经乳链球菌素(nisin)诱导后，采用Westernblot方法成功检测到了目的蛋白表达。此外，更为重要的是，实验中发现重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1在不加nisin诱导情况下也可表达外源蛋白，而且重组乳酸乳球菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000经MDXEF-1菌培养液上清诱导后可以表达目的蛋白，初步表明MDXEF-1为产nisin菌株。
综上，本发明从健康鸡盲肠中分离得到具有优异的耐酸性能和耐胆盐性能的粪肠球菌分离株B10，该菌株对常见致病菌(如大肠埃希氏菌，鸡白痢沙门氏菌，多杀性巴氏杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌等)均具有明显的抑制作用，抑菌谱广；分离株B10可以作为饲料添加剂促进禽类的生长。此外，本发明分离株B10可以作为宿主菌而且在不外加nisin诱导物的情况下表达异源蛋白，适宜于生产中大规模发酵应用，因此能够作 为饲用乳酸菌疫苗运送载体。
附图说明
图1分离株B10革兰氏染色形态(×100)。
图2MDXEF-1菌株16s rDNA PCR扩增产物电泳图；1.DNA Marker DL5000；2～8.16s rDNA扩增片段；9.PCR阴性对照。
图3阳性质粒pTX8048-3-1E图谱(Ma DX，Gao MY，Rami AD et al.，Parasitol.Res.，2013，112：4161～4167)。
图4重组阳性菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1PCR鉴定结果；1DNA Marker DL5000；2-9PCR扩增阳性质粒中3-1E片段。
图5Westernblot检测目的蛋白3-1E在粪肠球菌MDXEF-1表达结果；1.预染蛋白分子量标准；2.MDXEF-1菌对照；3.未诱导重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1；4.Nisin诱导重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1；5.Nisin诱导空载体重组菌pTX8048/MDXEF-1。
图6Westemblot检测MDXEF-1菌培养上清中nisin；1.MDXEF-1菌阴性对照；2.pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000经5ng/ml nisin诱导的菌体蛋白；3.pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000经MDXEF-1菌培养上清诱导的菌体蛋白；4.pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000不经外源诱导物(nisin)诱导的菌体蛋白阴性对照；5.预染蛋白分子量标准。
图7重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1免疫后血清中IgG变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1鸡源乳酸菌分离株的分离
无菌取20周龄健康鸡盲肠内容物，加入适量磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，震荡混匀后10倍系列稀释(10-1～10-8)，每个稀释度取50ul分别涂布于MRS固体培养基平板(MRS培养基购自北京陆桥生物技术有限公司，培养基成分包括：牛肉蛋白粉，鱼肉汁，酵母浸出汁粉，葡萄糖，醋酸钠，柠檬酸二铵，吐温80，硫酸镁，硫酸锰)，37℃厌氧培养。挑取MRS平板上生长的单菌落，划板传代培养。经革兰氏染色镜检，过氧化氢酶实验，初步从健康20周龄健康鸡盲肠中分离到共计13株菌株，暂命名为B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13。
实验例1鸡源乳酸菌分离株耐酸实验和耐胆盐实验
1耐酸实验
将MRS液体培养基pH值分别调节为pH 2.0，pH 2.5，pH 3.0，pH 3.5，pH 4.0，pH 4.5，pH 5.0，pH 6.0，pH 7.0，以2％比例接种实施例1得到的各分离株(B1～13)的菌液于5ml MRS液体培养基中，37℃培养3h。计算不同酸性条件下各分离菌株的存活数，即将培养3h后的菌液在MRS液体培养基中十倍梯度稀释，涂布MRS培养平板，置于37℃静止培养24h，进行菌落形成单位(CFU)计数，以pH6.0培养液中的活菌数为对照，计算各分离株在不同pH值培养液中存活数，计算出相对于pH6.0培养液菌数的存活率。
