CN103289944A

CN103289944A - 一种分泌抗菌肽的乳酸链球菌基因工程制备方法与应用

Info

Publication number: CN103289944A
Application number: CN2012100516548A
Authority: CN
Inventors: 张捷; 郑文官; 潘韵; 彭永鹤; 李永新
Original assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-03-01
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明提供一种分泌抗菌肽的益生菌的基因工程制备方法。本发明所应用的益生菌为乳酸链球菌L.lactis subsp.cremoris MG1363。本发明实例引用的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05具有序列表中SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。本发明益生菌与其表达的抗菌肽具有联合免疫效应，应用于制备保健类产品，如相关饲料添加剂、食品、医药产品等。

Description

一种分泌抗菌肽的乳酸链球菌基因工程制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组抗菌肽，其基因工程乳酸链球菌的制备和应用。

背景技术

由于人类对抗生素的过度滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，不断困扰着畜牧养殖业并引发食品安全问题。

抗菌肽是生物体内在防御外源病原体入侵时产生的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除具有广谱抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤细胞作用和免疫调节作用，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域具有广泛的应用前景。抗菌肽作用机制独特，不易产生耐药菌，被认为是传统抗生素替代品。

目前，国内外宣传的抗菌肽制备方式多种多样，有人用利用大肠杆菌、病毒、酵母、植物细胞、昆虫和哺乳动物细胞等重组表达系统来表达抗菌肽(专利ZL96100376.6和专利ZL200810132258.1；天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究，黄亚东，中国抗生素杂志，28：304-307，2003)。这些表达系统本身也有不足：抗菌肽自身对病原菌具有抑制和杀灭作用，这就难以用原核生物中的大肠杆菌做为表达系统；使用病毒表达系统存在实验步骤繁琐，条件不易控制；抗菌肽对真核细胞没有抑制作用，但多细胞真核表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。这些都很难实现大规模的工业生产。酵母表达系统作为单细胞真核表达系统，遗传背景清楚，被应用于工业生产，常被应用的酵母有毕赤酵母和酿酒酵母。

但是，毕赤酵母并不是常见的食用菌，这就限制了其广泛的应用；酿酒酵母是食用菌，但不是动物机体内的天然益生菌群，而乳酸菌在自然界和人畜消化系统中广泛存在，目前发现200多种，其中绝大部分都存在于人体及动物的肠道，是机体必不可少且具有重要生理功能的菌群。市面上也不缺乏动物用乳酸菌制品，它们主要的功用在于促进免疫调节，增强机体对肠道感染的抵抗能力，减少腹泻。

总之，制备分泌其他物种来源的抗菌肽的乳酸链球菌，不仅可以得到高效的抗肿瘤、抗炎症、调节免疫功能的保健型产品，而且能够达到绿色无残留，安全可靠的标准，易应用于大规模生产，并可以从源头上解决滥用抗生素给养殖业、生态环境和人类健康带来的严峻问题，有效解决当前抗生素引起的食品安全和污染问题

发明内容

本发明旨在提供一种分泌抗菌肽的基因工程乳酸链球菌的制备方法，该方法获得的乳酸菌与抗菌肽复合产品，成本低，具有高效活性，易于实现产业化。

本发明所述的一种分泌抗菌肽的基因工程乳酸链球菌的制备方法，其操作步骤为：

1)：抗菌肽的基因扩增

设计合成上下游引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点，以AMP的重组质粒为模板，通过PCR扩增，获得抗菌肽基因片段；或者直接合成已知的抗菌肽cDNA序列，再通过PCR扩增获得抗菌肽基因片段；再或者从生物组织或细胞中提取RNA进行RT-PCR扩增获得抗菌肽基因片段。

2)：抗菌肽的基因克隆和测定

将抗菌肽基因扩增后，回收PCR产物，用T4连接酶与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经抗性培养基筛选、测序后，获得最终获得阳性重组质粒pMD18-T：AMP。

