CN104099280A - 一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术应用领域，具体涉及一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用。本发明从禽源分离筛选的对养殖动物常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDRaBS1，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏编号为CCTCC NO：M2011034。生物功能验证表明该菌株具有抗逆性强和抗应激等特点，可用于制备抗畜禽应激的微生物制剂，其中的制剂包括畜禽饲用微生物添加剂。本发明还公开了该枯草芽孢杆菌HDRaBS1的分离鉴定方法及其在畜禽用单菌剂制备中的应用。

Description

一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用

技术领域

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用，本发明涉及一株益生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的分离鉴定及其作为制备缓解畜禽应激的饲料添加剂的应用。

背景技术

随着科学技术的发展，抗生素以抗病、促生长的功能在畜牧生产业得以广泛应用，给养殖业带来的利益毋庸置疑。不过近些来，抗生素的滥用给养殖业及人类带来了危害也开始凸显：诸如导致动物免疫机能低下、动物内源性感染和大量耐药菌株的产生，并且耐药菌的耐药基因可向人类致病菌和食源性病原菌转移，从而对畜产品及至人类健康产生严重的影响(石现瑞等2000)。因此，饲用抗生素添加剂的禁用已是国际趋势。

由于现代集约化养殖方式的推广，使得因生产环境、饲养管理、运输及病原菌的感染等因素引起的应激时常发生。因此，饲养畜禽因应激而导致的疾病就十分常见。然而，在众多应激因素中，环境温度是最重要的因素之一。我国是受全球气候变暖影响最显著的国家之一，故因高温引起畜禽的应激问题就显得尤为重要。而本发明考虑到禽类由于体温高、代谢旺盛、皮肤无汗腺、羽毛丰厚等生理特征，遭受高温影响较突出，故选蛋鸡为应用载体。目前许多研究表明：高温显著降低家禽的产蛋数，同时显著影响家禽肉、蛋品质(Nardone et al2010)。刘陆军等(2010)表明蛋鸡适宜的外界温度是18～24℃，当温度在25～30℃时，环境温度每升高1℃，产蛋率下降1.5％；温度高于30℃时，下降更为明显。St-Pierre等(2003)估计美国每年由于热应激造成的家禽生产损失超过1亿美元。由于我国华东、华南、华中以及西南的四川等地区夏季平均气温普遍较高，而这些地区禽蛋产量占全国总产蛋量的61.2％，产量高达1678.2万吨(中国农业年鉴2010)，而气温升高时鸡易产生热应激反应，导致生产性能下降，甚至热休克死亡，已对我国禽蛋业造成巨大的经济损失。

基于以上事实，本专利申请拟以蛋鸡热应激为一个出发点，寻找一种无毒、无残留、应用效果好的饲料添加剂来缓解畜禽的应激。2010年，农业部发布了新公告，明确规定用于养殖动物的饲用微生物添加剂的种类有34种，而枯草芽孢杆菌位列其中。

芽胞杆菌现已被广泛应用医药及饲料行业，但作为其使用及推广仍存在一定的问题。问题的关键是：益生菌的选育大多是通过体外试验完成的，这与在动物体内复杂的真实情况来评估益生菌的效果有所差异。因此，本发明根据菌株的特性选择合适的添加剂量，在动物试验基础上结合现代分子生物学技术，建立一套完善的评估方法，为该菌株的推广应用提供科学支撑。

发明内容

本发明的目的在于选育一株具有较好抑菌效果的动物源性枯草芽孢杆菌菌株，将其用于缓解畜禽应激，减少由于畜禽应激造成的经济损失。

本发明的技术方案如下：

本发明根据枯草芽孢杆菌的生理生化及遗传学特性，结合现代分子生物学技术，从家禽直肠内容物中，选育出一株禽源枯草芽孢杆菌，申请人将其命名为枯草芽孢杆菌HDRaBS1Bacillus subtilis HDRaBS1，于2011年1月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2011034。

