CN103114051A

CN103114051A - 一种罗伊氏乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103114051A
Application number: CN2012104587985A
Authority: CN
Inventors: 张和春; 杭晓敏; 张旻; 夏祎稚; 陈培青
Original assignee: NUODE BIOLOGICAL IND CO Ltd SHANGHAI; ONLY CO Ltd SHANGHAI JIANTONG UNIV
Current assignee: NUODE BIOLOGICAL IND CO Ltd SHANGHAI; ONLY CO Ltd SHANGHAI JIANTONG UNIV
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2013-05-22

Abstract

本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌及其应用，所述罗伊氏乳杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO.6405。所述的罗伊氏乳杆菌在调节肠道菌群、抑制肠道致病菌或食品腐败微生物可得到应用。或者，所述罗伊氏乳杆菌与常规载体组合在预防和/或治疗肠道菌群失调中能够得到良好的应用效果。

Description

一种罗伊氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种乳杆菌属的新菌株及其应用，更准确地说，本发明描述了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的一个新菌株LE16，及其调节肠菌群功能和对肠道致病菌、食品腐败菌的抑菌作用。本发明还涉及罗伊氏乳杆菌LE16与常规载体组合，可用于预防和/或治疗肠道菌群失调。

背景技术

人的胃肠道栖息着各种细菌，根据对人体的影响可分为有益菌、有害菌和中性菌。人体内有益菌占优势，就会表现出健康状态，其中双歧杆菌和乳杆菌是最具代表性的有益菌。

罗伊氏乳杆菌是乳杆菌中重要的一种，是人体肠道固有的细菌。另外，该菌种还存在于母乳中，从226名居住在瑞典、丹麦、以色列、南非、南韩、日本和秘鲁等不同国家的都市或乡区的母乳中分离出可计数的罗伊氏乳杆菌占12%，属优势菌。

罗伊氏乳杆菌可调节肠道菌群平衡，有效降低轮状病毒引起的腹泻；Shomikova等于1996年对66名(年龄6~36个月)由轮状病毒引起腹泻的小孩进行的研究提出，罗伊氏乳杆菌的治疗效果明显，且有剂量关系，高剂量组效果更佳，每日摄取罗伊氏乳杆菌或产品是比较有效治疗轮状病毒所引起的腹泻的方法。

罗伊氏乳杆菌还具有抗过敏作用，研究提出，对过敏高危险群孕妇及其新生儿口服罗伊氏乳杆菌各一个月，可将婴儿湿疹比例从46%降低至23%，且没有观察到任何的不良反应。研究追踪更发现，这群小孩在4岁时气喘及过敏性鼻炎的发生率也明显下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌（罗伊氏乳杆菌LE16）及其应用。

实现上述发明目的的解决方案是：

一种罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6405。

上述罗伊氏乳杆菌LE16直接自健康婴儿粪便中分离获得，已于2012年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No.6405。

所述的罗伊氏乳杆菌在调节肠道菌群中的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌在抑制肠道致病菌或食品腐败微生物中的应用。

所述肠道致病菌是指大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌或产气荚膜梭菌；所述食品腐败微生物是指枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。

罗伊氏乳杆菌与常规载体组合在预防和/或治疗肠道菌群失调中的应用。

所述常规载体是低聚糖、维生素、矿物质、食品辅料的一种或多种。

本发明的罗伊氏乳杆菌LE16的形态为杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽孢，产生乳酸，兼性厌氧。

附图说明

图1是本发明的罗伊氏乳杆菌在显微镜（×1000倍）下的菌体形态图。

具体实施方式

本发明的罗伊氏乳杆菌LE16利用L-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖，不利用甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖甙、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、水杨甙、纤维二糖、海藻糖、菊糖、松叁糖、淀粉、肝糖、木糖醇、龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-阿糖醇、L-阿糖醇、葡萄糖酸钠、2-酮基-葡萄糖酸钠、5-酮基-葡萄糖酸钠。

本发明的罗伊氏乳杆菌LE16发酵过程是在MRS液体培养基中37℃培养24h。

实施例1 菌株镜检

无菌条件下用接种环挑罗伊氏乳杆菌LE16，涂于载玻片上，制片并革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。

实施例2 MRS平板纯化分离

无菌条件下用接种环挑罗伊氏乳杆菌LE16，在MRS平板上划线，平板置于培养箱中37℃培养48h，挑选单菌落进行镜检，达到菌株纯种分离。

实施例3 菌株发酵

用接种环将罗伊氏乳杆菌LE16从斜面上挑取二环至装有15ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，再以1%接种量接入15ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，即得罗伊氏乳杆菌LE16发酵液。

实施例4 罗伊氏乳杆菌LE16耐酸、耐胆盐性能

LE16菌株于MRS液体培养基中37℃培养24小时后，离心收集菌体，取1ml细胞重悬液至pH3.0的9.0ml无菌PBS中，37℃处理0、1、2、3小时后进行活菌计数分析(表1)。

表1结果表明，pH3.0条件下处理3小时活菌数下降不到一个数量级，具有较好的耐酸能力，能顺利通过胃到达肠道发挥益生作用。

LE16菌株于MRS液体培养基中37℃培养24小时后，离心收集菌体，取1ml细胞重悬液至0.1%胆盐浓度的9.0ml无菌PBS中，37℃处理0、1、2、3小时后进行活菌计数分析(表2)。

