CN114410515B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其复合菌制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能提高虹鳟免疫力、对杀鲑气单胞菌和鳗弧菌具有显著抑制效果的贝莱斯芽孢杆菌MVCR2；还涉及一种含有上述贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的复合菌制剂；还涉及上述贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021507，保藏日期为2021年05月08日。所述贝莱斯芽孢杆菌MVCR2对杀鲑气单胞菌和鳗弧菌具有显著的抑制效果，对由鲑气单胞菌和鳗弧菌引起的多种水产养殖病害具有有效的防治作用，并能提高虹鳟生长、免疫力，提高虹鳟成活率，降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
Description
技术领域
本发明专利属于微生物及其应用领域，尤其涉及一株能提高虹鳟免疫力、对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和鳗弧菌具有显著抑制效果的贝莱斯芽孢杆菌(MVCR2)；本发明还涉及一种含有上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的复合菌制剂；同时，本发明还涉及上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的应用。
背景技术
虹鳟为优质的冷水性鱼类，有陆封型和洄游型，陆封型终生生活在淡水中，洄游型在淡水中产卵孵化，长大后到海水中生活。国外因冷水资源丰富，虹鳟主要在淡水中养殖。我国自1971年引入虹鳟后在淡水中开展养殖，主要分布在北京、黑龙江、山东、山西、辽宁、吉林、陕西甘肃、四川等有冷水资源的地区，但是我国冷水资源量少且分布不均匀，限制了虹鳟养殖产量。淡水虹鳟可以通过盐度驯化的方法实现海水养殖和提高品质。虹鳟驯化入海为满足冷水团海域鲑鳟鱼的苗种供应具有重要意义。但是，驯化过程中的盐度变化产生的胁迫容易引起鱼体免疫和品质变化，造成死亡或者病害损失。提高虹鳟免疫力，对降低淡水虹鳟过渡入海死亡率具有重要意义。
杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和鳗弧菌是虹鳟养殖和过渡入海过程中的主要致病病原菌。杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，属气单胞菌科、气单胞菌属，是一种不能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性菌，其最适生长温度为22～25℃，在淡水和海水中均有分布。杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) 能够使虹鳟患上疖疮病，疖疮病是虹鳟养殖过程中常见细菌病之一。鲑鳟疖疮病可分为急性型、亚急性型、慢性Ⅰ型和慢性Ⅱ型，虹鳟患此病时多表现为慢性型或亚急性型，患病鱼通常表现为体色发黑、食欲不振、鳍基部充血、皮肤溃疡等症状，发病水温为3-21℃，晚春和夏季水温10-0℃时最易发病，死亡率较高。该菌地理分布、宿主范围广泛，除鲑科鱼类以外，还能够感染鲤、河鲈、六线鱼、大菱鲆、大西洋鳕、裸盖鱼等。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，为有鞭毛的革兰氏阴性杆菌，无荚膜，不形成芽孢，能运动。感染症状为病鱼眼球突出，出血；肌肉出血，肿胀、糜烂、坏死；鳍基部、体表、口腔、肛门出血；肠管充血、发炎、无弹性；肝脏出现血斑，脾脏肿大，肾脏肿胀。从幼鱼到成鱼均可感染。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) MVCR2，其对杀鲑气单胞菌和鳗弧菌具有显著的抑制效果，对由鲑气单胞菌和鳗弧菌引起的多种水产养殖病害具有有效的防治作用，并能提高虹鳟生长、免疫力，提高虹鳟成活率，降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021507，保藏日期为2021年 05月08日。
所述贝莱斯芽孢杆菌(MVCR2)为从大菱鲆肠道内分离获得的芽孢杆菌菌株，具有提高虹鳟免疫力的作用，对杀鲑气单胞菌和鳗弧菌具有显著的抑制效果。
所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的主要特征如下：
(1)形态特征：本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2 在LB培养基所形成的菌落为圆形或近圆形，直径2-3mm，白色，表面干燥粗糙有褶皱，不透明，边缘不整齐。
(2)生理生化特征：在LB培养基37℃培养，好氧，显微镜观察菌体为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性，明胶液化、淀粉水解实验，甘露醇、葡萄糖发酵实验阳性，肌醇、鼠李糖实验阴性。
(3)菌株16SrDNA鉴定：对菌株的DNA序列经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后进行16SrRNA鉴定，经鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