枯草芽孢杆菌HDRaBS1的菌学特征：

该菌株为革兰氏阳性菌，在LB培养基上菌落呈现典型芽胞的菌落特性：白色，边缘不整齐，菌落中间形成明显皱褶。经革兰氏染色镜检观察，细菌在12h时呈长杆状，单个、成对或链状排列，24h时已明显形成芽胞。菌株能耐受2-8％NaCl、pH2.0的生长环境；可在37℃生长、90℃耐受15min、厌氧环境下不生长、硝酸盐试验为阳性，能水解葡萄糖、阿拉伯糖等，说明该菌株在表型上初步鉴定为枯草芽孢杆菌；并进一步对其16SrRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行BLAST比较，发现其16SrRNA与枯草芽孢杆菌(GU258545.1)的序列同源性最高，相似性为99％(见序列表SEQ ID NO：1)。另外，从该菌基因组中扩增出枯草芽孢杆菌特异性片段rpoA(256bp)。该菌株对常见肠道致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果，能产生芽胞，抗逆性强。

申请人将该枯草芽孢杆菌HDRaBS1进行缓解畜禽应激试验，以蛋鸡热应激为切入点，通过蛋鸡的生产性能、血液指标、热休克蛋白的测定、优势菌群分析和肠道屏障功能等综合评价，证实该菌株具有较强的抗应激作用。

根据上述枯草芽孢杆菌HDRaBS1进行缓解畜禽应激实验的作用，该菌株可以作为制备缓解畜禽应激的单菌剂应用，其中的应用包括在饲料添加剂中的应用。

本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有如下优点：

(1)本发明分离的枯草芽孢杆菌HDRaBS1菌株来源于家禽肠道，从大量候选菌株中分离和筛选得到，对常见肠道致病菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌)具有明显的抑菌效果，该菌株能产生芽胞，抗逆性强。

(2)该菌株能显著提高蛋鸡的生产性能、显著增强抗体效价，且降低IL-1和内毒素含量，能有效缓解畜禽的应激。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离株枯草芽孢杆菌HDRaBS1的16SrDNA基因部分序列。图1是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌HDRaBS1在LB琼脂平板上的生长状态：图中显示为白色且圆形菌落，边缘不整齐，菌落中间形成明显皱褶。

图2：是本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌菌株HDRaBS1在12、24h革兰氏染色结果(×1000)，其中图2A是12h革兰氏染色结果，图2B是24h革兰氏染色结果。

图3：是分离的枯草芽孢杆菌菌株HDRaBS116SrRNA基因PCR扩增检测结果。图中标记说明：M:DL2000DNA分子量标准；泳道1-3为本发明的菌株HDRaBS1：泳道4为阴性对照。

图4：是rpoA基因PCR扩增检测结果。图中标记说明：M:DL2000DNA分子量标准泳道1为本发明的菌株HDRaBS1：泳道2为地衣芽胞杆菌：泳道3为凝结芽胞杆菌：泳道4为蜡样芽胞杆菌：泳道5为大肠杆菌：泳道6为屎肠球菌：泳道7为阴性对照。

图5：是本发明菌株HDRaBS1发酵上清液对常见肠道致病菌的体外抑菌性试验。图中标记说明：A-对金黄色葡萄球菌的体外抑菌性试验；B-对大肠杆菌的体外抑菌性试验；C-对沙门氏菌的体外抑菌性试验。

图6：是本发明菌株HDRaBS1在0、10、20d时对热应激蛋鸡回肠绒毛结构的影响。图6A为0d时；图6B为10d时；图6C为20d时，本发明菌株对热应激蛋鸡回肠绒毛结构的影响。

图7：是本发明菌株在0、10、20d时对热应激蛋鸡盲肠绒毛结构的影响。其中：图7A为0d、图7B为10d时；图7C为20d时本发明菌株对热应激蛋鸡盲肠绒毛结构的影响。