实验结果表明，所分离的13株菌株在培养基pH值自2.0向6.0逐渐增高时，菌株存活率呈逐渐升高趋势，在培养基pH值为7时的存活率又开始下降。其中，相比于其它的11株分离株，分离株B10以及B11的耐酸性能最为优异(表1)。
表1不同pH值条件下各分离株相对pH6培养液中的存活率
2耐胆盐实验 
将MRS液体培养基中的牛胆盐(购自Sigma公司)浓度分别调节为0％，0.1％，0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，培养液pH值调节为6.0。以2％比例接种活化的分离株菌液，37℃静止培养5h。菌液在MRS培养液中十倍梯度稀释，涂MRS平板，置于37℃静止培养24h后进行平板菌落形成单位(CFU)计数，以无胆盐MRS培养基中活菌数为对照，计算不同胆盐浓度下分离菌的存活率。
实验结果表明，分离菌株B6，B7，B9以及B10在0.1％胆盐培养基中的存活率超过了90％，并在0.8％胆盐培养基中的存活率均较其它各分离株明显要高，其中，B10菌株的存活率显著高于其它菌株的存活率(表2)。
表2不同胆盐浓度培养基中分离株存活率
实验例2分离株B10的生物学性能测定实验
1、分离株B10抑菌谱测定实验
本实验选取耐酸和耐胆盐性能具有较好的分离株B10进行抑菌谱测定。
将活化的指示菌，即大肠埃希氏菌(C83552)，鸡白痢沙门氏菌(C79-13)，多杀性巴氏杆菌(C48102)，单核细胞增生李氏杆菌(C53005)，金黄色葡萄球菌2086以2％比例分别接种于各自LB液体培养基中培养过夜。各指示菌液经10倍系列稀释后，分别涂布于LB培养平板，测定五种菌的菌落形成单位(CFU)。将各指示菌约1×108CFU菌数(0.1ml)分别涂布于等距离安放4个牛津杯(内径约6mm)的LB平板上，取B10培养12h的上清液体，5000rpm离心20min，去除沉淀，上清调pH值至3.0。将上述上清液200μl加入各个平板的3个牛津杯中，另一个牛津杯中加乳酸(pH3.0)作为观察对照，37℃培养12h。测量牛津杯周围出现的抑菌圈直径(mm)，试验进行三次重复，计算抑菌圈均值。
分离株B10对五种指示菌抑制作用见表3。
表3分离株B10抑菌谱测定
2分离株B10形态观察
对筛选到的具有较好耐酸、耐胆盐及抑菌性能的分离株B10进行革兰氏 染色。B10菌经MRS平板培养24h，菌落呈圆形，边缘光滑，灰白色，直径约0.5mm。在洁净载玻片上滴加100ul无菌生理盐水，用吊菌环从平板上挑取单菌落并与灭菌生理盐水混匀，自然干燥后进行革兰氏染色，即草酸铵结晶紫染液(A液结晶紫2g，95％乙醇20ml；B液草酸铵0.8g，蒸馏水80ml，混合A、B液后室温放置48h)染色1min，流水冲洗；之后滴加卢氏碘液(碘化钾2g溶解于少量蒸馏水中，碘片1g溶解于碘化钾溶液中，碘片全部溶解后加蒸馏水至300ml)染1min；水洗，吸水纸吸去水分；滴加95％乙醇并轻摇约0.5min，，蕃红染液(蕃红2.5g溶解于100ml 95％乙醇)复染1min，镜检。
镜检结果显示，分离菌B10为革兰氏阳性，球菌，不形成芽孢(图1)。
3分离株B10药物敏感试验 
应用常规方法进行药敏试验，配置MRS琼脂培养平板，将1×108CFU菌数(0.1ml)的B10菌液用玻璃涂棒均匀涂布在平板表面，静止放置5min，待平板表面干燥后，将含抗生素(青霉素G，头孢噻吩钠，氯霉素，卡那霉素，头孢三嗪，红霉素，左氧氟沙星，环丙沙星，盐酸万古霉素，磺胺嘧啶SD，阿莫西林，盐酸四环素)的药敏纸片放置在平板表面，灭菌玻璃棒轻压使药敏片平整并紧密贴附在培养基表面。37℃培养24h，测量抑菌圈直径。
实验结果显示，、B10菌对青霉素G，氯霉素，卡那霉素，左氧氟沙星，环丙沙星，磺胺嘧啶SD，阿莫西林以及盐酸四环素均敏感；对头孢塞吩钠，头孢三嗪，红霉素，盐酸万古霉素耐药(表4)。
表4B10分离株药物敏感测定
416s rDNA鉴定B10分离株
提取B10菌的基因组DNA(参照Bioteke公司试剂盒说明进行)，提取DNA保存于-20℃备用。应用16srDNA扩增通用引物(上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′，下游5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′)进行PCR扩增16s rDNA片段，PCR扩增体系为，10×Ex Taq Buffer 2.5ul，Ex Taq DNA聚合酶0.25ul，dNTP 2ul，通用引物上游0.5ul，通用引物下游0.5ul，DNA模板0.5ul，ddH2O 18.75ul，总体系25ul，PCR扩增条件为，94℃2min，94℃30s，51.2℃30s，72℃30s，72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见1500左右的目的条带(图2)。