进一步地，本发明还提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2作为饲料添加剂的应用，可提高虹鳟免疫力、提高虹鳟生长，防治由杀鲑气单胞菌和鳗弧菌引起的多种水产养殖病害，提高虹鳟成活率，降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
所述贝莱斯芽孢杆菌作为饲料添加剂时，其添加量为饲料中活菌数量大于或等于107CFU/kg(饲料的活菌数量为用平板涂布方法检测测得的单位质量的饲料中所含的益生菌组分的活菌数量)。
本发明还提供了一种含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的复合菌制剂，所述复合菌制剂是由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2 和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363以(1-4):1的活菌数量比例复合而成。所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2为我实验室从大菱鲆肠道分离筛选出的菌株，现保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021507，保藏日期为2021年05月08日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC136363购自北京北纳创联生物技术研究院。该复合菌制剂可以对多种虹鳟致病病原菌具有显著的抑菌效果，并能提高虹鳟免疫力，降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
优选地，所述复合菌制剂是由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2 和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363以2:1的活菌数量比例复合而成。
本发明还公开了一种以上述复合菌制剂作为饲料添加剂的应用。
进一步地，所述复合菌制剂作为饲料添加剂时，添加量为饲料中活菌数量大于或等于107CFU/kg(饲料的活菌数量为用平板涂布方法检测测得的单位质量的饲料中所含的益生菌组分的活菌数量)。将上述复合菌制剂应用于虹鳟饲料添加剂，可提高对多种虹鳟细菌病的防治效果，并能提高虹鳟免疫力，降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
所述含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的复合菌制剂作为饲料添加剂的具体制备步骤如下：
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulan)BNCC 136363分别活化、扩大培养，再分别经37℃液态发酵，活菌数量达到约1.0×109CFU·ml-1，然后将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363按照(1-4):1的细菌数比例混合，4000rpm离心20min收集菌体，加入无菌PBS缓冲液，均匀喷洒于饲料表面，置于黑暗条件下自然阴干，分袋包装后用灭菌的黑色防潮塑料袋保存于4℃冰箱备用。
具体来说，本技术与现有技术相比可产生如下积极效果：
1.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2可以促进肠道绒毛的生长，提高宿主对食物的吸收速度，可产生多种代谢产物如蔗糖、苹果酸等，有利于食物的吸收，从而促进虹鳟的生长。
2.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2可以定殖到虹鳟肠道上，长期有效的发挥作用。贝莱斯芽孢杆菌MVCR2一方面可以通过与病原菌竞争宿主体内的附着位点，抑制病原菌生长；另一方面，在生长繁殖过程中会产生大量营养物质，比如乙酸、丙酸、丁酸等挥发性酸，从而降低动物肠道的pH值，有效抑制病原菌生长，同时可为肠道益生菌乳酸菌的生长创造条件，创造一个良好的肠道环境，提高虹鳟肠道菌群的多样性。
3.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2可以提高虹鳟血清免疫酶和抗氧化酶的活力，提高机体的免疫力，进而降低淡水虹鳟过渡入海死亡率。
4.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的抑菌谱广，可同时高效抑制由杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、大肠杆菌、无乳链球菌等多种病原菌引发的病害。此外，本发明的贝莱斯芽孢杆菌MVCR2还可以有效的降低养殖水体中的氨氮含量(氨氮对鱼体具有毒害作用)，给养殖动物提供更好的养殖条件，从而降低虹鳟感染发病率，对实现渔业的可持续发展具有重要作用。
5.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2可以适应多种环境，在淡、海水中均能存活，对温度、溶氧等适应范围广，对外界环境有较强的抵抗力；对高温、酸性、胆盐和人工胃液均有一定的耐受能力；在恶劣环境下可以形成抗逆性极强的休眠体芽孢形态，在不同的环境中生存具有双重优势 (耐热性和较长的保质期)，具有易筛选培养、能产生芽孢、生物安全性高和抗逆性强(耐高温、耐酸、耐碱)等优势。
