CN106615622A - 一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用 - Google Patents

一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用。本发明的饲料添加剂含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQ ID NO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。实验证明，本发明的饲料添加剂可提高雏鸡日增重，降低料重比，具有促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的作用。而且相较于传统抗生素，安全、绿色、无污染、无残留，且能提高肠内有益菌的数量菌，调节肠道内菌群平衡。因此，本发明的提出为以乳酸菌为载体的抗菌肽在饲料添加剂中的应用、开发和工业化生产等方面提供了新的技术手段和理论支持。

Description

一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力 的饲料添加剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种饲料添加剂及其应用，特别涉及一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用，属于饲料研究技术领域。
背景技术
鸡白痢沙门氏菌病是由鸡白痢沙门氏菌引起的一种死亡率高，影响范围广的传染病，在自然情况下，很多品种的鸡均易感，尤其以1～2周龄以内的雏鸡发病率与病死率最高，严重危害家禽业。病鸡常出现采食量减少，瞌睡，惧冷，易靠近热源，不喜欢活动，萎靡不振等症状；同时排出白色粪便，严重的会出现肛门周围粘有粪便的糊肛情况。在正常情况下，鸡白痢沙门氏菌的宿主主要是鸡，不过也有报道显示火鸡、鹌鹑、雉鸡、麻雀等动物能够感染鸡白痢沙门氏菌。
鸡白痢可能通过死亡率高，发病率高和产蛋量减少造成全球经济损失。由鸡白痢沙门氏菌引起的疾病，不仅给家禽生产繁殖造成影响，同时也是人类食源性疾病的主要病原菌，因此防治和解决沙门氏菌污染迫在眉睫。目前，通过接种疫苗，使用抗生素和其他药物是预防鸡白痢沙门氏菌病的主要措施，但抗生素会造成病原体的耐药性和在禽类产品抗生素残留等安全性问题。而抗菌肽和益生乳酸菌作为微生态饲料添加剂已经广泛应用于饲料加工业，因其具有安全、绿色、无污染、无残留等化学特性备受人们的关注，研究与使用抗菌肽替代抗生素是养殖业生产中的发展趋势。
乳铁蛋白肽(Lfcin)是乳铁蛋白在酸性环境条件下，经胃蛋白酶作用，释放出来的一段小分子抗菌肽，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、消炎、促生长及参与免疫反应等功能。由于牛乳铁蛋白肽具有普通抗生素具有的广谱抗菌能力和抗生素所不具有的不易产生耐药性优点，还能够抑制病毒、真菌增殖和抑制肿瘤细胞生长，对真核细胞却几乎没有毒性，在目前研究范围内，是一种健康、安全、绿色的抗菌肽，并对于应用在养殖业方面，具有广泛的使用前景和巨大的市场开发潜力。
本发明发明人在前期工作中成功构建了能够表达牛乳铁蛋白肽的乳酸乳球菌重组菌株pAMJ399-LFBA/MG1363，该重组菌既有乳酸菌的益生性，又具有牛乳铁蛋白肽的生物学功能，为研究替代饲料中抗生素的可行性，将重组菌株pAMJ399-LFBA/MG1363添加到饲料中对雏鸡进行饲喂，从雏鸡的生长性能、肠道菌群的变化以及抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用等方面综合分析，以探索表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌在家禽业中的应用前景。本发明的提出为以乳酸菌为载体的抗菌肽在饲料添加剂应用、开发和工业化生产等方面提供了新的技术手段和理论支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明以牛乳铁蛋白上的17-41位(LFcin)和268-284位(LFampin)氨基酸为参考序列，优化设计这两段基因，成功构建了表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363。该重组系统既具有乳酸乳球菌益生性、安全性，还具有牛乳铁蛋白肽的抗菌、抗病毒等生物学特性；该重组菌还可以通过先天性免疫激活肠道黏膜免疫系统，却不刺激机体产生抗体。
为检测表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡生长的影响，将1日龄雏鸡随机分成4组，每组8只，实验组饲喂含有2×1013cfu/kg pAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，同时以饲喂含有pAMJ399/MG1363饲料的空载体组、饲喂含有GM17培养基饲料的组和饲喂含有抗生素的组作为对照，连续饲喂14d，测定雏鸡体重变化及饲料重量；心脏采血处死雏鸡测定免疫器官胸腺、脾和法氏囊的指数；同时收集回肠和盲肠的肠黏液，用菌落计数的方法比较各组肠道菌群差异。结果表明饲喂pAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌组与培养基和空载体对照组相比，雏鸡的日增重显著增加，料重比显著降低，提高了饲料的转化率。饲料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比，胸腺指数、脾指数和法氏囊指数均有所增加且差异极显著(P＜0.01)。回肠和盲肠肠道菌群测定结果可见，pAMJ399-LFBA/MG1363组降低了大肠杆菌、链球菌的数量，提高了乳酸杆菌和双歧杆菌的含量。以上结果表明，表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够促进雏鸡生长，改善肠道菌群和提高机体免疫。
