CN115851541B - 一种益生菌微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种益生菌微生态制剂的制备方法和应用，属于微生态制剂技术领域。微生态制剂中含有贝莱斯芽孢杆菌BzAH‑1，其发酵代谢产物抗逆性强，具有耐高温(100℃处理2小时对抑菌活性没有影响)、耐酸碱(pH 2‑11条件下处理3小时对抑菌活性没有影响)、长时效(8小时内抑菌率维持在93％以上)的特性，能够长效抑制大肠杆菌的生长和繁殖，从而维护动物肠道微生物群落的平衡；该贝莱斯芽孢杆菌的微生态制剂的制备方法，能够降低生产微生态制剂的工艺成本和发酵周期，该贝莱斯芽孢杆菌微生态制剂可以应用于禽类养殖中病原菌防控、提高饲料消化吸收，从而提升动物机体免疫力、促进生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生态制剂技术领域，具体是涉及具有抑菌活性的微生态制剂及其生产方法和应用。
背景技术
随着现代农牧业的发展，高效抗生素类添加剂的使用大大提升了畜禽养殖的效率和产值。然而，抗生素滥用导致细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，如动物源食品中兽药残留超标等现象使得众多肉奶蛋食品正受到生物或化学污染物的严重威胁。
益生菌作为一种新型的微生物饲料添加剂，是抗生素的最佳替代品之一，可以被宿主动物食用以赋予一系列保健益处。如产生抗菌代谢物抑制肠道内的病原微生物，同时帮助宿主肠道微生物群的恢复；调节肠道微生态平衡以进行多种免疫系统的调节，提高免疫机能；产生纤维类消化酶从而提高营养吸收，改善饲料利用效率。因此，与使用传统抗生素相比，补充益生菌不仅能提高动物生长性能，还能维持肠道微生物的平衡，预防病原性疫病的发生，提高牲畜的生产效益。
芽孢杆菌属的细菌广泛分布在不同的自然环境中，例如土壤、岩石、灰尘、海洋、农产品和动物的胃肠道。芽孢杆菌分泌产生多种的次级代谢产物，对动植物的病原菌具有广泛的抑菌活性，且不易产生抗生素类的耐药性，能够取得安全环保的防控病原菌的效果。因此，国内外很多研究机构和学者对芽孢杆菌的抗、抑菌特性进行了广泛研究，希望可以在生物防治和动植物的养殖中发挥重要作用。近年来，贝莱斯芽孢杆菌抗菌和保健功能成为当前研究开发的热点，比如李生樟等(微生物学报,2019,59(10))报道了一种贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis 504的代谢物质对黄单胞菌属的细菌具有较好的抑菌活性，它耐高温和蛋白酶降解，但不耐强酸、强碱，仅在pH 5.5–8.9的条件下具有稳定的活性。王青华等(海洋通报，2019,38(1))报道了一株拮抗迟缓爱德华氏菌等水产致病菌的深海贝莱斯芽孢杆菌DH82，其抗菌物质有较好热稳定性，100℃处理30min后，仍有85.5％抑菌活性。该抗菌物质对酸碱比较敏感，当pH低于4或高于10时，活性显著下降。中国专利(CN201911416772.2)公开一株贝莱斯芽孢杆菌，能够提高猪肠道菌群的多样性，降低炎症因子，促进饲料营养消化吸收，提高免疫力，能抑制常见的猪肠道病原菌大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，减少腹泻产生。但是该技术所述的干菌粉制作工艺复杂，需在发酵液中添加10种不同的保护剂和包埋剂进行处理。同时，该技术所述的干菌制剂活菌数为1010-1011CFU/g，而其应用添加量为107-109CFU/L或106-108CFU/g，因而使用成本相对较高。中国专利(CN201710953249.8)公开一种改善雏鸡肠道功能的复合益生菌剂及制备方法，通过组合三种益生菌贝莱斯芽孢杆菌、肠球菌和嗜麦寡养食胞菌形成复合益生菌添加剂，能够有助于提高雏鸡的生产性能和免疫性能，从而提高健雏率；然而，该技术的贝莱斯芽孢杆菌单独添加会导致雏鸡发病率和死亡率上升。
发明内容
针对现有益生菌制剂技术的不足，本发明旨在提供一种微生态制剂，微生态制剂中含有贝莱斯芽孢杆菌，其发酵代谢产物抗逆性强，耐高温(100℃处理2小时对抑菌活性没有影响)、耐酸碱(pH 2-11条件下处理3小时对抑菌活性没有影响)、长时效(8小时内抑菌率维持在93％以上)的特性，能够长效抑制大肠杆菌的生长和繁殖，从而维护动物肠道微生物群落的平衡，提高生产性能；本发明的目的之二在于提供一种含有贝莱斯芽孢杆菌的微生态制剂的制备方法，降低生产微生态制剂的工艺成本和发酵周期；本发明的目的之三在于提供一种含有贝莱斯芽孢杆菌的微生态制剂的应用，该微生态制剂用于禽类养殖，能够有效提高禽类的生产性能，同时降低死亡率，在减抗、替抗等方面具备良好的应用前景，该贝莱斯芽孢杆菌微生态制剂可以应用于禽类养殖中病原菌防控、提高饲料消化吸收，从而提升动物机体免疫力、促进生长。
