CN101314772A - 虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达和应用 - Google Patents

Abstract

本发明的提供了虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达及应用，包括虾类抗菌肽基因的克隆，虾类抗菌肽基因的重组载体的构建，抗菌肽基因重组载体的转化与筛选，发酵培养表达抗菌肽的工程菌，表达产物的鉴定、纯化。本发明还提供了重组有上述虾类抗菌肽基因的益生菌的应用，用于水产养殖的饲料，优选为虾用饲料。重组益生菌可以在机体内不断繁殖，在一定时期内持续表达并提供给机体抗菌肽，具有很好的特异性和有效性。

Description

虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达和应用

技术领域

本发明涉及生物基因重组工程，具体涉及虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达和应用。

背景技术

自20世纪40年代抗生素被批准用作饲料添加剂后，为畜牧业发展起了巨大的推动作用，但随着饲用抗生素的普及应用，其副作用逐渐突出。一是病菌产生耐药性问题；二是滥用抗生素不但加大了饲料成本，而且引起动物免疫机能下降，体内菌群失调、发生内源性感染或二重感染，死亡增多；三是畜禽产品中的药物残留问题，而且给生态环境造成毒性。为避免饲用抗生素长期使用造成全球环境污染并直接危害人类的健康，欧盟1999年1月起通过立法禁止抗生素作促生长剂使用，今后的发展趋势是尽量不使用抗生素。因此，寻求饲用抗生素的替代物已成为世界各国专家研究的热点。近年来，饲用抗生素替代品的研究主要有益生素、寡聚糖、抗菌肽等。

抗菌肽是先天性免疫的分子受动器，是生物体内诱导产生的一种具有强抗菌作用的多肽类物质，它广泛存在于多种生物体内，是生物体对外界病原物侵染而产生的一系列免疫反应的产物。抗菌肽分子量小，性能稳定，通常它们含有15-45个氨基酸残基，净电荷为正。CecroPins类型的不含半胱氨酸线性肽是最早发现的，来源于昆虫。现已发现抗菌肽、蛋白有800个以上，来源于动物、植物领域。抗菌肽具有较强的广谱抗菌能力，大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用，有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用，对某些真菌、原生动物，尤其对耐药性细菌有杀灭作用，有些甚至对原虫、肿瘤也有作用。

抗菌肽有不同于抗生素的独特抗菌机理，与酶或受体等蛋白因子无关，抗菌肽主要作用靶点是细菌的膜，通过物理化学机制使膜的通透性增大，而且杀伤过程比细菌生长的速度快，通过破坏其屏障而达到杀伤细胞的效果。

与抗生素不同，抗菌肽是生物体自身具有的物质，它不产生耐药性，也不存在毒副作用，更不存在药物残留问题。人们发现许多传统的抗生素，特别是青霉素，能够诱导耐药菌株的产生。抗菌肽具有良好的抗菌选择性和独特的抗菌模式，而且不会诱导产生耐药菌株，容易被降解，不易在微生物体内富集，因此，被认为能够成为替代抗生素的首选药物。

自1981年Steiner等首次从蚕蛹中诱导分离得到抗菌肽后，许多抗菌肽相继被分离、纯化，其氨基酸一级结构和基因序列得到确定。一般把抗菌肽分为4种类型：杀菌肽类(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainin)、蜂毒素(melittin)。虾类抗菌肽研究是近几年才开始的，目前已对凡纳对虾的阳离子抗菌肽(penaeidins家族)进行了系统地研究，至少发现5个亚类；戴斯特谬克司-卡森等又在凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)和南美白对虾(Litopenaeus stylirostris)中发现了抗真菌活性的3种阴离子抗菌肽。王金星等公开了中国对虾抗菌肽基因(Ch-penaeidin)与克隆技术(CNZL，02109931.6)，中国对虾的重组表达与应用(CN，03112294.9)。与其它种类相比，来源于鱼、虾、蟹等水生动物体内的抗菌肽杀菌作用更强，溶血效应小，种类多样化，显示出比其它种类更具优势的应用前景。