为进一步检测重组乳酸乳球菌的抗菌活性，本发明对其抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用进行研究。将1日龄雏鸡随机分成4组，每组15只，实验组饲喂含有2×1013cfu/kgpAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，同时以饲喂含有pAMJ399/MG1363饲料的空载体组、饲喂含有GM17培养基饲料的组和饲喂含有抗生素的组作为对照，连续饲喂14d，第7d时给雏鸡灌服鸡白痢沙门氏菌1mL(3.16×1012cfu/mL)，连续观察7天，并记录临床症状和发病情况；分别于攻菌前0h和攻菌后的1d、3d、5d和7d心脏采血处死雏鸡，采集血清及盲肠黏液，通过试剂盒检测血清中总IgG和盲肠黏液中总SIgA的水平；取雏鸡盲肠扁桃体，研磨后提取RNA，qRT-PCR测定非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平；攻菌后的第7d采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏及十二指肠，HE染色观察各组织器官病变情况。结果表明饲料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363能提高血清总IgG和黏液中总SIgA免疫球蛋白水平，增强其免疫力；其中攻菌后5d和7d雏鸡血清中IgG的含量显著升高，与培养基组相比差异极显著(P＜0.01)，攻菌7d后雏鸡黏液中SIgA的含量高于培养基组，且差异极显著(P＜0.01)，与抗生素组无明显差异。对各组织器官进行HE染色后，pAMJ399-LFBA/MG1363组和抗生素组心脏、肝脏、脾脏及十二指肠病变情况明显轻于培养基组和空载体组。对非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平测定结果表明，pAMJ399-LFBA/MG1363组雏鸡感染3d时，TLR4、MyD88 mRNA相对水平显著升高；7d时有所下降，其中pAMJ399-LFBA/MG1363组TLR4 mRNA相对水平高于培养基组，差异极显著(P＜0.01)，MyD88 mRNA相对水平高于培养基组，差异显著(P＜0.05)；感染7d时，pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比，TNF-α、NF-κB、IL-8 mRNA相对水平高，TNF-αmRNA转录水平差异极显著(P＜0.01)，NF-κB、IL-8 mRNA相对水平差异性显著(P＜0.05)，IL-6mRNA相对水平差异不显著(P＞0.05)；本研究表明，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够缓解各器官病变，提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，激活先天免疫系统及信号通路，在抗鸡白痢沙门氏菌感染的过程中起到了保护作用。
以上结果表明表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中具有潜在的应用前景，能够起到促进雏鸡生长、抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQ ID NO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。
在本发明中，优选的，所述的载体为乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399。
在本发明中，优选的，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过以下方法构建得到的：
(1)根据乳酸乳球菌MG1363密码子偏嗜性，通过密码子优化设计并合成两段牛乳铁蛋白肽LFcin和LFampin的基因序列，然后通过在两段基因间添加信号肽和RBS序列，使两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中共表达，并在5’添加BglⅡ酶切位点；在3’添加SalⅠ酶切位点，将构建得到的融合基因命名为LFBA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将LFBA基因定向插入到乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399的BglⅡ以及SalⅠ酶切位点之间，得到含有LFBA基因的重组载体，命名为pAMJ399-LFBA；
(3)将pAMJ399-LFBA电转化乳酸乳球菌MG1363，构建得到分泌型表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌。