为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种包含益生菌的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将益生菌贝莱斯芽孢杆菌接种于斜面LB培养基于30-37℃进行活化培养16-24h；所述益生菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BzAH-1，该菌株已于2022年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCC No:62914；
(2)活化后的菌株接种于摇瓶LB培养基，于150-250rpm、30-37℃培养10-16h，制备得到种子液；
(3)将培养后的种子液转移至发酵培养基中，于500-700rpm、30-37℃培养24-48h，培养过程持续流加补料培养基；
(4)将发酵液进行喷雾干燥，得到含有益生菌的微生态制剂。
优选的，步骤(3)中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖0.3～5％、豆粕粉1～10％、硫酸铵0.1～1.0％、维生素B1 0.0001～0.005％，发酵培养基的pH为6.5～7.0；步骤3)中，所述补料培养基包括如下组分：玉米浆3-8％、酵母粉5-10％、pH为6.5～7.0。
优选的，步骤(4)中，所述喷雾干燥步骤如下：在发酵液中加入碳酸钙1.0～5.0％和脱脂米糠5～10％，然后直接进行喷雾干燥，进风口温度180～230℃，出口温度80～100℃。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：任一所述的方法制备的的包含益生菌的微生态制剂。
所述的包含益生菌的微生态制剂的应用，所述微生态制剂在禽类饲料中的添加量为50～500mg/kg。
一种含有益生菌的微生态制剂，所述益生菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BzAH-1，该菌株已于2022年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCCNo:62914。
上述贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的分离、获得方法为：取10g的来源于中国南海海洋底泥样品，混匀在90mL的无菌水中，定容至100mL。用无菌水对样品进行梯度稀释，各取0.1mL不同稀释度的样品均匀涂布于LB固体培养基平板上，于28-37℃恒温培养24-48h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对菌株进行分离、纯培养。将1mL 1OD(108CFU/mL)的大肠杆菌MG1655菌液加入100mL LB固体培养基中，混匀后制备检测平板。挑取上述分离培养的单菌落分别接种于检测平板上，28-37℃恒温培养24-36h，观察抑菌圈大小。选择有抑菌圈的菌种进行摇瓶培养，收集培养液上清进行抑菌率测定实验、热稳定性测试和酸碱耐受性测试。最终选取抑菌圈、抑菌率、热稳定性、酸碱耐受性最优的菌株进行分子鉴定和系统进化分析，最终获得贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1并送至菌种保存中心进行保藏。
1)将所述贝莱斯芽孢杆菌接种于LB固体培养基，30-37℃进行活化培养16-24h；
2)活化后的菌株接种于摇瓶LB液体培养基，于150-250rpm、30-37℃培养10-16h，制备得到种子液；
3)将培养后的种子液转移至发酵培养基中，于500-700rpm、30-37℃培养24-48h，培养过程中持续通入无菌空气；
4)将发酵液进行喷雾干燥，得到含有益生菌的微生态制剂。
进一步，步骤1)中，所述活化培养步骤为：接种甘油菌于LB固体培养基平板，置于恒温培养箱中30-37℃培养16-24h，至长出直径1-2mm的单菌落。
进一步，步骤2)中，所述种子液培养步骤为：选取长势良好的单菌落，接种于100-500mL种子液体培养基中，于150-250rpm、30-37℃培养10-16h，获得菌落数＞109CFU/mL的种子液。所述种子培养基包括如下组分：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％。
进一步，步骤3)中，所述发酵罐培养步骤为：按2-10％接种量移接种子液至发酵罐，起始阶段，控制通气量为0.5-2vvm，搅拌转速为100～300rpm，温度为30～37℃，自然溶氧；后期搅拌转速为500-700rpm，通过控制流加补料培养基，维持发酵罐中的糖含量为4～8g/L进行发酵，发酵的周期为24～48h。所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖0.3-5％、豆粕粉1-10％、硫酸铵0.1-1.0％、维生素B10.0001-0.005％，发酵培养基的pH为6.5。所述补料培养基包括如下组分：玉米浆3-8％、酵母粉5-10％、pH为6.5～7.0。
进一步，步骤4)中，所述喷雾干燥步骤为：在发酵液中加入质量分数为1-5.0％碳酸钙和5-10％脱脂米糠，然后直接进行喷雾干燥，喷干设备的进风口温度为180-230℃，出口温度80-100℃。