目的条带经琼脂糖凝胶回收试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)回收纯化，克隆入pMD18-T载体中，筛选出阳性克隆质粒后送上海生工生物工程公司进行序列测定，序列经BLAST序列比对分析，结果表明，该菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，将B10分离株命名为MDXEF-1，并于2014年10月保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为NO：M2014488。
实验例3MDXEF-1菌(B10分离株)致病性检测实验
将20只5日龄SPF雏鸡随机分成4组，即MDXEF-1菌腹腔注射组，MDXEF-1菌滴鼻组，MDXEF-1菌肌肉注射组和空白对照组。将1×109CFU的MDXEF-1菌分别经腹腔注射途径、滴鼻途径、腿部肌肉注射途径接种。自接种后24h连续观察雏鸡临床症状。接种后第3天将各组鸡处死进行病理解剖学观察，同时采取各脏器(肝脏，肺脏，心脏，脾脏，肾脏，肌肉)材料于10％福尔马林中固定，常规方法进行病理组织学切片和苏木素-伊红染色，之后显微镜下进行观察。剖检观察同时，自肝脏、肺脏、脾脏、心脏血液和腿部肌肉用吊菌环吊菌接种于GM17培养基中培养过夜，观察是否有细 菌生长。
实验结果显示，各组鸡接种后24h均未表现出任何临床症状，病理解剖学观察也未见各脏器出现眼观可见的病理学变化，病理组织学观察见各脏器组织结构与正常组相比无明显变化，各脏器实质和间质细胞无明显损伤。自肝脏、肺脏、脾脏、心脏血液和腿部肌肉吊菌接种的培养基中未见细菌生长。结果表明，MDXEF-1菌经上述剂量和上述接种途径接种后对鸡无致病性。
实验例4MDXEF-1菌促进雏鸡增重的实验
60只1日龄SPF雏鸡无菌饲养，3日龄剔除体重过大和过小的雏鸡，将选用的45只雏鸡平均分成3组，即MDXEF-1组(饲喂MDXEF-1菌)，正常饲喂对照组，L.lactisNZ9000组(饲喂L.lactis NZ9000菌)，每组15只鸡。各组鸡自由采食，在5，6，7日龄，15，16，17日龄，25，26，27日龄，每天灌服剂量为1×108CFU菌夜(0.1ml)，28日龄对各组鸡进行称重，比较各组鸡体重变化(表5)。
统计结果表明，MDXEF-1组与L.lactis NZ9000组差异显著(p＜0.05)，MDXEF-1组与空白对照组相比差异极显著(p＜0.01)。结果显示，分离菌株MDXEF-1饲喂雏鸡后可以显著增加体重。
表5分离株MDXEF-1口服饲喂雏鸡后增重变化
注：肩标大写字母不同表示差异极显著(p＜0.01)，肩标小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)
实验例5MDXEF-1菌作为宿主菌表达异源蛋白的实验
1.MDXEF-1菌的质粒检测 
自MRS平板上挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，静止培养过夜。 按2％接种量转接到100ml新鲜MRS液体培养基中，培养过夜，采用质粒大量提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取质粒，用以检测MDXEF-1菌中是否携带质粒。
经1％琼脂糖凝胶电泳显示MDXEF-1中无质粒存在。
2.MDXEF-1菌作为宿主菌表达异源蛋白
2.1MDXEF-1菌感受态细胞制备方法
从新鲜GM17(M17培养基加入5g/L葡萄糖即为GM17，M17培养基购自北京陆桥生物技术有限公司，培养基成分为：多聚蛋白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，β-磷酸甘油二钠，抗坏血酸，MgSO4·7H2O，乳糖)琼脂平板上挑取MDXEF-1单菌落，接种于5ml GM17液体培养基中，37℃培养过夜；按2％接种量转接到100ml新鲜SGGM17液体培养基中，37℃静置培养至OD600值为0.4；培养物置于冰上15min，6000rpm 4℃离心10min，收集细胞；转化缓冲液(0.5mol/L蔗糖，10％甘油)洗涤细胞，6000rpm，4℃离心10min；重复上述步骤一次；去除上清液，收集沉淀，向菌体细胞中加入1％体积培养物的转化缓冲液，将菌体悬起，分装1.5mL Eppendorf管，-80℃保存。
2.2重组阳性粪肠球菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1制备