具体实施方案

实施例1：菌株的分离和鉴定

一、菌株的分离

采集湖北省某鸡场鸡的直肠内容物0.5g于50ml无菌水中，80℃水浴处理15min，选取合适稀释倍数的菌液涂布LB培养基，37℃培养24h后挑取典型芽胞菌落在LB平板上划线纯培养，从大量候选菌株中分离出一株菌落呈圆形、白色或微带黄色、边缘不整齐、叶状不透明、菌落中间形成明显皱褶的菌株。经革兰氏染色镜检观察，革兰氏阳性菌，12h呈长杆状，单个、成对或链状排列；24h时已形成芽胞，芽胞中生或近中生，将该菌株命名为HDRaBS1，纯培养菌株，均传代保存。该菌株在LB琼脂培养基上的生长特性见图1，革兰氏染色特性见图2-A、2-B。

二、生理生化试验初步鉴定

通过生理生化试验对该菌株进行鉴定。将鉴定结果(见表1)与常用的《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》对芽胞杆菌属间鉴别描述的比对，初步判定该菌株HDRaBS1为枯草芽孢杆菌。

相关鉴定结果如表1。

表1 枯草芽孢杆菌株HDRaBS1生化鉴定结果

表1说明：“+”表示反应阳性，“－”表示反应阴性。

三、菌株种的确证

在上述鉴定的基础上，进一步在分子水平上对本发明的菌株HDRaBS1用常用的16SrRNA基因序列测定法进行比较分析，具体步骤如下：

(一)取1mL本发明分离的枯草芽孢杆菌株HDRaBS1纯培养物，采用常用的SDS碱裂解法提取细菌总DNA(按常规方法)，-20℃贮存备用。

(二)16S rRNA基因序列的引物设计：

参照已发表的枯草芽孢杆菌16SrRNA基因序列，应用Primer5.0分析软件设计引物进行PCR鉴定，该引物对的DNA序列如下：

正向引物F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

反向引物R：5'-AAGGAGGTGATCCACCC-3'

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物为1542bp，片段大小与预期相符(见图3)。PCR产物纯化回收后连接到pMD18-T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，转化DH5α感受态细胞，涂于含Amp的琼脂平皿上进行筛选。对于鉴定好的阳性菌液送至擎科生物技术有限公司测序。将测序结果与NCBI数据库中进行BLAST比对。检索发现，本发明分离的HDRaBS1的16SrRNA与报道的枯草芽孢杆菌(GU258545.1)的序列同源性最高，相似性为99％。扩增的部分16SrRNA基因序列见序列表SEQ ID NO：1所示。

(三)种特异性基因鉴定

枯草芽孢杆菌的种特异性片段为rpoA，编码RNA聚合酶的α亚单位基因(曹凤明2007)。以枯草芽孢杆菌的基因组为模板，设计特异性引物，扩增种特异性片段。

扩增rpoA片段的引物的DNA序列如下所示：

正向引物F：5'-CGTAGAGCCACTTGAGCG-3'

反向引物R：5'-CTGCCGTTACAGTTCCTT-3'

并将此特异引物在NCBI上用BLAST软件比对，结果与引物100％同源的序列均为本种或本群菌株，与其他种群的菌株无显著同源性。PCR程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环后72℃延伸7min。结果显示，本发明的菌株HDRaBS1能扩增出枯草芽孢杆菌的特异性片段rpoA，而其它菌株均扩增不出该片段(见图4)。因此，确证该菌株HDRaBS1为枯草芽孢杆菌。

实施例2：菌株的抑菌性能验证

制备本发明菌株HDRaBS1的发酵上清液，对肠道常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌同时进行抑菌性试验。试验表明本发明菌株HDRaBS1的抑菌效果在所筛选的菌株中效果最好，结果见图5和表2。