上述的含有贝莱斯芽孢杆菌的微生态制剂在动物养殖上的应用方法为：选择饲养畜禽随机分配为对照组和实验组，对照组喂食正常日粮，实验组在正常日粮中添加100-500mg/kg的微生态制剂。经过30-100d的实验期观察，统计分析对照组与实验组的各项生产性能指标。其中实验组饲喂本发明的微生态制剂后，显著提高了生产效率，降低了料肉比和死亡率，具有明显的先进性。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的微生态制剂中主要成分为贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1，其发酵代谢产物中富含的抗菌物质对大肠杆菌生长和繁殖具有很强的抑制和杀灭作用。该抗菌物质还具备耐高温(100℃处理2小时对抑菌活性没有影响)、耐酸碱(pH 2-11条件下处理3小时对抑菌活性没有影响)、长时效(8小时内抑菌率维持在93％以上)的特性，可以耐受工业化的高温喷干工艺而不丧失活性，其耐酸性可以耐受畜禽酸性胃液的腐蚀，从而维持制剂的生物活性，使其进入动物肠道长时间发挥抗菌、保健的作用。
(2)本发明的微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：菌株的活化培养，摇瓶种子培养，发酵罐培养，辅料添加，喷雾干燥，即得到含有贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的微生态制剂。本方法工艺简单，制作成本低，生产周期短，能够适应于工业化大规模生产。
(3)本发明的微生态制剂的生物活性高，活菌数为1011-1012CFU/g，使用添加量仅为50-500mg/kg即可有效用于动物养殖，能有效保证动物肠道健康，明显提高蛋鸡的产蛋率，降低病死率，起到有效的“减抗、替抗”的作用。
附图说明
图1贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的系统发育树；
图2贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的菌落形态图；
图3贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1抗菌物对大肠杆菌的抑菌效果；1：抗菌物；2：无菌水
图4温度对抗菌物的影响；
图5pH对抗菌物的影响；A：不同pH缓冲液；B：抗菌物
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
本发明的的贝莱斯芽孢杆菌，保藏名称：Bacillus velezensis BzAH-1，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏日期：2022年10月21日，保藏编号为GDMCC No:62914；
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的筛选
取10g的海洋底泥样品，混匀在90mL的无菌水中，定容至100mL。用无菌水对样品进行梯度稀释，各取0.1mL不同稀释度(10-3、10-4、10-5)的样品均匀涂布于LB固体培养基平板上，于28℃恒温培养24h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对细菌进行分离、纯培养。所述LB培养基包括如下成分：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，琼脂粉2％，pH值为7.0。
将1mL 1OD(108CFU/mL)的大肠杆菌MG1655菌液加入100mL LB固体培养基中，混匀后制备检测平板。挑取上述分离纯培养生长的单菌落分别接种于检测平板上，28℃恒温培养24-36h，观察抑菌圈大小，选择有抑菌圈的菌种进行后续分子鉴定研究。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的分子鉴定
利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取菌株基因组DNA，使用通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3'进行16S rDNA的PCR扩增，PCR反应液包括如下组分：无菌水34μL，基因组模板DNA0.5μL，5×buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，27F引物0.5μL，1492R引物0.5μL，PrimStar DNA聚合酶0.5μL。PCR反应程序为：预变性98℃、3min，变性：98℃、30s，退火65℃、30s，延伸：72℃、1min，30个循环，72℃重复延伸3min，PCR结束后，电泳检测DNA的长度和纯度，送至通用生物(滁州)有限公司测序。