取干净的电转化杯，紫外线下灭菌30min，冰上预冷10min；取100ul冰冻的感受态细胞悬浮液，加入5ul乳酸菌表达质粒pTX8048-3-1E(为本发明人构建并保存，启动子为PnisA，氯霉素抗性标记，阳性质粒图谱见图3，详细构建方法参见发明人发表文献(Ma DX，Gao MY，Rami AD et al.，Parasitol.Res.，2013，112：4161～4167)，混匀冰浴10min；转移混合液至电转化杯。设置转化电压为2000V，快速擦干电转化杯，放入电击槽中，进行电击转化；向转化后的电转化杯中加入890ul GM17MC恢复培养液(M17培养基，5g/L葡萄糖，20mmol/L MgCl2，2mmol/L CaCl2)；将液体移入 Eppendorf管中，37℃静止培养3h，将细胞涂布于含有3ug/mL氯霉素的GM17固体平板上，37℃培养48h。选取疑似阳性菌落8个，于含有10ug/ml氯霉素GM17培养液中培养过夜，次日采用试剂盒(宝生物工程公司)提取质粒，进行PCR鉴定，以提取的8个质粒作为模板可扩增出500bp目的条带(图4)。
2.3重组阳性乳酸菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1表达蛋白检测
将鉴定为阳性的目的重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1按2％比例接至新鲜20ml GM17培养基(10ug/ml氯霉素)。OD值为0.4时加10ng/ml乳酸链球菌素(nisin)(Sigma，USA)诱导剂。诱导8h后将20ml菌液于4℃，10000rpm，离心10min。取沉淀进行如下处理，用PBS重悬沉淀，4℃8000rpm离心5min，重复洗涤三次，400ul PBS重悬沉淀，超声处理，每次8s，间隔10s，共8次。超声处理后样品加入等体积上样缓冲液(含Tris-HCl，SDS，溴酚兰，甘油，β巯基乙醇)，沸水浴10min，-20℃保存备用。
蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离，之后将凝胶中的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，采用1∶400稀释的兔抗3-1E蛋白抗体(为本发明人实验室制备保存，可参见发明人发表文献Ma DX，Ma CL，Pan L et al.，Experimental parasitology，2011，127(1)：208-14.)孵育2h，TTBS液(Tris-HCl 20mmol/L，pH 7.5，NaCl 100mmol/L，0.1％Tween-20)洗涤3次，每次5min。之后加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(Sigma，USA)，孵育2h。TBS液(Tris-HCl 20mmol/L，pH 7.5，NaCl100mmol/L)洗涤2次，每次5min，DAB显色，westernblot检测表达蛋白结果见图5。试验中设立MDXEF-1菌对照，未诱导重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1对照，nisin诱导空载体重组菌pTX8048/MDXEF-1对照。
3.MDXEF-1菌产nisin检测
鉴于上述未诱导重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1同样检测到了目的蛋 白的表达，因此推测MDXEF-1菌可以产生nisin。为了鉴定MDXEF-1是否可以产生nisin，采用本发明人实验室先前构建并保存的重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000来鉴定(重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000可构建参考文献Ma DX，Gao MY，Rami AD et al.，Parasitol Res.，2013，112：4161～4167，质粒pTX8048-3-1E中启动子为PnisA，重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000需在nisin诱导下才能表达目的蛋白)。将MDXEF-1菌于GM17培养基中37℃培养过夜，5000×g离心10min，收集上清，将MDXEF-1菌的培养上清1000倍稀释后加入到OD值为0.5的重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000培养液中，即以MDXEF-1菌培养上清代替nisin诱导物。同时以MDXEF-1空菌和不加外源诱导物的重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000作为阴性对照，以加5ng/ml nisin诱导重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000作为阳性对照(参见Ma DX，Gao MY，Rami AD，Parasitol Res，2013，112：4161～4167)。继续培养3h后，进行SDS-PAGE电泳，之后采用westernblot检测pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000中目的蛋白表达，westernblot具体操作方法同上。