但是目前，尚未有将抗菌肽基因转入益生菌中。

益生菌是指一类活的、有益菌补充物，又称活菌制剂或微生态制剂。对益生菌的研究不断有新的发现，益生菌的定义也有不同的概念。Fuller认为“益生菌是一种活的微生物饲料添加剂，通过改善肠道的微生物平衡而有益于动物”。该定义起初用于陆生动物和人类。对水生动物而言，动物与其周围的水环境不断地进行相互作用，有证据表明，水环境中的细菌对鱼体肠道的微生物组成有影响。肠道中出现的微生物似乎是来自环境和饵料并能在肠道生存和繁殖的那些属。Gatesoupe给益生菌下的定义为“有助于增进动物健康进入其胃肠道并保存活力的微生物细胞”。而在某种程度上水环境中的微生物还可生活于养殖动物的鳃或皮肤上。Gram去掉对肠道的限制，将益生菌的定义扩展为“一种活的微生物添加剂，通过改善动物的微生物平衡而对其产生有利的影响”。水生动物往往产卵于水中，使其周围水中的细菌能在卵表面定居，而且刚孵化的幼体或新出生的动物肠道系统发育并不完全，其肠道、皮肤和鳃上没有微生物群落。由于水生幼体早期阶段的主要微生物群落部分地取决于饲育它们的水，故水中细菌的性质尤为重要。因此，erschuere等将益生菌的定义进一步扩展为“一种活的微生物添加剂，通过改善与动物相关的或其周围的微生物群落，确保增加饲料的利用或增强其营养价值，增强动物对疾病的应答或改善其周围环境的水质而有益于动物”。可以看出，益生菌的概念只是微生态环境中的生理性菌群到生态环境中微生物优势菌群的变迁。

发明内容

本发明所要解决的技术问题第一方面针对现有技术的空缺，利用克隆到的虾类抗菌肽基因，构建原核及真核益生菌的表达载体，提供虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组和表达。

本发明所要解决的技术问题第二方面在于提供了重组有上述虾类抗菌肽基因的益生菌的应用，主要是用做水产养殖的饲料，特别是虾用饲料。即将一种或多种重组益生菌菌株分别用适宜培养基培养，得到的发酵液可制备成各种剂型，如口服剂、冻干粉等，混合入虾类饲料，获得既能取代饲用抗生素、又能调节养殖水体的微生态环境的新型绿色水产养殖饲料，达到提高水质，健康养殖、稳产高产的目的。

作为本发明第一方面的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，包括虾类抗菌肽基因的克隆，虾类抗菌肽基因的重组载体的构建，抗菌肽基因重组载体的转化与筛选，发酵培养表达抗菌肽的工程菌，表达产物的鉴定、纯化。

其中，所述的重组载体的构建是：根据已克隆到的虾类抗菌肽cDNA序列，利用特异引物在其两端加入两个不同的限制性内切酶酶切位点，PCR扩增抗菌肽基因；将其克隆到益生菌表达载体上，所述的表达载体包括pPIC系列或pLA系列；

所述转化与筛选是将上述构建得到的载体分别转化获得工程菌株，筛选出所需的重组工程菌，所述的转化方式为电转法；

所述表达产物的鉴定、纯化是采用诱导剂诱导工程菌株的表达，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用超率和层析等方法纯化抗菌肽，并测定其抗菌谱。上述的诱导剂是：原核表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，真核表达的诱导剂是甲醇。

所述特异性引物包含，但不限于下列：

Pen4F    5’ATCATATGAGCAGCGGTTACACGCG 3’

Pen4R    5’CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3’

Pen5F    5’ATCATATGCGTCTCGTGGTCTGCCTG 3’

Pen5R    5’CCAAGCTTTCAACCATATGTTTGCTTTGC 3’

Pen2F    5’ATCATATGCCTGTGTCCGCCATGCGTC3’

Pen2R    5’CCAAGCTTCTTGGCAGACCAGGGCGAA 3’

上述的虾类抗菌肽是草虾抗菌肽。

用于转化益生菌的载体质粒，含有如pG+Host、pJIM2481、Tn916、Tn917、Tn919中一种转座子。

上述的构建重组载体步骤，还包括构建抗菌肽基因串联多聚体，以提高抗菌肽的表达量。

上述的益生菌为细菌、真菌和微藻等生物。其中，所述的细菌，包括如光合细菌、硝化细菌、硫化细菌、双歧杆菌、乳球菌、乳杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、链球菌。其中，乳球菌优选为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌优选为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，或米酒乳杆菌(Lactobacillussake)。

所述的真菌为酵母菌，优选为酿酒酵母。

本发明的优点与独特性在于：

1)采用益生菌自身表达载体，可以稳定高效表达外源基因。

2)所用的益生菌自身安全，不产生内外毒素，同时对机体健康有促进作用；益生菌分泌溶菌酶、过氧化氢等代谢产物，抑制有害细菌在肠黏膜的附着与繁殖，平衡动物消化道内的微生物群；益生菌协助机体消除毒素及代谢产物；刺激机体免疫系统，提高干扰素和巨噬细胞的活性，促进抗体的产生，提高免疫力和抗病能力；益生菌还能调节水产培养中的水质环境等。