3)：乳酸链球菌表达载体的构建和转化

扩大培养阳性转化子并抽提重组pMD18-T：AMP质粒，分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和乳酸链球菌穿梭质粒pAR1411。回收酶切产物，用T₄DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pAR1411：AMP，用电转的方法转入乳酸链球菌L.lactis subsp.cremoris MG1363，通过抗性培养基(GM17+0.5M琼脂，红霉素)筛选阳性转化子MG1363/AMP。

其表达框为P32-AMP-TT，其中P32为启动子，TT是终止子。

4)：重组乳酸链球菌工程菌扩大培养和抗菌肽的鉴定

将筛选的阳性转化子MG1363/AMP，在GM17液体培养基中扩大培养，24-48h后，收集菌液，离心取上清，浓缩，然后Tricine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽蛋白的表达情况；并且进行抗菌肽的抗菌活性测定。

本发明的有益效果在于：

1.本发明所采用的表达系统安全，表达量高，稳定性好。表达的抗菌肽为组成型分泌表达，细胞培养过程无需额外添加有毒诱导剂，绿色安全；

2.本发明所构建的可以分泌抗菌肽的基因工程乳酸链球菌，同时具备益生菌和抗菌肽的双重功效，即可以联合免疫调节、抗炎等；

3.通过本发明基因工程方法生产的分泌抗菌肽的乳酸链球菌，整体发酵产物即为有效成分，不需要分离纯化步骤，降低了生产成本，适于大规模生产；

4.本发明制得的分泌抗菌肽的乳酸链球菌，可用于生产保健类产品，如饲料添加剂，可以调节动物免疫力、改善消化道微生物系统、提供营养因子、提高动物的生产性能；还可用于食品、医药产品等。

附图说明

图1：乳酸链球菌重组表达质粒pAR1411-Pa-AMP05的构建图；

图2：阳性克隆鉴定结果图；M：DNAMarker(DL2000)；1，阳性对照；2，pAR1411：Pa-AMP05；

图3：工程菌表达多肽电泳图；M，低分子量蛋白Marker；1，重组菌MG1363/AMP表达产物；2，空载体菌MG1363/pAR1411表达产物；

图4：抗菌肽抑菌活性测定；1，pAR1411发酵上清液；2，pAR1411：Pa-AMP05发酵上清液；3，氨苄青霉素钠(100μg/mL)4，灭菌水。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例证，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，以下的实施例可使本领域的专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例证

1.抗菌肽Pa-AMP05基因的获得

人工合成上下游引物，分别在引物5’端引入XbaI和HindIII酶切位点，上游引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述序列。以重组质粒pPICZ/Pa：AMP05为模板(参见ZL200810065860.8)，通过PCR扩增，获得美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因片段；

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：94℃5min一个循环；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30个循环；72℃10min一个循环；扩增出美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因。

2.抗菌肽Pa-AMP05基因克隆和鉴定：

将PCR产物连入T载体，反应总体系为10μl。其中T载体(PMD18-T Simple Vector)0.5μl，Solution I 5μl，PCR回收产物4.5μl，4℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5A感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性单菌落进行菌体PCR验证。将鉴定正确的阳性克隆进行核酸序列测序，验证抗菌肽基因序列的正确性。

3.乳酸链球菌表达载体的构建和转化

1)乳酸链球菌表达载体的构建

将阳性重组质粒PMD18-T：Pa-AMP05和乳酸链球菌穿梭质粒pAR1411用XbaI和HindIII进行酶切。以下为双酶切反应体系。

将双酶切后的产物进行回收，抗菌肽基因与载体按5～10∶1的摩尔量混合，并加入1ul的T4DNA连接酶和2μl的10×连接缓冲液，16℃水浴中连接反应过夜，构建重组质粒pAR1411：Pa-AMP05。