实验结果表明，MDXEF-1菌培养上清含有nisin，可以代替nisin诱导重组菌pTX8048-3-1E/L.lactis NZ9000表达目的蛋白(图6)。表明MDXEF-1菌可以产生nisin。
实验例6MDXEF-1菌作为宿主菌表达蛋白的应用
1、实验方法 
1日龄SPF雏鸡80只，无球虫条件下自由采食饮水。随机分成3组，即PBS缓冲液组、pTX8048-3-1E/MDXEF-1组、pTX8048/MDXEF-1组，每组25羽。每次免疫前进行称重并记录。免疫用菌和菌体样品制备、SDS-PAGE及Western blot鉴定的具体方法同前述。免疫程序为，在5～7、15～17、25～27日龄pTX8048-3-1E/MDXEF-1组每只鸡口服1×108CFU(0.1 ml)重组阳性菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1，pTX8048/MDXEF-1组每只鸡口服1×108CFU(0.1ml)重组阳性菌pTX8048/MDXEF-1，PBS组口服0.1ml PBS缓冲液(pH7.2)，免疫三次。28日龄对各组鸡进行称重，经翅静脉采血制备血清，检测血清中IgG抗体变化。
3-1E蛋白纯化
采用镍柱(Invitrogen)纯化大肠杆菌表达3-1E目的蛋白作为包被抗原(携带pET30a-3-1E质粒的阳性大肠杆菌为本发明人实验室构建保存，可参见Ma DX，Ma CL，Pan L et al.，Experimental parasitology，2011，127(1)：208-14.)，检测具体步骤如下：将1ml填料加入新柱子中，让液体流出，加入2ml蒸馏水洗涤一次。蒸馏水2ml重复洗涤一次，加入2ml lysis Buffer(与超声相同浓度咪唑)洗涤一次。待纯化蛋白上柱，封口膜封口，室温振摇结合2h。梯度洗脱程序为：2ml 20mM咪唑洗一次，除去未结合蛋白。2ml 30mM咪唑洗2次，除去杂蛋白。2ml 40mM咪唑洗2次，除去杂蛋白。2ml 50mM咪唑洗1次，除去杂蛋白。2ml100mM咪唑洗1次，除去杂蛋白。2ml 250mM咪唑洗4次，洗脱目的蛋白。蒸馏水封柱。
间接ELISA检测抗体
纯化后3-1E蛋白适当稀释，ELISA板每孔包被100μl。4℃过夜。每孔加入200μl PBST，洗涤5min，重复三次。每孔加入200ul 3％BSA封闭，37℃孵育2h。每孔加入200μl PBST洗涤，重复三次，每次5min。每孔加入100μl待测血清抗体(稀释度为1∶50)，37℃孵育1h。每孔加入200μl PBST，洗涤三次，每次5min。每孔加入100μl鼠抗鸡IgG抗体(1∶1000)，37℃孵育1h。每孔加入200μl PBST洗涤，重复三次，每次5min。每孔加入100μl TMB显色液显色15min。每孔加入2M硫酸终止显色。酶标仪检测OD450吸光值。
2、实验结果 
检测结果见图7。结果显示，重组菌pTX8048-3-1E/MDXEF-1第一次口服免后未检测到3-1E蛋白特异性抗体，但第二次和第三次免疫后可观察到高于其他二组的特异性抗体水平(p＜0.05)。不同小写字母表示组间差异显著(p＜0.05)。

Claims (7)

1.一株鸡源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)分离株MDXEF-1，其特征在于：其微生物保藏编号为：CCTCC No：M 2014488。
2.权利要求1所述的鸡源粪肠球菌分离株在制备抑制致病性细菌的动物饲料或饲料添加剂中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的致病性细菌包括大肠埃希氏菌，鸡白痢沙门氏菌，多杀性巴氏杆菌，单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌。
4.权利要求1所述的鸡源粪肠球菌分离株在促进动物生长中的用途。
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的动物是禽类；优选为鸡。
6.权利要求1所述的鸡源粪肠球菌分离株在作为宿主菌株表达外源蛋白中的用途。
7.权利要求1所述的鸡源粪肠球菌分离株作为饲用乳酸菌疫苗运送载体的用途。
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