表2 枯草芽孢杆菌株HDRaBS1发酵上清液体外抑菌试验

表2的说明：：抑菌圈直径>20mm为敏感++；20mm-15mm为较敏感+；0mm为不敏感。

实施例3：蛋鸡热应激饲喂试验

将枯草芽孢杆菌株HDRaBS1作为菌剂饲喂受热应激明显的大规模动物群体，目的是在体内水平上验证本发明菌株的抗应激特性。

一、试验分组情况

动物试验选取868只280日龄产蛋率相近海兰褐商品蛋鸡，分为3个组，每组3个重复，试验期为21d，其中基础日粮为常规配方(W.Deng et al2012)，具体饲喂试验分组处理见表3：

表3 饲喂试验分组处理

二、试验过程

饲喂试验的时间为蛋鸡产蛋阶段，具体从280日龄开始到300日龄结束，试验期为21d。试验期间鸡群均自由饮水，每天喂料2次如表3处理成分(为上午8:30，下午17:00)，并在试验前10天、试验开始后15天均对鸡群肌肉注射新城疫弱毒苗(La Sota Strain)进行免疫。三、测定指标

(一)生长性能测定

生产性能指标包括产蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比、腹泻率、破损率和死亡率。

产蛋率、破损率和平均蛋重：定点在下午16:00对试验各组收蛋称重，计算产蛋率、破损率和平均蛋重；

日采食量：记录每天饲料实际消耗量，计算平均日采食量；

料蛋比(即饲料转化率)：日采食量/平均蛋重；

腹泻率：腹泻的评判标准(Lu Zhang et al2010)，①不成形、液体，稀水样判为腹泻；②成形、软粪判为正常。于试验0、10、20d时，定时观察，并统计鸡群腹泻个体，则腹泻率(％)＝某组腹泻鸡数/某组总鸡数；

死亡率：死亡率(％)＝试验期内某组死亡只数/试验期内某组鸡总只数。

(二)血液指标测定

血液指标包括特异性新城疫抗体、促炎症因子IL-1、抗炎症因子IL-10(Grompone G et al2012)、内毒素、孕酮(Pg)和肾上腺素(EPI)等(W.Deng et al2012)。

试验0、10、20天时，各组随机采取9只鸡的血液，每只鸡翅下采血约3-4ml，迅速装于真空促凝管中，倾斜静置于37℃恒温箱1h后，4℃放置2h，4℃3000r/min离心15min，吸取血清组内混合分装，置于-20℃保存，用相应试剂盒对特异性抗体、细胞因子和激素等指标测定。

(三)热休克蛋白(HSPs)的测定

热休克蛋白(HSPs)是当生物体遇到不良环境如冷处理、营养缺乏、高温、缺氧和氧化剂等均引起体内应激反应增强而产生的一种特殊的蛋白质，其表达量的升高，能防止机体受到损伤，从而间接地反应出机体遭受应激的程度。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的一族(王晓亮2010)，本发明通过对HSP70的表达分析，验证HDRaBS1菌株对蛋鸡热应激的缓解作用。

试验0、10、20天时，每组随机采集9只鸡的肝脏组织(约0.1g左右)，浸入提前准备好的sample protector(防止RNA的降解)，液氮研磨组织，吸取1ml TRIzol试剂充分溶解提取RNA，具体步骤如下：

(1)加入0.2ml氯仿，用力甩15s，静置2-3min；

(2)4℃离心，12000g15min；

(3)取上清，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(4)4℃离心，12000g10min，弃上清；

(5)加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g5min，弃上清；

(6)晾5-10分钟，加入适量的DEPC H₂O溶解，-80保存。

将提取的RNA用NanoDrop2000核酸浓度测定仪测定纯度A260/A280＝1.9-2.1之间，浓度均符合要求，然后进行反转录，按照Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)说明书完成。将cDNA为模板，利用相对定量检测肝组织中HSP70的表达量。引物设计采用定量专用软件Primer Express完成。具体引物的DNA序列见表4：

表4 RT-PCR引物序列和产物大小

检测HSP70基因荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性3min，接着40个循环，95℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸10s，溶解曲线从65℃逐步升到95℃。荧光定量PCR体系的最终体积控制在20μl。