2)重组表达质粒的转化和鉴定

将50μl乳酸链球菌细胞感受态与5～10μl重组质粒(约10ng)混合均匀，转移至0.2厘米的电转杯中；电击转化(Eppenforf细胞融合仪，2500V，5MS；)，然后加入1ml冰冷恢复培养基，冰上放置10分钟，于30℃培养箱中培养2h；将培养液涂布于筛选培养基(GM17+0.5M琼脂，红霉素)中，30℃培养至单菌落出现。挑取阳性克隆进行培养，提取质粒进行双酶切及PCR鉴定阳性转化子MG1363/Pa-AMP05。

4.重组乳酸链球菌工程菌扩大培养和抗菌肽的鉴定

1)重组乳酸链球菌工程菌扩大培养：

将筛选的阳性转化子MG1363/Pa-AMP05，在GM17液体培养基中扩大培养，24-48h后，收集菌液，离心取上清，并在旋转干燥设备中进行浓缩。

2)抗菌肽的鉴定：

I Tricine-SDS-PAGE鉴定表达的抗菌肽：

①样品的处理：

2×样品缓冲液配方

0.5mol/LTris·HCLpH6.8 2ml

甘油 2ml

20％SDS 2ml

0.1％溴酚蓝 0.5ml

β-巯基乙醇 1.0ml

待测样品用蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，取相应体积，与2x样品缓冲液按1∶1的比例混匀，100℃水浴5min，取出4℃放置，待电泳检测。

②SDS-PAGE的胶配方及步骤：

a.胶的配制

b.用Bio-Rad mini电泳装置进行电泳，30V，电泳1hr，100V至电泳结束；

c.固定，染色及脱色：小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散，因此电泳结束后，有时需要固定20min(固定液：0.5，戊二醛，30％，乙醇)，再进行染色20-30min(染色液：50％，甲醇，10％乙醇，0.2％G-250)，在脱色液(45％甲醇，10％冰醋酸)脱色20-30min，脱色完毕，把胶放在水中或10％甘油中。

II抑菌圈实验分析

采用琼脂扩散法，以抗生素为阳性对照，空载体乳酸菌发酵产物上清液和灭菌水为阴性对照。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.分泌抗菌肽(AMP)的乳酸链球菌以及产物的制备方法，其特征在于其操作步骤为：

(1)抗菌肽的基因扩增；

(2)抗菌肽的基因克隆和测定；

(3)乳酸链球菌表达载体的构建和转化：

(4)重组乳酸链球菌工程菌扩大培养和抗菌肽的鉴定。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在乳酸链球菌表达载体的多克隆位点间插入抗菌肽基因，其表达框为P32-AMP-TT，其中P32为启动子，TT是终止子。

3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(1)中，设计合成上下游引物，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点，以AMP的重组质粒为模板，通过PCR扩增，获得抗菌肽基因片段；或者直接合成已知的抗菌肽cDNA序列，再通过PCR扩增获得抗菌肽基因片段；再或者从生物组织或细胞中提取RNA进行RT-PCR扩增获得抗菌肽基因片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中抗菌肽的克隆和测定包括以下步骤：将抗菌肽基因扩增后，回收PCR产物，用T4连接酶与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经抗性培养基筛选、测序后，最终获得阳性重组质粒pMD18-T：AMP。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中构建和转化的步骤为：扩大培养阳性转化子并抽提重组pMD18-T：AMP质粒，分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和乳酸链球菌穿梭质粒pAR1411，回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pAR1411：AMP，用电转的方法转入乳酸链球菌L.lactis subsp.cremorisMG1363，获得阳性转化子MG1363/AMP，通过抗性培养基(GM17+0.5M琼脂，红霉素)筛选阳性转化子MG1363/AMP。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中工程菌的扩大培养和表达产物鉴定，具体步骤为：将筛选的阳性转化子MG1363/AMP，在GM17液体培养基中扩大培养，24-48h后，收集菌液，离心取上清，浓缩，然后Tricine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽蛋白的表达情况；并且进行抗菌肽的抗菌活性测定。

7.权利要求4～7任选-项的方法在生产制备饲料添加剂、食品、医药产品中的应用。