进一步的，本发明还提出了所述的饲料添加剂在促进雏鸡生长中的用途。以及所述的饲料添加剂在制备增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提出了一种具有安全、绿色、无污染、无残留特点的饲料添加剂，该饲料添加剂能够促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力，而且相较于传统抗生素，能提高肠内有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌，同时降低了大肠杆菌和链球菌的数量，很好的调节了肠道内的菌群；而传统抗生素整体上降低了各种菌群的菌落数，造成宿主出现菌群紊乱，不利于菌群的定植。
附图说明
图1为重组乳酸乳球菌表达产物的Western Blot鉴定结果；
M超低分子量蛋白标准蛋白Marker；1 pAMJ399/MG1363 TCA浓缩20倍上清；2pAMJ399-LFBA/MG1363 TCA浓缩20倍上清；
图2为pAMJ399/MG1363菌体以及pAMJ399-LFBA/MG1363菌体的免疫荧光鉴定结果；
图3为雏鸡各器官指数；
图4为肝脏中鸡白痢沙门氏菌菌落数；
图5为雏鸡肝脏病理变化(40×)；
图6为雏鸡脾脏病理变化(40×)；
图7为雏鸡心脏病理变化(40×)；
图8为雏鸡十二指肠病理变化(100×)；
图9为雏鸡总IgG抗体水平；
图10为雏鸡肠黏液中总SIgA抗体水平；
图11为盲肠中TLR4 mRNA相对水平；
图12为盲肠中MyD88 mRNA相对水平；
图13为盲肠中NF-κB mRNA相对水平；
图14为盲肠中TNF-α mRNA相对水平；
图15为盲肠中IL-8 mRNA相对水平；
图16为盲肠中IL-6 mRNA相对水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363的构建
1、重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363的构建
本实验根据乳酸乳球菌MG1363密码子偏嗜性，通过密码子优化设计并合成两段牛乳铁蛋白肽LFcin(17-41)和LFampin(268-284)的基因序列，然后通过在两段基因间添加信号肽和RBS序列，使两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中共表达，并在5’添加BglⅡ酶切位点(AGATCT)；在3’添加SalⅠ酶切位点(GTCGAC)，将构建得到的融合基因命名为LFBA(SEQID NO,1所示)，交由DNA2.0公司合成；将LFBA基因定向插入到乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399的BglⅡ以及SalⅠ酶切位点之间，经酶切以及测序鉴定，证明载体构建正确，命名为pAMJ399-LFBA。pAMJ399-LFBA经电转化构建分泌表达型重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363。
2、重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363表达产物的Western-blot的鉴定
在发酵罐中培养24h后取样，通过TCA浓缩处理上清，Tricine-SDS-PAGE结束后，经转印将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上，检测结果可见重组菌pAMJ399-LFBA/MG1363与制备的牛乳铁蛋白单克隆抗体4E10发生特异性的反应，在约4.3KDa处获得特异的反应带，表明重组乳酸乳球菌中牛乳铁蛋白肽获得表达。结果如图1：
3、菌体免疫荧光鉴定重组乳酸乳球菌的表达
通过间接免疫荧光法检测，荧光显微镜观察可知重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363菌体表面有黄绿色荧光，而对照组pAMJ399/MG1363菌体表面没有荧光，观察结果见图2，表明重组乳酸乳球菌表面表达了牛乳铁蛋白肽。
通过间接免疫荧光法和Western-blot法确定重组乳酸乳球菌在菌体和上清中都确定已经表达。
实施例2重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363在促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力中的应用
1.材料
1.1菌种与细胞
表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363由实施例1构建；沙门氏菌CVCC528株由东北农业大学动物医学学院药理实验室馈赠。鼠骨髓瘤细胞株SP2/0由本实验室冻存。
1.2实验动物
1日龄海兰白雏鸡购自哈尔滨市先锋种鸡场；SPF级4～6周龄BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。
2.重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡生长的促进作用
2.1重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡生长性能的影响