使用测序获得的16S rDNA序列进行BLAST序列比对，并构建系统进化树。从图1上可以看出，目标菌株的16S rDNA基因序列与B.velezensis Wh-1的16S rDNA序列位于系统发育树同一分支，亲缘关系最近，且它们都并归于芽孢杆菌属(Bacillus)中。基于以上分子生物学鉴定结果，结合其单菌落呈乳白色、粗糙且边缘不规则的形态学特性，(图2)，鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis，命名为BzAH-1。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的抗菌代谢物制备
将贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1单菌落接种于含有3mL LB培养基的西林瓶中，37℃，180rpm，培养8～16h。按1％(V/V)将菌液接种到200mL LB培养基，37℃，180rpm，培养16～20h。所得培养液于9000rpm，4℃，离心15min，取上清液并使用0.22μm微孔滤膜进行过滤。将滤液放入烘箱中，50℃烘干后获得抗菌物。
实施例4：抗菌代谢物的活性检测
将1mL 1OD(108CFU/mL)的大肠杆菌MG1655菌液加入100mL LB固体培养基中，混匀后制备检测平板。取牛津杯放置于检测平板上，分别往牛津杯中加入80μL无菌水和80μL10％的抗菌物溶液，37℃恒温培养12h后测量抑菌圈大小。结果如图3显示加入抗菌物的牛津杯形成了明显的抑菌圈，抑制了大肠杆菌的生长，而无菌水则无法抑制大肠杆菌的生长。
实施例5：含贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1微生态制剂的生产
将贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1甘油菌接种于LB固体培养基，于37℃培养24h进行菌株活化；将活化的单菌落接种于含有200mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，180rpm，培养16h制备得到种子液；将4％种子液接种到含发酵培养基的发酵罐中，起始阶段，控制通气量为0.5vvm，搅拌转速为300rpm，温度为37℃，自然溶氧；后期搅拌转速为500rpm，通过控制流加补料培养基，维持发酵罐中的糖含量为5g/L进行发酵，发酵的周期为48h。其中发酵培养基组分为：葡萄糖5％、豆粕粉10％、硫酸铵1.0％、维生素B1 0.005％，发酵培养基的pH为6.5；补料培养基组分为：玉米浆3％、酵母粉8％，pH为6.5；发酵结束后，在发酵液中加入碳酸钙5.0％和脱脂米糠5％，然后直接进行喷雾干燥，制备得贝莱斯芽孢杆菌微生态制剂，其中喷干设备的进风口温度为180℃，出口温度80℃。
本发明的微生态制剂的生物活性高，活菌数为1011-1012CFU/g，使用添加量仅为50-500mg/kg即可有效。
实施例6：微生态制剂的抗菌活性检测
将1mL 1OD(108CFU/mL)的大肠杆菌MG1655菌液加入100mL LB液体培养基中获得106CFU/mL的大肠杆菌悬液，分别取2.5mL大肠杆菌悬液，20μL10％的微生态制剂溶液装入西林瓶中，添加LB液体培养基，用以保持所有西林瓶的液体总体积相同，同时设置加入无菌水作为阴性对照。将西林瓶置于37℃，180rpm的恒温摇床中培养8h。每间隔1h，通过分光光度计测量各个西林瓶中菌液的OD600吸光值，计算得出不同处理时间的抑菌率结果如表1所示。
表1贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1抗菌物的抑菌效果
实施例7：抗菌代谢物质的热稳定性
配制10％的微生态制剂溶液，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃及100℃中水浴24h，每隔2h取样(100℃每15min取样)，按实施例6中方法检测抑菌率。如图4所示，不同温度对抑菌物活性的影响随温度和时间变化，其中50℃-70℃处理24h的抗菌物活性无明显变化，其在90℃处理4h后，仍有97.03％抑菌率，100℃处理2h，对活性几乎没有影响，说明该蛋白热稳定性较好，能够耐受长时间的高温处理，能够适应工业化生产的需求，且可以长期储存并保持活性。
实施例8：抗菌代谢物质的酸碱耐受性
分别用pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10及11的缓冲液配制10％的微生态制剂溶液，并在室温静止处理1-3h(以相同体积的pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10及11缓冲液作为阴性对照)，按实施例6中方法检测抑菌率。如图5所示，抗菌物经pH 2-11的缓冲液处理后，其抑菌活性没有明显变化，抑菌率均超过96％，说明其化学结构性质稳定，对酸碱的耐受性较高，在农业、畜牧业领域具有广泛的应用。
实施例9：微生态制剂在蛋鸡中的应用
选择罗曼灰产蛋母鸡26000只随机分配为对照组和实验组，对照组喂食正常日粮，实验组在正常日粮中添加200mg/kg的微生态制剂。实验期30d。自由采食和饮水，结果如表2所示