6.本发明贝莱斯芽孢杆菌MVCR2和凝结芽孢杆菌BNCC 136363的复合菌剂扩大了抑菌谱和抑菌效果，两种细菌间具有协同作用，复合菌剂对杀鲑气单胞菌、鳗弧菌的防治效果明显优于单菌株。
附图说明
图1为实施例1菌株筛选过程中贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的生长曲线；
图2为实施例4养殖水体的氨氮含量变化；
图3为实施例4的CK组肠道组织切片；
图4为实施例4的BV组肠道组织切片
图5为实施例4的两个处理组肠道肌层厚度、绒毛高度以及绒毛宽度数据；
图6为实施例4的两个处理组的血清免疫酶活数据；
图7实施例4的两个处理组的血清抗氧化酶活数据；
图8为实施例4的BV组与CK组代谢组KEGG通路图；
图9为实施例5的对照组肠道荧光照片；
图10为实施例5的荧光标记组肠道荧光照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1菌株筛选与鉴定
通过对大西洋鲑、海参、虹鳟、大菱鲆等多种水产动物的肠道进行菌株分离筛选，最终从大菱鲆肠道分离筛选出本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2，其分离筛选方法如下：
1)分离：将大西洋鲑、海参、虹鳟、大菱鲆的肠道分别剪碎后取碎块，加入无菌生理盐水中混匀，于震荡培养箱200rpm孵育15min。静置5min后取上清液80℃水浴加热10min。取水浴后的样品100μL，涂布于LB固体培养基平板中；在恒温培养箱37℃下培养10-12h；
2)纯化：从培养后平板中分别挑取不同的单菌落于LB固体培养基平板上进行三区划线，37℃恒温培养10-12h，至少重复3次；
3)富集：将纯化培养后的菌株挑取单菌落分别于LB液体培养基富集培养。通过上述分离步骤，自大西洋鲑、海参、虹鳟、大菱鲆的肠道内分离筛选出6个菌株，分别暂时命名为DB2-2，fe-2，Sap2-1，MA2，SP22，MVCR2；
4)抑菌实验：对分离步骤筛选出的6个菌株进行抑菌测试，实验所用致病菌鳗弧菌、杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、无乳链球菌为实验室分离所得，分离方法简述为：①分离，取山东和黑龙江地区养殖场的患病虹鳟病灶，直接将病灶涂布于LB固体培养基平板中。在恒温培养箱适宜温度(杀鲑气单胞菌25℃，鳗弧菌28℃，大肠杆菌和无乳链球菌37℃)下培养12h左右；②纯化，从培养后平板中分别挑取不同的单菌落于LB固体培养基平板上划线，纯化培养 12h，至少重复三次；③富集，将纯化培养后的菌株挑取单菌落分别于LB液体培养基中富集培养；④鉴定，对所得菌株DNA序列经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后进行16S rRNA鉴定，鉴定结果表明，通过上述分离步骤自虹鳟病灶处分离出的菌株为杀鲑气单胞菌。其他3种致病菌均以上述方法分离得到，上述4种菌株作为抑菌实验用菌株。
抑菌实验采用牛津杯法，其检测方法可为：①菌株活化，取出冻存的菌株进行活化，试管做好标记，恒温震荡培养箱最适温度培养10-12h，得到菌液。并分光光度计测量菌液的吸光度(OD600)。②倒平板，在超净工作台内，点燃酒精灯，取出培养皿并做好标记，同时加热LB固体培养基，融化后倒板，待其凝固。③病原菌涂布，用移液器吸取100μL病原菌菌液，分别将病原菌(杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、大肠杆菌、无乳链球菌)菌液滴于平板上，并用涂布器涂匀，涂到培养基表面发涩。涂布器置于盛有酒精的烧杯中，使用前火焰灼烧灭菌，放凉后涂布。④牛津杯(加益生菌)，在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，每个加100μL、1×108cfu/ml的对应益生菌，不要溢出或者溅出，并做好标记。⑤孵育，置于适宜温度恒温箱中培养，每隔4小时观察一次，出现抑菌圈及时拍照记录。
实验结果如表1所示，发明人筛选出了一株对杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、大肠杆菌、无乳链球菌都具有较好抑菌效果，尤其是对虹鳟细菌病的主要致病病原菌杀鲑气单胞菌和鳗弧菌具有较好抑菌效果的菌种MVCR2，从实验结果可以看出，与其他各菌种相比，MVCR2具有明显优于其他菌种的更显著的抑菌效果；
5)鉴定：对菌株MVCR2的DNA序列经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后进行16S rRNA鉴定，经鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
6)益生菌生长曲线的测定：将菌株MVCR2接种于已灭菌的液体培养基中，在恒温摇床200r/min条件下37℃培养，过程中每隔2h,取菌液以液体培养基为对照测定其在OD600的吸光值，绘制生长曲线。
实验结果如图1所示，贝莱斯芽孢杆菌MVCR2在第4h进入对数期，第 20h进入稳定期。
