CN114891705A

CN114891705A - 一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌及其培养方法与应用

Info

Publication number: CN114891705A
Application number: CN202210809447.8A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 谢英杰; 毕重朋; 单安山
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-07-11
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-07-11
Also published as: CN114891705B

Abstract

本发明公开了一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）及其培养方法与应用，属于农业微生物应用技术领域，该菌保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 20211424，分类命名为Lactobacillus reuteri XYJ‑MZ056N。该菌在生长过程中，可生产乙酸和乳酸，其无细胞上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌等常见致病性细菌存在抑菌效果。该菌具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，并对多种抗生素敏感，具有开发为预防仔猪断奶性腹泻的用途微生态制剂的潜力。

Description

一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌及其培养方法与应用

技术领域

本发明属于农业微生物应用技术领域，尤其涉及一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）及其培养方法与应用。

背景技术

近年来，由病原性微生物侵袭造成的仔猪腹泻日益严重，已经导致我国和其他国家的生猪养殖行业产生了严重的经济损失。抗生素的禁用使得研究者将目光转向益生元、益生菌、酸化剂和植物提取物等抗生素替代物。有机酸和益生菌存在相互影响的效果。肠道中部分菌群可以发酵食物中未消化的碳水化合物产生短链脂肪酸参与肠道的发育；而有机酸会选择性地去除致病菌，保护有益菌群。同时，有机酸补充剂与正在发育的理想肠道微生物群落相互协调可以提高营养物质的消化率和利用率。益生菌和酸化剂的联系和协同作用有很大的研究价值。

动物肠道中存在大量微生物并构成一个复杂的微生物生态系统。不同种类或品系个体为满足其特定的生理和代谢需求，通常存在着独特的肠道微生物系统并可能包含独特的菌种。民猪作为中国寒冷地区的优良品种相较于大白猪、长白猪等外来猪种有着独特的肠道微生态结构。另外，民猪有较强的抗腹泻、抗寒性和抗病性能力；其肠道中短链挥发性脂肪酸含量显著高于大白猪和长白猪。考虑到肠道中的酸性物质大部分为胃肠道中细菌的代谢产物，这暗示民猪肠道中可能存在优良的产酸菌株。

发明内容

基于以上畜牧养殖生产过程中实际问题及需求，本发明提供一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）；该菌株在生长过程中，可生产乙酸和乳酸，其无细胞上清液对大肠杆菌在内的多数致病菌存在抑菌效果，有助于提高动物对断奶后腹泻的抵抗力，从而提高动物的抗病性。

本发明所采用的技术方案如下：一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年11月15日，保藏编号为CCTCC M 20211424，分类命名为Lactobacillus reuteri XYJ-MZ056N。

进一步的，如上所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌具有抑菌活性。

本发明还提供一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌的培养方法，如下：取OD₆₀₀=1.0种子液按体积比1%的接种量接种至培养基中，温度25-45 ℃，pH 取4-7，NaCl 0-4% w/v，厌氧条件下培养，所述的培养基采用MRS液体培养基。

进一步的，如上所述的培养方法，温度35-45 ℃，pH =7，NaCl 0-2% w/v。

本发明还提供一种益生菌制剂，含有如上所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌。

本发明的优点及有益效果：本发明所提供的产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri XYJ-MZ056N，对多种致病性细菌存在抑菌效果。该菌具有良好的耐酸、耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，并对多种抗生素敏感，具有开发为预防仔猪断奶性腹泻的微生态制剂的潜力。

附图说明

图1为菌株XYJ-MZ056N菌落形态图；

图2为菌株XYJ-MZ056N在光学显微镜下的菌体形态图；

图3为菌株XYJ-MZ056N的系统发育树图；

图4为菌株XYJ-MZ056N在不同温度下的生长情况图；

图5为菌株XYJ-MZ056N在不同pH条件下的生长情况图；

图6为菌株XYJ-MZ056N在不同NaCl浓度条件下的生长情况图；

图7为菌株XYJ-MZ056N发酵液pH变化曲线图；

图8为菌株XYJ-MZ056N发酵液产酸量变化曲线图；

图9为菌株XYJ-MZ056N 24 h发酵液气相曲线图；

图10为菌株XYJ-MZ056N的耐酸能力图；

图11为菌株XYJ-MZ056N的耐胆盐能力图；

图12为菌株XYJ-MZ056N对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的黏附能力图。

具体实施方式

以下所述实施例对本发明作出进一步详细说明，但需要明确的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明的目的、技术方案及优点等，并不对本发明构成任何限制。

实施例1：菌株XYJ-MZ056N的分离、筛选与鉴定

民猪粪便采集自哈尔滨市兰西县种猪场健康母猪和出栏育肥猪。取1 g民猪粪便于100 mL生理盐水中混匀，用生理盐水梯度稀释。选择适合的浓度在含有1% CaCO₃的MRS琼脂培养基上均匀涂板，37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。用接种环挑取有明显“溶钙圈”的单菌落，接种于MRS肉汤培养基，37 ℃厌氧培养箱中培养24 h。分离菌株采用平板划线法纯化后与60%甘油1:1混合后保存于-80 ℃冰箱。