表2微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响
实验结果表明，实验组的各项生产性能指标较对照组均有明显改善，因此含贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的微生态制剂能够显著提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比和死亡率。
实施例10：微生态制剂在蛋鸡中的应用
选择罗曼灰产蛋母鸡8000只随机分配为对照组和实验组，对照组喂食正常日粮，实验组在正常日粮中添加200mg/kg的微生态制剂。实验期24d。自由采食和饮水，结果如表3所示。
表3BzAH-1微生态制剂对蛋鸡产蛋性能的影响
实验结果表明，微生态制剂的添加明显提高了蛋鸡的生产性能，不仅能够提高产蛋率，同时也降低了死亡率，减少了烂蛋和畸形蛋的产生，达到了良好的生产应用效果。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将益生菌贝莱斯芽孢杆菌接种于斜面LB培养基于30-37℃进行活化培养16-24 h；所述益生菌为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis BzAH-1，
所述的贝莱斯芽孢杆菌，保藏名称：Bacillus velezensis BzAH-1，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏日期：2022年10月21日，保藏编号为GDMCC No: 62914；
（2）活化后的菌株接种于摇瓶LB培养基，于150-250 rpm、30-37℃培养10-16 h，制备得到种子液；
（3）将培养后的种子液转移至含发酵培养基的发酵罐中，于500-700 rpm、30-37℃培养24-48 h，培养过程持续流加补料培养基；
（4）将发酵液进行喷雾干燥，得到含有益生菌的微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖0.3~5%、豆粕粉1~10%、硫酸铵0.1~1.0%、维生素B1 0.0001~0.005%，发酵培养基的pH 为6.5~7.0；步骤（3）中，所述补料培养基包括如下组分：玉米浆3-8%、酵母粉5-10%、pH 为6.5~7.0。
3.根据权利要求1所述的包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述喷雾干燥步骤如下：在发酵液中加入碳酸钙1.0~5.0%和脱脂米糠5~10%，然后直接进行喷雾干燥，进风口温度180~230℃，出口温度80~100℃。
4.根据权利要求1所述的包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述活化培养步骤为：接种甘油菌于LB固体培养基平板，置于恒温培养箱中30-37℃培养16-24 h，至长出直径1-2 mm的单菌落。
5.根据权利要求1所述的包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述种子液培养步骤为：选取长势良好的单菌落，接种于100-500 mL种子液体培养基中，于150-250 rpm、30-37℃培养10-16 h，获得菌落数＞109 CFU/mL的种子液。
6.根据权利要求1所述的包含益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述发酵罐培养步骤为：按2-10%接种量移接种子液至发酵罐，起始阶段，控制通气量为0.5-2 vvm，搅拌转速为100~300 rpm，温度为30~37℃，自然溶氧；后期搅拌转速为500-700rpm，通过控制流加补料培养基，维持发酵罐中的糖含量为4~8 g/L进行发酵，发酵的周期为24~48h。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法制备的包含益生菌的微生态制剂。
8.权利要求7所述的包含益生菌的微生态制剂在制备禽类饲料的应用，其特征在于，所述微生态制剂在禽类饲料中的添加量为50~500 mg/kg。
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2022
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Non-Patent Citations (1)
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| 贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的抗菌特性及应用;尤巧等;饲料工业;20230428;第44卷(第15期);第79-85页 * |
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