3)转抗菌肽基因的益生菌可以采用活菌制剂形式，作为绿色饲料添加剂直接使用，不需经过蛋白纯化等，生产工艺简单，成本低，并起到益生菌和抗菌肽两种饲用抗生素替代品的综合效果。

4)重组益生菌可以在机体内不断繁殖，在一定时期内持续表达并提供给机体抗菌肽，具有很好的特异性和有效性。

5)转抗菌肽基因的益生菌还能以烘干粉形式加入饲料，饲料中同时含有大量抗菌肽、酵母多糖、核苷酸等多种活性成分，起到协同促进生长和增强免疫力的效果。

附图说明

图1是本发明的虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组和表达流程图。

图2是草虾RNA抽提电泳图，其中的黑色条带为提取的草虾RNA。

图3是PCR扩增目标基因PEN-4电泳图(目标基因约200bp)。

图4是pPIC-PEN4-1菌落PCR鉴定目标克隆(1阴性对照，2阳性对照3.4.5.7.8pMD-18T-PEN4-1菌落#1，#2，#3，#4，#5  6.DNA Marker)。

图5酵母菌37℃表达的PEN4-1(主要以包涵体形式存在1包涵体，2表达上清液，3诱导后，4诱导前，5蛋白Marker)。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

本发明的虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达和应用，具体是对草虾的抗菌肽基因进行克隆，并在益生菌中进行表达，获得新型的表达虾类抗菌肽的重组益生菌，并在此基础上开发新型养殖虾用绿色饲料。

具体包括如下步骤：

①利用已有的抗菌肽基因cDNA序列，利用特异性引物在其两端引入适当的酶切位点，PCR扩增抗菌肽基因；②构建带有抗菌肽基因的益生菌重组表达载体，将其克隆到益生菌表达载体上，然后转入益生菌中，获得稳定表达虾类抗菌肽基因的重组益生菌菌株；③构建抗菌肽基因串联多聚体；④将重组表达载体转入益生菌中，获得表达抗菌肽的工程菌；⑤发酵培养表达抗菌肽的工程菌；⑥纯化分离得到抗菌肽；⑦抗菌肽抗菌活性测定；⑧新型养殖虾用绿色饲料的制备。

益生菌主要包括细菌、真菌和微藻等生物。其中，所述的细菌，包括如光合细菌、硝化细菌、硫化细菌、双歧杆菌、乳球菌、乳杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、链球菌。其中，乳球菌优选为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌优选为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，或米酒乳杆菌(Lactobacillussake)。

参考南美白对虾(Litopenaeus vannamei)和Litopenaeus setiferus的penaeidin-4基因序列设计引物，在两端引入不同的限制性内切酶位点，亚克隆到克隆载体和表达载体。用于转化益生菌的载体质粒，含有下列调控因子：复制起始子、启动子、信号肽、编码虾类抗菌肽的基因序列、转录终止子。

这里通过构建含有强启动子及信号肽等元件的表达质粒，并将表达质粒中含目的基因的表达元件部分酶切、连接等方法克隆到乳酸菌等益生菌的整合质粒中，如pG+Host、pJIM2481、Tn916、Tn917、Tn919等转座子上，从而整合到益生菌染色体中，构建可持续、稳定表达抗菌肽基因的重组乳酸菌菌株。

酵母表达体系最大的优点是属于真核生物表达系统，能进行蛋白质修饰作用，而且酵母为单细胞生物，生长速度快，便于进行分子生物学操作。本发明中优选采用酿酒酵母。

在酵母中表达并分泌外源基因需下列组件：酵母识别的强启动子、信号肽序列、转录终止信号，翻译终止密码子，合适的表达框架等。本发明采用AOX1基因启动序列和转录终止序列。并插入α因子分泌信号肽和抗菌肽基因，构建可在酵母中分泌表达抗菌肽的表达载体。

含有抗菌肽基因或串联抗菌肽基因片段的相应表达载体，通过电转化的方法，分别转入酵母、双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌和芽孢杆菌等益生菌中，游离存在或整合到染色体上，得到能稳定表达具有生物学活性的抗菌肽的重组益生菌株。