(四)肠道优势菌群分析

试验0、10、20天时，每组随机采集9只鸡的回、盲肠内容物，为减少个体差异将组内分别混合，置4℃冰箱备用，用于细菌总DNA的提取(细菌总DNA的提取为常规方法)，并采用核酸浓度测定仪NanoDrop2000测定总DNA浓度，置-20℃保存备用。

分别将媒介测试菌株乳酸杆菌(例如编号为ATCC，华中农业大学动物科技学院实验室保存，但不限于此菌)、大肠杆菌(例如编号为O_78，一株禽源临床分离株，但不限于此菌)等单菌扩增培养，取上述所述菌株1ml单菌菌液分别提取基因组DNA(基因组DNA的提取方法为常规方法)，通过参考文献(如H.Sun et al2012)细菌特异性引物(见表5)分别扩增乳酸杆菌和大肠杆菌特异性片段328bp和458bp，切胶回收连T载转化挑取单菌落，测序鉴定正确。提取质粒，测其OD值，根据质粒拷贝数计算公式{6.02×10²³(拷贝数/摩尔数)×浓度(ng/μL)×10^-9/MW(g/mol)＝copies/μL}计算出每微升洗脱液中重组质粒的拷贝数，然后连续10倍的稀释，使含有大肠杆菌和乳酸杆菌目的片段的重组质粒的拷贝数在10⁹-10³拷贝数/μL之间。构建的标准曲线：E＝0.9-1.2，R²≥0.99，说明标准曲线构建成功。

表5 RT-PCR引物序列和产物大小

检测乳酸杆菌的荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性30s，接着40个循环，95℃变性5s，56℃退火20s，72℃延伸30s。检测大肠杆菌数量的荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性30s，接着40个循环，95℃变性5s，59℃退火20s，72℃延伸30s。每次荧光定量PCR循环结束后溶解曲线从65℃逐步升到95℃。荧光定量PCR体系的最终体积控制在20μl。

(五)肠道屏障功能测定

①物理屏障：由肠上皮细胞之间的紧密连接蛋白TJ(黄怡2012；Zhou YK et al2012；Wang Het al2014)和上皮生长因子EGF等组成。

试验0、10、20天时，各组将处死的鸡，快速采集回、盲肠道组织约0.1g左右，浸入sampleprotector(防止RNA的降解)中，液氮研磨组织，吸取1ml TRIzol试剂充分溶解提取RNA，具体操作参照HSP70RNA的提取。

将提取的RNA用NanoDrop2000测定纯度A260/A280＝1.9-2.1之间，浓度均符合要求，然后进行反转录，按照Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书完成。以cDNA为模板，GAPDH(NM_204305.1)为内参，利用相对定量检测occludin(NM_205128.1)、ZO-1(XM_413773)和EGF(NM_001001292.1)等基因的表达量。引物设计均采用定量专用软件Primer Express完成。具体引物见表6：

表6 RT-PCR引物序列和产物大小

检测occludin、ZO-1和EGF基因荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性3min，接着40个循环，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸10s，溶解曲线从65℃逐步升到95℃。荧光定量PCR体系的最终体积控制在20μl。

②机械屏障：肠道形态结构，绒毛长度与隐窝深度等。

试验0、10、20天时，快速剪下鸡的回、盲肠组织约2cm直接放入固定液(4％甲醛溶液)过夜→取材→水洗30min→脱水(70％乙醇3h、80％过夜、90％乙醇2h、95％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h)→水杨酸甲酯透明过夜→透蜡→包埋→制作蜡块(S.Ashraf et al2013)。用于HE染色。

肠道形态：采用HE染色，对每组至少选择10个典型视野，统计分析绒毛长度和隐窝深度比值(V/C)。

四、结果

(一)生产性能

结果显示(见表7)：与高温对照组相比，本发明的枯草芽孢杆菌组在产蛋率、日采食量、平均蛋重分别提高了2.60％(P<0.05)、2.91％(P>0.05)、0.96％(P>0.05)；在料蛋比、蛋破损率和鸡群死亡率方面均有一定程度的降低；且腹泻率方面，20d时降低了28.89％。