将1日龄雏鸡随机分成4组，每组8只，实验组饲喂添加2×1013cfu/kg的pAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，空载体组饲喂添加相同量pAMJ399/MG1363的饲料、GM17组饲喂添加相同量GM17培养基的饲料，抗生素组饲喂添加相同量金霉素的饲料，各组连续饲喂14d，测定雏鸡体重变化及饲料重量，结果见表1，可见重组乳酸乳球菌组与培养基组相比提高了雏鸡的平均日增重，同时降低了料重比。由此结果可见在饲料中添加表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能够提高雏鸡的生长性能。
表1雏鸡日增重、料重比
pAMJ399-LFBA/MG1363组 空载体组 抗生素组 GM17组
日增重(g) 7.29±0.18 6.77±0.12 7.25±0.16 6.64±0.25
料重比 2.82±0.09 3.19±0.05 2.91±0.06 3.39±0.13
2.2重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡器官指数的影响
处死饲喂14d的雏鸡，取出胸腺、脾脏、法氏囊进行称量，计算每组免疫器官指数的平均值。称量结果显示，饲料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363的重组乳酸乳球菌组与培养基组和空载体组相比，脾指数均有所增加且差异极显著(P＜0.01)；pAMJ399-LFBA/MG1363组与pAMJ399/MG1363空载体组相比，胸腺指数和法氏囊指数增加且差异性显著(P<0.05)，与培养基组相比差异极显著(P＜0.01)。结果见图3。
以上结果表明，在饲料中添加重组乳酸乳球菌，与培养基和空载体组相比，这些器官指数均有所增加，与抗生素的作用相似。由此可见重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对免疫器官的发育有促进作用，在一定程度上能够提高雏鸡的免疫功能。
2.3重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡肠道菌群的影响
连续饲喂14d后，心脏采血处死雏鸡并无菌采集回肠和盲肠，对其内容物中的大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌进行传统的菌落计数，可见与培养基对照组相比，在回肠和盲肠菌群分布中，重组乳酸乳球菌组均降低了大肠杆菌和链球菌的数量，同时增加了乳酸杆菌和双歧杆菌的数量。结果见表2和3。
表2回肠中菌群分布情况
大肠杆菌 乳酸杆菌 链球菌 双歧杆菌
pAMJ399-LFBA/MG1363组 2.21×104 2.86×106 1.05×104 7.56×106
空载体组 3.53×104 2.18×106 1.17×104 5.60×106
抗生素组 1.71×104 1.53×106 1.14×104 5.14×106
GM17组 4.18×104 1.89×106 1.98×104 4.66×106
表3盲肠中菌群分布情况
大肠杆菌 乳酸杆菌 链球菌 双歧杆菌
pAMJ399-LFBA/MG1363组 4.92×107 6.81×107 3.62×104 1.14×108
空载体组 1.42×108 5.14×107 6.78×104 5.17×107
抗生素组 1.31×107 4.42×107 2.14×104 5.12×107
GM17组 2.15×108 4.64×107 4.52×104 5.08×107
本实验通过对14日龄雏鸡的料重比和肠道菌群数差异对雏鸡的生长性能进行研究。由实验结果发现，添加重组菌pAMJ399-LFBA/MG1363和抗生素能显著降低料重比，提高饲料的转化率；大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌是肠道内的常见菌，通过传统菌落计数方法对雏鸡回肠和盲肠进行以上四种菌的计数，分析得出pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组和空载体组相比，能提高肠内有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌，同时降低了大肠杆菌和链球菌的数量，很好的调节了肠道内的菌群；而抗生素组整体上降低了各种菌群的菌落数，造成宿主出现菌群紊乱，不利于菌群的定植。
3.重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对抗鸡白痢沙门氏菌感染的雏鸡的作用
.3.1鸡白痢沙门氏菌感染雏鸡的致病性实验
雏鸡灌服不同浓度的鸡白痢沙门氏菌后，部分出现精神不振、绒毛松乱、两翼下垂、怕冷、昏睡、粪便呈灰白色，沾染肛门等症状，表明雏鸡感染了鸡白痢沙门氏菌。根据karber法计算雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌的半数致死量，LD50＝3.16×1012CFU/mL，结果见表4。
表4鸡白痢沙门氏菌半数致死量实验结果
组别 菌液浓度(cfu/mL) 总数量 死亡只数
1 1×1013 5 3
2 1×1012 5 2
3 1×1011 5 0
4 1×1010 5 0
5 1×109 5 0
6 对照组(生理盐水) 5 0