使用改良MRS培养判定菌株的产酸能力对分离菌株进行筛选，改良MRS培养基是将MRS培养基中的葡萄糖和乙酸钠替换为麦芽糖（35 g/L）和果糖（5 g/L）。改良MRS培养基中添加0.02 g/L溴酚蓝，菌株培养环境为37 ℃厌氧培养箱，记录菌液的变色时间并在接种12h，24 h和48 h取样测定菌液的pH值。从中优选出一株产酸速度快、最终pH低的菌株XYJ-MZ056N，其培养在4 h变色，48 h的pH值可降低到3.33。

菌株形态和生理生化特征按照《乳酸菌细菌分类鉴定与实验方法》进行鉴定。结果表明，菌株XYJ-MZ056N在MRS平板上呈现凸起，圆形，乳白色，边缘整齐，表面湿润光滑（见图1）。显微镜观察菌体细胞为革兰氏阳性菌，短杆状，单个或者成堆排列（见图2），生理生化特征如下（见表1）：

表1 菌株XYJ-MZ056N生理生化特征

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

菌株的16S rRNA鉴定：使用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR（Code No. D304）提取细菌模板DNA。用2×TransTaq®High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix Ⅰ（TransGen Biotrch, Code No: AS131）和菌株鉴定通用引物27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）扩增菌株16S rDNA并测序，序列通过NCBI的BLAST中进行同源性分析，将相关序列导出并在MEGA X软件中用MaximumLikelihood法构建系统发育树（见图3）。

基于形态观察、生理生化反应、16S rRNA分子鉴定以及系统发育树分析结果，最终确定本菌株为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）。为简化说明，在下文中，将本发明所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）XYJ-MZ056N用XYJ-MZ056N表示，将此菌株送交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期为2021年11月15日，保藏编号为CCTCC M 20211424，分类命名为Lactobacillus reuteri XYJ-MZ056N。

实施例2：菌株XYJ-MZ056N的生长特性分析

挑取XYJ-MZ056N单菌落接种至MRS肉汤培养基中，于37 ℃厌氧培养箱中过夜培养，获得种子液。用灭菌的MRS肉汤培养基调节种子液为OD₆₀₀=1.0后备用。将备用的菌液以体积比1%的接种量接种至5 mL MRS肉汤培养基中，在37 ℃厌氧培养箱中培养。1）修改培养箱温度为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，培养6 h和24 h；2）将培养基的初始pH值调整为2、3、4、5、5.9（MRS肉汤初始pH）、7和8 ，培养6 h；3）在培养基中不添加NaCl和分别添加0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、4%、6%、8%（w/v）NaCl，培养6 h。测定各培养物的OD₆₀₀值，通过吸光度值分析所选菌株在不同条件下的生长情况。

试验结果见图4-6。结果表明，菌株XYJ-MZ056N可以在25-45 ℃的条件下生长，最适温度为35-45 ℃；可在pH=4-7条件下生长，最适pH=7；可在4% w/v的NaCl浓度内生长， 2%w/v内的NaCl浓度对菌株生长无显著影响。

实施例3：菌株XYJ-MZ056N的产酸能力分析

按照实施例1的步骤制备种子液，调节种子液为OD₆₀₀=1.0。按1%的接种量分别接种在不同管的5 mL 改良MRS肉汤培养基中，在37 ℃厌氧培养箱中培养。菌株无细胞上清液的取得按照以下程序进行：在4 ℃、4000 g条件下离心10 min，吸取上层清液并经0.22 μm水系滤器过滤，重复两次。每6 h取1管菌液，测定pH并取得无细胞上清液，直至48 h。按照国标GB12456-2021的方法测定上清液的酸度。菌株XYJ-MZ056N接种后培养基的pH和酸度变化如图7-8所示。结果显示，菌株XYJ-MZ056N产酸速度在接种后的12 h内较快，24 h后菌株产酸较慢，48 h达到最终产酸量16.72±0.09 g/L。

菌株XYJ-MZ056N 24 h的无细胞上清液的挥发性脂肪酸含量使用气相色谱法测定，使用巴豆酸作为内标，利用各种短链脂肪酸与巴豆酸的浓度关系绘制标准曲线，标准品与巴豆酸峰面积的比值为y轴，标准品与巴豆酸的添加量的比值为x轴，从标准曲线获得样品中短链挥发性脂肪酸的含量。采用日本岛津GC-2010型气相色谱仪，色谱柱型号为HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Part Number：19091N-133I），氢火焰离子化检测器（FID）。如图9所示，色谱显示菌株XYJ-MZ056N可产的短链挥发性脂肪酸为乙酸。同时使用乳酸（LD）测试盒（A019-2-1，南京建成生物工程研究所）测定菌液上清的乳酸含量。结果显示，24 h的无细胞上清液的乳酸为74.10±2.80 mmol/L，乙酸含量为15.93±2.67 mmol/L。