实施例1

含草虾抗菌肽基因的大肠杆菌pET28a表达载体的构建

1)草虾cDNA文库的建立

取20只草虾，匀浆，用抽提液(4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5％laurylsarcosinate，0.1M巯基乙醇)提取，用胍盐-酚-氯仿法提取总RNA，构建总cDNA文库。

2)用PCR方法克隆草虾penaeidin-4基因

根据Litopenaeus vannamei和Litopenaeus setiferus的Penaeidin-4的基因序列，设计特异性引物Pen4MF1/Pen4MR1，引物两端加Nde I和Hind III酶切位点，扩增penaeidin-4基因，引物序列为：

Pen4MF1 5’ATCATATGAGCAGCGGTTACACGCG 3’

Pen4MR1 5’CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3’

PCR反应体积50ul，扩增条件：94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循环；72℃10min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测到大约的扩增产物。用胶纯化试剂盒纯化所得的产物，与T-载体pMD18T连接，获得含目的基因的克隆载体pMD-Pen4。

3)重组表达载体pET-pen4的构建与筛选

载体pET28a和pMD-Pen4分别用Nde I/Hind III 37℃酶切3h，分别回收载体和目的片段，两者于16℃连接过夜。转化E.coli DH5α，以Pen4MF/Pen4MR为引物PCR筛选阳性克隆，提取阳性菌株质粒，测序，测序正确的质粒转化E.coli BL21，筛选阳性克隆。

4)表达菌的诱导表达挑取pET-Pen4-BL21单菌落于5ml LB/Kan培养液中，37℃过夜培养，次日取1ml过夜培养物接种于100ml LB/Kan培养液中37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度1mM进行诱导，37℃继续培养5h或25℃培养过夜。5000rpm离心10min收集菌体，加入5ml TE、洗涤、重悬，并超声破碎细胞，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。用16.5％的Tricine胶分离鉴定抗菌肽Pen4的表达状况(如表达与否，在细胞中表达的位置等)。平板生长抑制法检测Pen-4活性

实施例2

含草虾抗菌肽基因的在酵母菌中的重组与表达

1)草虾cDNA文库的建立

取20只草虾，匀浆，用抽提液(4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5％laurylsarcosinate，0.1M巯基乙醇)提取，用胍盐-酚-氯仿法提取总RNA，构建总cDNA文库；

2)用PCR方法克隆草虾penaeidin-4基因

根据Litopenaeus vannamei和Litopenaeus setiferus的Penaeidin-4的基因序列，设计特异性引物Pen4MF2/Pen4MR2，引物两端加EcoR I和Not I酶切位点，扩增penaeidin-4基因，引物序列为：

Pen4MF2 5’ATGGATCCATGAGCAGCGGTTACACGCG 3’

Pen4MR2 5’CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3’

PCR反应体积50ul，扩增条件：94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循环；72℃10min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测到大约的扩增产物。用胶纯化试剂盒纯化所得的产物，与T-载体pMD18T连接，获得含目的基因的克隆载体pMD-Pen4-2。

3)重组表达载体pPIC-pen4的构建与筛选

载体pPIC9K和pMD-Pen4分别用EcoR INot I 37℃酶切3h以上，分别回收载体和目的片段，两者于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的固体LB培养的平皿中37℃倒置培养过夜。以Pen4MF2/Pen4MR2为引物，经菌落PCR筛选阳性克隆。扩大培养，提取阳性重组质粒pPIC-pen4，测序验证重组质粒中Penaeidin-4的基因序列的正确性。

4)Penaeidin-4基因的酵母工程菌的筛选

将测序正确的质粒pPIC-pen4和pPIC9K空质粒分别用Sal I酶切、酚-酚/氯仿-氯仿三步抽提去除蛋白，乙醇沉淀，电转化酵母GS 115感受态细胞。涂布在不含His的MD平皿上，收集长出的His+菌落，再在含有不同浓度G418的YPD梯度平皿中进行梯度筛选。挑去单菌落溶于10ul水中，沸水浴煮5min，冰浴5min，在煮5分钟。室温下离心，取2ul为模板，PCR鉴定。上游引物为载体上5’-AOX1 primer，下游引物为Penaeidin-4的基因引物Pen4MR2，得到的阳性克隆进行下一步的表达研究。