表7 各组生长性能比较

表7的说明：同行肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

(二)血液指标方面

结果显示(见表8)：与高温对照组相比，10、20天时本发明的枯草芽孢杆菌组分别提高IL-10抗炎症因子水平和Pg产蛋激素含量，尤其能显著提高新城疫抗体效价，且降低IL-1促炎症因子水平、内毒素和EPI激素的含量。说明本发明的枯草芽孢杆菌HDRaBS1可显著增强热应激蛋鸡的免疫力，提高抗炎症因子和产蛋有关的激素水平、降低促炎症因子含量。

表8 各组血液水平比较

(三)热休克蛋白(HSPs)的测定

结果显示(见表9)：0天时高温下的两组产生HSP70水平接近，均比室温组水平有所升高，说明在试验前期室温组所受热应激均比高温组小，符合试验要求。10、20天时室温组的HSP70水平呈现逐渐降低趋势，而高温组则基本恒定，说明本发明的枯草芽孢杆菌HDRaBS1使HSP70水平呈现降低趋势，内在地缓解动物机体的热应激。

表9 各组HSP70水平比较

(四)肠道优势菌群分析

由表10结果显示：与高温组相比，10、20天时枯草芽孢杆菌组提高肠道内容物中乳酸杆菌数目，降低大肠杆菌数目。因此，本发明枯草芽孢杆菌HDRaBS1可提高热应激蛋鸡肠道内容物中有益细菌乳酸杆菌的数目，减少大肠杆菌等潜在有害菌的数目，并使肠道优势细菌组成得到改善。

表10 各组优势细菌数目比较

(五)肠道屏障功能测定

①物理屏障方面

结果显示(表11)：与高温对照组相比，10、20天时枯草芽孢杆菌组能显著提高肠道组织中occludin、ZO-1等紧密连接蛋白和EGF mRNA的表达量，且后期改善效果最明显。本发明枯草芽孢杆菌HDRaBS1可显著提高热应激蛋鸡肠道组织的紧密连接蛋白和EGF基因的表达量，形成肠道屏障，减少内毒素的入侵，缓解导致蛋鸡热应激的核心因素

表11 各组紧密连接蛋白和EGF表达量比较

②机械屏障方面

由表12结果显示：与高温对照组相比，枯草芽孢杆菌组回肠(10d)的绒毛高度显著升高(P<0.05)，回、盲肠(20d)的绒毛高度极显著升高(P<0.01)，盲肠(20d)的V/C极显著提高(P<0.01)。具体对绒毛结构的影响如下：枯草芽孢杆菌组回、盲肠(0d)的绒毛结构破碎损伤严重、固有层暴露(见图6A、图7A)；然而随着饲喂时间的延长，回、盲肠(10d、20d)的绒毛高度增加、结构相对完整(见图6B、图6C、图7B、图7C)，与表12中数据相一致。因此本发明枯草芽孢杆菌HDRaBS1能够保护肠道正常结构和促进肠绒毛发育。

表12 枯草芽孢杆菌对回、盲肠绒毛形态的影响

本发明将临床分离的枯草芽孢杆菌HDRaBS1，添加于饲料中，通过蛋鸡的生产性能、血液指标、热休克蛋白测定、肠道优势菌群和肠道屏障功能等综合分析，验证了本发明菌株具有较好的抗应激作用。所以本发明菌株有望作为一种饲料添加剂，在养殖业中推广应用。

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Claims (4)

1.一株来自禽源的对畜禽应激具有缓解作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDRaBS1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2011034。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDRaBS1，其特征在于所述的菌株包括对致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌具有抑菌作用。

3.保藏号为CCTCC NO：M2011034的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDRaBS1在制备对畜禽应激缓解作用的微生物制剂单菌剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中包括在制备蛋鸡饲料添加剂中的应用。