3.2雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌的临床症状
为进一步检测重组乳酸乳球菌的抗菌活性，本发明对其抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用进行研究。将1日龄雏鸡随机分成4组，每组15只，实验组饲喂添加2×1013cfu/kg的pAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，空载体组饲喂添加相同量pAMJ399/MG1363的饲料、GM17组饲喂添加相同量GM17培养基的饲料，抗生素组饲喂添加相同量金霉素的饲料，连续饲喂14d，第7d时给雏鸡灌服鸡白痢沙门氏菌1mL(3.16×1012cfu/mL)，连续观察7天，并记录临床症状和发病情况。
结果发现，雏鸡在感染鸡白痢沙门氏菌后，各组雏鸡陆续出现精神不振、食欲下降、怕冷、体重减轻以及不同程度腹泻等症状，表明已经发病。其中重组乳酸乳球菌组和抗生素组雏鸡症状较轻，畏冷，少食，排白色粪便；空载体组雏出现鸡闭眼昏睡，排白色稀浆样粪便症状；GM17组临床症状最为明显，羽毛干燥松乱，缩头颈，发病后期呼吸困难，排白色粪便甚至有糊肛症状，并且雏鸡发病死亡持续不断。
3.3感染后雏鸡肝脏组织沙门氏菌菌落计数
攻菌7d后，无菌取出雏鸡的肝脏研磨均匀，倍比稀释，涂布于SS琼脂平板上，每个稀释度做3个平行样，37℃温箱中培养24h后选取合适的稀释倍数进行菌落计数。从结果可见，重组乳酸乳球菌组中的沙门氏菌数低于空载体组，差异性显著(P＜0.05)；与培养基组相比，也显著低于培养基组，且差异性极显著(P＜0.01)，结果见图4。
3.4鸡白痢沙门氏菌对雏鸡各组织器官的影响
在感染鸡白痢沙门氏菌7d后处死雏鸡，剖检取出心脏、肝脏、脾脏、十二指肠，用甲醛固定做石蜡切片及HE染色以观察各组各器官病理组织学变化情况。图5肝脏切片显示，重组乳酸乳球菌组核染色均匀，形态整齐，而其余三组结缔组织中均可见不同程度的淋巴细胞浸润，抗生素组较轻；空载体组、培养基组在显微镜下能够看到肝细胞着色变淡，窦状系有少量红细胞。图6重组乳酸菌组和抗生素组脾脏白髓完整，红髓白髓界线明显，空载体和培养基组脾脏白髓中央有坏死的迹象，脾小体萎缩较严重。图7心脏切片均有一定程度的充血，少量心肌纤维断裂，但重组乳酸菌组明显症状轻于其他三组。图8十二指肠肠道切片显示重组乳酸菌组和抗生素组症状较轻，空载体和培养基组肠道间质变宽，固有层充血，部分绒毛断裂脱落到官腔，有少量炎性细胞浸润。
3.5血清总IgG和肠黏液总SIgA抗体水平的测定
雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，血清和黏液中免疫球蛋白水平能够反映其抵抗外界病原菌和病毒侵袭的能力，这些免疫球蛋白主要包括IgG、IgA和IgM，从实验结果表明，饲料中添加表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能明显提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，增强其主动免疫力。其中5日龄和7日龄雏鸡血清中IgG的含量与培养基组相比较高，且差异极显著(P＜0.01)，7日龄雏鸡黏液中SIgA的含量高于培养基组，且差异极显著(P＜0.01)，见图9和10。
这些结果可以表明，重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能够显著提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，增强机体主动免疫能力，对宿主的体液免疫和肠黏膜局部免疫具有一定的调节作用。
3.6TLR4/MyD88/NF-кB信号通路分子及细胞因子转录水平的测定
本实验中，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，为研究表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对发挥先天性免疫作用信号通路中信号分子的影响，对TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6mRNA基因相对转录水平进行了测定。
(1)本实验将培养基组攻菌1d时基因的转录水平作为参照因子，其它组及不同时间点基因的转录水平与其相比，得到相应基因转录水平的倍数，采用内参β-actin对基因进行均一化处理。从图11和12中可见，在攻菌1d、3d、7d时，pAMJ399-LFBA/MG1363组和抗生素组盲肠中MyD88-依赖信号通路基因中的TLR4、MyD88 mRNA相对水平均高于空载体组和培养基组，1d时TLR4、MyD88mRNA相对水平差异不显著；3d时，TLR4、MyD88 mRNA相对水平显著升高；7d时，相对水平有所下降，其中重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363组和抗生素组盲肠中TLR4 mRNA相对水平高于培养基且差异性极显著(P＜0.01)，MyD88基因与培养基组相比相对水平高，且差异性显著(P＜0.05)，空载体组基因相对水平与培养基组相近。