5)Penaeidin-4基因的酵母工程菌的诱导表达

分取pPIC-pen4/GS 115、pPIC9K/GS115单克隆菌接种于5ml YPD液体培养基中，28℃200-250rpm培养24h后，将菌液转接到BMGY中放大培养，28℃200-250rpm培养至OD＝2-6，5000rpm离心取沉淀(菌体)，换用1/5体积含0.5％甲醇的BMMY诱导表达。每个24h取5ml菌液，12000rpm离心收集上清，-20℃保存，并补加甲醇至终浓度0.5％继续诱导，一直诱导4-6天。每天所得的上清液浓缩、透析后用16.5％的Tricine胶分离鉴定。

6)表达产物的抗菌活性测定

将处于对数生长期的大肠杆菌DH5α悬浮液(OD＝0.2-0.4)20ul与固体培养基PBM(poor broth medium：1％agar，1％trypton，0.5％NaCl)15ml在50℃左右混合均匀，倒入预先摆好小铁环的无菌培养皿中，待其凝固后，取出小铁环，于孔中加入待测样品液，37℃倒置培养过夜，观察形成的抑菌圈情况。

实施例3

含草虾抗菌肽基因在乳酸菌中的重组与表达

用以pMD-Pen4位模板，两端分别为Sac I和Kpn I酶切位点的penaeidin-4基因特异引物Pen4MF3/Pen4MR3，PCR扩增penaeidin-4基因。

引物序列为：

Pen4MF3 5’ATGAGCTCATGAGCAGCGGTTACACGCG 3’

Pen4MR3 5’CCGGTACCCTATCCTCTGTGACAACA 3’

PCR反应体积50ul，扩增条件：94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循环；72℃10min。

经2％琼脂糖凝胶电泳检测到大约的扩增产物。用胶纯化试剂盒纯化所得的产物，与T-载体pMD18T连接，获得含目的基因的克隆载体pMD-Pen4-3。

采用Kpn I/Sac I双酶切pMD-Pen4-3及乳酸菌表达质粒pMG36e，利用胶回收试剂盒分别回收目标基因片段和载体片段，按片段∶载体＝3∶1的比例用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。

取2ul连接产物用电穿孔法转化乳酸乳球菌LMO230，脉冲参数为1.25KV/cm，25uF和200Ω。恢复培养基用SGM17MC。对初步筛选的阳性菌进行质粒抽提，PCR和测序鉴定。

将鉴定为阳性的重组质粒载体在乳酸菌中表达，接种于MG17中，30℃培养过夜，收集菌体，加等量上样缓冲液100℃作用10min，离心后取上清用16.5％的Tricine胶分离鉴定。

实施例4

将实施例1-3的表达产物制备成冻干粉，用做水产养殖的饲料，特别是虾用饲料。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1、虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，包括虾类抗菌肽基因的克隆，虾类抗菌肽基因的重组载体的构建，抗菌肽基因重组载体的转化与筛选，发酵培养表达抗菌肽的工程菌，表达产物的鉴定、纯化；其中：

所述的重组载体的构建是：根据已克隆到的虾类抗菌肽cDNA序列，利用特异引物在其两端加入两个不同的限制性内切酶的酶切位点，PCR扩增抗菌肽基因；将其克隆到益生菌表达载体上，所述的表达载体包括pPIC系列或pLA系列；

所述的转化与筛选是将上述构建得到的载体分别转化获得工程菌株，筛选出所需的重组工程菌；

所述的表达产物的鉴定、纯化是采用诱导剂诱导工程菌株，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用超滤、层析等方法纯化抗菌肽，并测定其抗菌谱。

2、如权利要求1所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，上述的虾类抗菌肽是草虾抗菌肽。

3、如权利要求1或2所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，用于转化益生菌的载体质粒，含有如pG+Host、pJIM2481、Tn916、Tn917、Tn919中一种转座子。

4、如权利要求3所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，上述的构建重组载体步骤，还包括构建抗菌肽基因串联多聚体。

5、如权利要求1所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，所述的益生菌为细菌、真菌和微藻。

6、如权利要求5所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，所述的细菌，包括如光合细菌、硝化细菌、硫化细菌、双歧杆菌、乳球菌、乳杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、链球菌。

7、如权利要求6所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，乳球菌优选为乳酸乳球菌，乳杆菌优选为干酪乳杆菌，或米酒乳杆菌；所述的真菌为酵母菌。

8、如权利要求7所述的虾类抗菌肽在益生菌中的重组表达，其特征在于，所述的酵母菌优选为酿酒酵母。

9、如权利要求1-8任一项所述的虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达产物用于水产养殖业饲料。

10、如权利要求1-8任一项所述的虾类抗菌肽基因在益生菌中的重组表达产物用于虾类的养殖饲料。

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