由实施例1方法筛选鉴定所得的对杀鲑气单胞菌和鳗弧菌都具有较好抑菌效果的菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌(MVCR2)，该菌株于2021年05月08 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2021507。
表1.益生菌抑菌实验结果
注：-：无活性；+：抑菌圈直径<10mm；++：抑菌圈直径10～15mm；+++：抑菌圈直径15～20mm。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌MVCR2和凝结芽孢杆菌BNCC 136363的拮抗实验
分别取贝莱斯芽孢杆菌MVCR2、凝结芽孢杆菌BNCC 136363于LB固体培养基划线，置于37℃培养12h后，分别挑取单菌落在LB固体培养基上进行十字划线，将划线的平板于37℃培养24h后，检查菌株生长情况，拮抗实验划线培养结果表明两菌株均不存在拮抗作用。
实施例3贝莱斯芽孢杆菌MVCR2和凝结芽孢杆菌BNCC 136363混合菌液的抑菌效果
抑菌实验操作步骤及菌液添加量同实施例1，其中，混合菌液由贝莱斯芽孢杆菌MVCR2和凝结芽孢杆菌BNCC 136363以2:1的活菌数量比例复合而成。结果如表2所示，由表2可见，混合菌液的抑菌效果明显优于单一菌株。
表2.单一菌株和混合菌液抑菌实验对比
注：-：无活性；+：抑菌圈直径<10mm；++：抑菌圈直径10～15mm；+++：抑菌圈直径15～20mm；++++：抑菌圈直径>20mm。
实施例4投喂贝莱斯芽孢杆菌MVCR2对虹鳟生长和免疫的影响本实施例对普通饲料组(CK组)、益生菌饲料组(BV组)对虹鳟生长、免疫以及抗病力进行了实验研究。
以爱乐银牌虹鳟专用饲料作为基础饲料，饲料组成包括：粗蛋白质45％、粗脂肪20％、粗纤维3％、粗灰分9％、水分8.5％、总磷2.0％、钙0.8％、氨基酸3.3％。以基础饲料中不添加益生菌的处理组作为对照组，即普通饲料组 (CK组)。以基础饲料中添加了贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的处理组为益生菌饲料组(即BV组)，本实施例中，贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的添加量为饲料中活菌数量约3*107CFU/kg。所述贝莱斯芽孢杆菌(MVCR2)分离自大菱鲆肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021507，保藏日期为2021年05月08日。
实验过程可简述为：在青岛农业大学综合养殖中心平台进行实验，养殖系统为静水养殖。试验分为普通饲料组(CK组)、益生菌饲料组(BV组)，每组3个平行，采用6个养殖桶，每个桶25条鱼。单个养殖桶直径和高分别为97cm、87cm，养殖水体300L左右。养殖水体初始平均温度14.5±0.5℃，盐度为0，溶解氧为8.0±0.2，pH为7.0±0.3。虹鳟鱼苗平均初始体重为19.4±0.5 g。每日投喂2次(9：00、15：00)，饲料投喂量为鱼体重的2％，实验周期为30天。30天养殖实验结束后，进行攻毒试验，采用浓度为5×107cfu/ml的杀鲑气单胞菌用PBS悬浮，每条鱼肌肉注射100μl，对虹鳟进行攻毒，注射完成后，按照实验组别将攻毒侵染后的鱼放回养殖系统中继续养殖，投喂基础饲料，进行14天的死亡率观察，从而计算累积死亡率。
养殖水体的氨氮含量变化监测：养殖实验期间，测量养殖水体的氨氮以分析水质，测定结果如图2。
实验开始和结束时对鱼苗平均体重进行测试以分析虹鳟生长，测试结果如表3。
表3益生菌对虹鳟鱼生长、特定生长率和存活率的影响
同一列的不同字母代表差异显著(P<0.05)。数据以平均值±标准差表示。IW＝初始体量，FW＝终末体重，SGR＝特定生长率，SR＝存活率。
30天养殖实验完成后，取虹鳟肠道做切片，观察肠道生长情况并测量肠道肌层厚度、绒毛高度以及绒毛宽度，结果如图3、图4和图5所示。
虹鳟血清抗氧化和免疫指标测定：30天养殖实验完成后，测定虹鳟血清抗氧化和免疫指标，血清酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、过氧化氢酶(CAT)、血清超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)测定，具体测定参照试剂盒说明书进行操作，测试结果分别如图6、图7所示。并采集肠道内容物进行16S rRNA基因测序和代谢组测序，结果如表4、图8所示。
表4虹鳟肠道菌群α多样性指数。
同一列的不同字母代表差异显著(P<0.05)。数据以平均值±标准差表示。实验结果分析：
结果分析：
1、从表3的实验结果可以看出，益生菌饲料组(BV组)虹鳟的终末体重(FW) 和特定生长率(SGR)均明显高于普通饲料组(CK组)，即本实施例的益生菌应用于饲料不仅可以起到防治虹鳟细菌病的作用，还能够促进虹鳟生长。同时，在本实施例的整个实验过程中，两个实验组(BV组、CK组)均未出现鱼苗死亡情况，攻毒前存活率为100％
2、图2表明，BV组养殖水体中的氨氮含量一直低于CK组，表明贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的添加可以净化养殖水质，有利于虹鳟的健康成长。
3、图3、图4和图5结果表明，与CK组相比，BV组肠道绒毛明显增多，肠道肌层厚度、绒毛高度、绒毛宽度显著升高，有利于食物的吸收，从而促进虹鳟的生长。