实施例4：菌株XYJ-MZ056N的抑菌能力

以最小抑菌稀释量检验菌株XYJ-MZ056N对指示菌的抑菌能力。指示菌由东北农业大学动物营养研究所提供，包括：大肠杆菌（K88、K99、ATCC 25922）、鼠伤寒沙门氏菌（C7731、ATCC 14028）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）。指示菌划线培养后，挑取单菌落接种于BHI肉汤中并放入摇床种培养，37 ℃，220 r/min。过夜培养的指示菌按体积比1%的接种量接种在BHI肉汤中并继续培养3 h，调节OD₆₀₀=0.40±0.01后备用。菌株XYJ-MZ056N无细胞上清液的取得按照实施例2所述进行，用无菌MRS溶液在微孔板上二倍稀释菌株XYJ-MZ056N的24 h无细胞上清液。随后加入等体积的10⁻²稀释的指示菌接种，在37 ℃培养箱中孵育18 h。最小抑菌稀释量定义为观察到指示菌抑制作用的筛选菌上清的最低稀释量，结果表明菌株XYJ-MZ056N的菌液抑菌能力较强，经过稀释后，仍对大肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌存在抑菌作用（见表2）。

表2 菌株抑菌能力测定

指示菌	K88	K99	C7731	ATCC 14028	ATCC 25922	ATCC 25923	ATCC 27853
								最小抑菌稀释度	0.375	0.375	0.375	0.375	0.250	0.375	0.188

注：抑菌能力表示为最小抑制稀释度，这是观察到指示菌菌株抑制的测试菌上清液的最低稀释度。抑制作用表示为抑制指示菌菌株所需的0（最低稀释度）和1（未稀释上清液）之间的数字。

实施例5：菌株XYJ-MZ056N耐酸耐胆盐能力测定

按照实施例1的步骤制备种子液，调节种子液为OD₆₀₀=1.0。1%接种在不同pH（2.0、2.5、3.0、7.0）MRS培养基和含有不同含量（w/v，0%、0.1%、0.3%、0.5%）的猪胆盐的MRS培养基中，并在37 ℃厌氧培养箱中孵育3 h，并使用平板计数法在MRS琼脂上计算剩余活菌数。如图10-11所示，菌株XYJ-MZ056N耐酸和耐胆盐能力较好，菌株在低pH（2.0、2.5、3.0）和胆盐条件（w/v，0.1%、0.3%、0.5%）孵育3 h，依然有活菌存活。

实施例6：菌株XYJ-MZ056N与肠道细胞的黏附

IPEC-J2猪小肠上皮细胞生长于含10%胎牛血清、0.1%青霉素和0.1%链霉素的DME/F-12 1:1培养液中，在37 ℃、5% CO₂气体条件下培养，隔日用PBS缓冲液清洗并更换培养液。当IPEC-J2细胞铺满培养瓶底时用胰酶消化传代。传代三次后接种到12孔细胞培养板，粘附试验前12 h更换为无抗生素的培养液。按照实施例1的步骤制备菌株XYJ-MZ056N种子液，调节种子液为OD₆₀₀=1.0。离心后用PBS缓冲液洗涤2次，然后用同体积的DME/F-12 1:1培养液重悬。将培养24 h的IPEC-J2细胞用PBS缓冲液清洗2次，每孔加入1 mL制备好的细菌菌液，放入37 ℃、5% CO₂的培养箱孵育1 h，用PBS缓冲液清洗3次以除去未结合的细菌。在细菌和细胞共孵育完成后，PBS清洗，用甲醇固定30 min，革兰氏染色（0.5%结晶紫），油镜下（1000×倍）观察。结果如图12所示，图中可以很明显的观察到菌株对猪小肠上皮细胞的黏附。

实施例7：菌株XYJ-MZ056N抗生素敏感性试验

采用肉汤二倍梯度稀释法测定耐药性，按照实施例1的步骤制备种子液，调节种子液为OD₆₀₀=1.0，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用同体积的MH肉汤重悬。接种在含有抗菌药物的96孔板中，放入37 ℃厌氧培养箱中培养16-20 h，并用酶标仪测定OD₆₀₀值，记录抗生素对菌株的最小抑菌浓度（MIC）并与农业农村部《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》推荐的MIC值比较，若试验MIC≤推荐值则菌株视为菌株抗生素敏感。结果如表3显示，菌株XYJ-MZ056N对青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素四种抗生素均敏感。

表3 菌株对抗生素的敏感性

菌株	青霉素	链霉素	庆大霉素	卡那霉素	万古霉素
						XYJ-MZ056N	S	S	S	S	n.r.

注：S，敏感；n.r.，无需测定。

Claims

1.一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年11月15日，保藏编号为CCTCC M 20211424，分类命名为Lactobacillus reuteri XYJ-MZ056N。

2.根据权利要求1所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌，其特征在于，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌具有抑菌活性。

3.根据权利要求1所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于，方法如下：取OD₆₀₀=1.0种子液按体积比1%的接种量接种至培养基中，温度25-45 ℃，pH 取4-7，NaCl 0-4% w/v，厌氧条件下培养，所述的培养基采用MRS液体培养基。

4.根据权利要求3所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于，方法如下：温度35-45 ℃，pH =7，NaCl 0-2% w/v。

5.一种益生菌制剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的一种产酸的民猪源罗伊氏乳杆菌。