(2)为进一步比较各组之间细胞因子的差异，本实验选用培养基组感染7d时基因的转录水平作为参照因子，其他组基因的转录水平与其相比，得到相应基因转录水平的倍数，采用内参β-actin对基因进行均一化处理。盲肠中NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6mRNA相对水平分别见图13、14、15、16，其中pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比，TNF-αmRNA相对水平较高，差异性极显著(P＜0.01)，NF-κB、IL-8 mRNA相对水平也高于培养基组，差异性显著(P＜0.05)，IL-6mRNA相对水平不显著(P＞0.05)。
本研究表明，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，MyD88-依赖途径被激活，TLR4与MyD88表达趋势一致，NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6与TLR4/MyD88/NF-кB信号通路有一定的关联，由此可见，表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能够通过调节MyD88-依赖途径中信号分子和细胞因子的相对转录水平从而激活先天免疫系统，抵抗鸡白痢沙门氏菌感染。
经上述研究证实，饲喂表达本发明的牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363可提高雏鸡日增重，降低料重比，增加免疫器官指数，提高免疫能力，对雏鸡的生长具有一定的促进作用。此外，以表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363饲喂雏鸡，可以降低雏鸡感染程度，提高免疫球蛋白含量，对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染有一定的保护作用。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用
<130> KLPI161341
<160> 11
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 355
<212> DNA
<213> LFBA
<400> 1
agatctttca aatgtagacg ttggcaatgg cgtatgaaaa agcttggagc accatctatt 60
acatgtgtaa gacgagcctt ttagtaactg cagtctagat tagggtaact ttgaaaggat 120
attcctcatg aaatttaata aaaaaagagt tgcaatagcc acgtttattg ctttgatatt 180
tgtaagtttt tttacaatat catcaatcca agatgctcaa gcagccgaaa ctagtgaaca 240
aaagttgatt tcagaagaag atttatcagt tgacggcaaa gaagatttga tttggaaact 300
cttaagcaaa gctcaagaaa agtttggtaa gaacaaaagt cgctaatgag tcgac 355

Claims (5)

1.一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂，其特征在于含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQ ID NO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。
2.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于所述的载体为乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399。
3.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过以下方法构建得到的：
(1)根据乳酸乳球菌MG1363密码子偏嗜性，通过密码子优化设计并合成两段牛乳铁蛋白肽LFcin和LFampin的基因序列，然后通过在两段基因间添加信号肽和RBS序列，使两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中共表达，并在5’添加BglⅡ酶切位点；在3’添加SalⅠ酶切位点，将构建得到的融合基因命名为LFBA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将LFBA基因定向插入到乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399的BglⅡ以及SalⅠ酶切位点之间，得到含有LFBA基因的重组载体，命名为pAMJ399-LFBA；
(3)将pAMJ399-LFBA电转化乳酸乳球菌MG1363，构建得到分泌型表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌。
4.权利要求1-3任一项所述的饲料添加剂在促进雏鸡生长中的用途。
5.权利要求1-3任一项所述的饲料添加剂在制备增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料中的用途。
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