4、图6和图7表明，贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的添加使血清免疫和抗氧化酶活性明显升高，酸性磷酸酶(ACP)是溶菌酶体系中的重要组成，可以辅助杀灭消化外来入侵生物。碱性磷酸酶(AKP)是高等动物巨噬细胞溶酶体的标志酶。溶菌酶(LZM)能水解细菌细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖，使之裂解释放后，达到消除侵入机体异物，实现机体防御功能。过氧化氢酶(CAT)、血清超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是抗氧化应激中的重要生化因子，是鱼类清除机体自由基的重要物质，可以保护机体免受氧化损伤。另外，高水平的SOD活性与生物体的免疫水平密切相关，对增强巨噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重要作。ACP、AKP、LZM、SOD、CAT和POD 的活性是衡量水产动物非特异性免疫力的重要指标。由图6、图7可知，免疫酶 ACP、AKP、LZM和抗氧化酶SOD、CAT、POD的活性，BV组显著高于CK 组，表明BV组的免疫力整体高于对照组。
5、表4表明BV组Chao1指数和Ace指数显著高于CK组(P<0.05)。α多样性包含Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数等，共同表征样品的生物多样性。其中Chao1指数和Ace指数反映群落丰富度。表明BV 组肠道微生物群落的物种丰富度显著高于对照组。表明贝莱斯芽孢杆菌的添加有助于提高虹鳟肠道菌群的多样性。
6、图8代谢组的KEGG分析表明，与CK相比，BV组的代谢通路主要富集到淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢、碳水化合物消化吸收、三羧酸循环等代谢途径，其中蔗糖和苹果酸参与以上代谢通路，并且在BV组中显著升高，表明贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的添加有助于促进宿主的消化吸收和能量代谢。
7、攻毒后，BV组的存活率为85％，CK组存活率为31％，表明贝莱斯芽孢杆菌MVCR2可以提高虹鳟的抗病力。
实施例5肠道荧光标记实验
实验于青岛农业大学综合养殖中心平台进行，养殖系统为静水养殖。试验分为对照组和荧光标记组。对照组和荧光标记组分别投喂添加了贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的饲料，两个处理组贝莱斯芽孢杆菌MVCR2的添加量相同，均为饲料中活菌数量5*107CFU/kg，其中对照组的贝莱斯芽孢杆菌MVCR2未做荧光标记，实验组(荧光标记组)贝莱斯芽孢杆菌MVCR2进行了荧光标记。实验所用的虹鳟鱼均为健康虹鳟鱼，大小、形态无显著差异。每个处理组3个平行，养殖条件和养殖环境相同。观察饲料投喂10小时后贝莱斯芽孢杆菌MVCR2在肠道的分布，结果如图9和图10所示。
图9、图10表明，贝莱斯芽孢杆菌MVCR2投喂虹鳟10h后，肠道中仍存在该益生菌，表明本发明的贝莱斯芽孢杆菌MVCR2可以定殖于肠道中，长期有效的发挥作用。
以上所述，仅是本发明的实施例证而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021507，保藏日期为2021年05月08日。
2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备虹鳟饲料添加剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备虹鳟饲料添加剂中的应用，其特征在于，其添加量为饲料中活菌数量大于或等于107CFU/kg。
4.一种含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2的复合菌制剂，其特征在于，所述复合菌制剂是由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363以(1-4):1的活菌数量比例复合而成，所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363购自北京北纳创联生物技术研究院。
5.根据权利要求4所述的所述复合菌制剂，其特征在于，所述复合菌制剂是由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363以2:1的活菌数量比例复合而成。
6.一种用权利要求5所述的复合菌制剂制备虹鳟饲料添加剂的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363分别活化、扩大培养，再分别经37℃液态发酵，活菌数量达到1.0×109CFU·ml-1，然后将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MVCR2和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)BNCC 136363按照2:1的细菌数比例混合，4000rpm离心20min收集菌体，加入无菌PBS缓冲液，均匀喷洒于饲料表面，置于黑暗条件下自然阴干，分袋包装后用灭菌的黑色防潮塑料袋保存于4℃冰箱备用。
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