表2结果表明，0.1%胆盐浓度条件下处理3小时活菌数仅下降一个数量级，具有很好的耐胆盐性能，可以在肠道内存活并定值。

实施例5 罗伊氏乳杆菌LE16的16S rDNA（见序列表）。

实施例6 罗伊氏乳杆菌LE16的酶活性

用梅里埃API ZYM试剂盒测定了罗伊氏乳杆菌LE16酶活性，结果见表3。

表3结果表明，罗伊氏乳杆菌LE16的白氨酸芳胺酶、β-糖醛酸甙酶活性非常强，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-葡萄糖甙酶活性次之，而表中其它酶活性则没有。

实施例7 罗伊氏乳杆菌LE16的抗生素敏感性能

罗伊氏乳杆菌LE16对先锋噻肟、氨苄青霉素、舒巴坦、舒普深、菌必治、阿齐霉素、羧苄青霉素、乙酰螺旋霉素、先锋Ⅴ、新霉素、克林霉素、氯霉素、新生霉素、先锋必、头孢呋肟、头孢拉定、左氟沙星、红霉素、头孢孟多、呋喃妥因、安灭菌、青霉素P-G、氧哌嗪青霉素、利福平、复达欣、四环素、林可霉素、头孢噻吩等28各种抗生素敏感；对痢特灵、阿米卡星、庆大霉素、大观霉素等4种抗生素中度敏感；对复方新诺明、卡那霉素、萘啶酸、氟哌酸、苯唑青霉素、链霉素、氧氟沙星、妥布霉素、环丙沙星、万古霉素等10种抗生素抗性。

实施例8 罗伊氏乳杆菌LE16抑菌性能

罗伊氏乳杆菌LE16于MRS液体培养基37℃静止培养24h，将该菌液点到

MRS固体平板上，每板平行三个点，37℃好氧培养24h。

将各种200ml培养过夜的指示菌液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏痢疾杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及乳双歧杆菌)分别与7ml软琼脂混匀，倒在点有罗伊氏乳杆菌LE16的MRS平板上，静止培养或厌氧(根据指示菌)37℃培养24 h(静止培养)或48 h(厌氧)，拍照并测量指示菌斑点周围的抑菌圈大小(表4)。

表4结果表明，罗伊氏乳杆菌LE16对大部分肠道有害菌均有抑制作用,其中对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌和伤寒沙门氏菌的抑制作用最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏痢疾杆菌、产气荚膜梭菌的抑制作用稍弱，而对其它益生菌如嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及乳双歧杆菌均无抑制作用。

注：“-”表示罗伊氏乳杆菌LE16对指示菌没有抑制作用。

实施例9 罗伊氏乳杆菌LE16调节肠道菌群功能动物实验

1、罗伊氏乳杆菌LE16调节正常小鼠肠道菌群功能动物实验

40只正常小鼠，分成两组，一组为罗伊氏乳杆菌LE16组(20只)，每天灌喂罗伊氏乳杆菌LE16发酵液1 ml (>1′10⁸cfu/ml)，连续6天，另一组为对照组(20只)，检测小鼠肠道微生物变化情况，数据用x±s表示，应用统计软件SPSS 10.0进行t检验及相关分析。(表5)

表5结果表明，与对照组相比，灌喂罗伊氏乳杆菌LE16发酵液可使小鼠肠道的双歧杆菌和乳杆菌明显增加，且有显著性差异(P<0.05)。

上述结果表明，罗伊氏乳杆菌LE16具有调节肠道菌群功能方面的作用。

* 与正常对照组比较，罗伊氏乳杆菌组P<0.05。

2、罗伊氏乳杆菌LE16调节菌群失调小鼠的肠道菌群功能动物实验

小鼠60只，分成以下三组，进行罗伊氏乳杆菌LE16对肠道菌群失调小鼠的肠道菌群功能调节作用研究。

对照组20只小鼠；大黄组20只小鼠，每天灌胃大黄液1ml，连续给药8天，造成肠道菌群失调，第9 天处死；罗伊氏乳杆菌组20只小鼠，每天灌胃大黄液1 ml，连续8天，但在给大黄液的第3 天起时，另外再多灌胃罗伊氏乳杆菌LE16发酵液1ml (>1′10⁸cfu/ml)，连续6天，第9 天处死；分别取各组小鼠的粪便检测小鼠肠道微生物变化情况，数据用x±s表示，应用统计软件SPSS 10.0进行t检验及相关分析，见表6。

与对照组比较，*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001。与大黄组相比，#为P<0.05。

由表5可见，大黄组与对照组比较，四种肠道主要菌群数量均有明显变化，表现为肠球菌和双歧杆菌数量明显下降(P<0.05)，乳杆菌数显著减少(P<0.01)，而大肠杆菌数极显著增加(P<0.001)，这表明小鼠在被灌胃大黄后，其肠道菌群失调。而罗伊氏乳杆菌组与对照相比，在服大黄液的第3天后再加服罗伊氏乳杆菌LE16，虽然大黄仍服8天，但肠道中的四种细菌数量均能保持在正常范围，与大黄组比较均有显著性差异。这表明，在肠道菌群失调后，罗伊氏乳杆菌LE16能调节菌群失调，维持肠道正常菌群平衡。

上述结果表明，本发明中的罗伊氏乳杆菌LE16具有调节肠道菌群功能的作用, 与常规载体组合，可预防和/或治疗肠道菌群失调。

Claims

1.一种罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO.6405。

2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在调节肠道菌群中的应用。

3.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在抑制肠道致病菌或食品腐败微生物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌是指大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌或产气荚膜梭菌；

所述食品腐败微生物是指枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。

5.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌与常规载体组合在预防和/或治疗肠道菌群失调中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述常规载体是低聚糖、维生素、矿物质、食品辅料的一种或多种。