CN109385387A - 一种抗tgev的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种抗tgev的罗伊氏乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，所述罗伊氏乳杆菌的pheS基因序列如SEQ ID No.2所示；并提供一株罗伊氏乳杆菌菌株，其命名为Yyg‑24，其保藏编号为CGMCC NO.12566。本发明还涉及由上述罗伊氏乳杆菌制备的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品及上述罗伊氏乳杆菌的应用。本发明所述的菌株可有效的抗猪TGEV病毒，有效抑制革兰氏阴性菌和阳性菌，比如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌，弥补了现有技术的空白。

Description

一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
动物肠道是营养物质消化吸收的主要场所，也是机体内防御的第一道屏障。然而现代养猪业中猪肠道疾病普遍存在，且猪腹泻是最为常见的一种。仔猪腹泻是现代规模化、集约化养猪生产条件下的一种常见的多因素性疾病。该病是目前最为严重的仔猪疾病之一，具有发病率高、治愈率低等特点，给养猪业生产带来重大的经济损失。引起仔猪腹泻的原因有三方面，营养性方面、病理性方面和管理方面，其中病理性方面最多，包括病毒、细菌和原生动物，其中猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病，死亡率近100％，它是造成仔猪病毒性肠炎和腹泻的主要原因，也是引起新生仔猪死亡率增加，造成重大经济损失的主要原因。该病在1946年首次在美国进行报告，现已广泛存在于北洲、亚洲、欧洲的大部分国家，称为一种世界性猪疾病，受到世界各国猪病学者的高度重视。我国四川、湖北、吉林、陕西、台湾、北京、广州等省市也有本病的发生，目前该病尚无有效的抗病毒药物可以治疗。
乳酸菌是目前广泛应用的一类益生菌，大部分乳酸菌都具有抑制致病菌如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌等，近年来越来越多的报道显示乳杆菌属具有抵抗人和动物不同种病毒的作用，目前乳酸菌属已经广泛应用于人和动物疾病的预防和治疗方面。
但目前还未有将乳酸菌应用于抗TGEV的相关报道。
发明内容
为了于克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种可以有效抑制阴性菌和阳性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌的抗TGEV的罗伊氏乳杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，所述罗伊氏乳杆菌的pheS基因序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述罗伊氏乳杆菌菌株命名为Yyg-24，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，其保藏编号为CGMCC NO.12566，保藏日期为2016年05月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，在筛选上述罗伊氏乳杆菌菌株Yyg-24过程中，用于扩增所述16S rDNA基因序列的引物序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所示；用于扩增所述pheS基因序列的引物序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.6所示。
进一步地，筛选上述罗伊氏乳杆菌菌株Yyg-24的步骤包括：采集粪样；菌株的分离纯化；将分离纯化的益生菌进行活化并感染TGEV，计算病毒抑制率，进行抗TGEV益生菌株的初步筛选；对筛选的菌株进行耐酸、耐胆盐试验，进行抗TGEV益生菌株的的再次筛选；测序确定抗TGEV益生菌株为罗伊氏乳杆菌菌株；对再次筛选所得的罗伊氏乳杆菌菌株进行甲基磺酸乙酯诱变，将菌株进行传代培养，以比较每代菌株及上清液的病毒抑制能力，从而将稳定性最优的菌株命名为罗伊氏乳杆菌菌株Yyg-24。
进一步地，所述罗伊氏乳杆菌菌株的单菌落在培养基上为灰白色，不透明，边缘不整齐，经电镜观察为革兰氏染色呈阳性，菌体细胞呈杆状，单个无规则排列；硝酸盐还原试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、不液化明胶，不产生硫化氢，无运动性。
本发明的第二个目的是提供一种由上述抗TGEV的罗伊氏乳杆菌制备的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品。
进一步地，所述预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品包括罗伊氏乳杆菌菌剂、罗伊氏乳杆菌肠道功能调节剂、罗伊氏乳杆菌药用组合物，也为其他任一合适的产品形式。
进一步地，所述罗伊氏乳杆菌菌剂的活性成分包括罗伊氏乳杆菌的发酵培养物、罗伊氏乳杆菌细胞的超声裂解上清、罗伊氏乳杆菌细胞的超声裂解沉淀中的至少一种。
进一步地，所述罗伊氏乳杆菌菌剂的制备包括如下步骤：
(1)菌株活化：将罗伊氏乳杆菌甘油管接种于120mL新鲜液体MRS培养基中，于37℃静置培养24小时，培养结束后菌浓在2×109-6×109cfu/mL之间；
(2)发酵菌剂制备：将步骤(1)的活化菌株罗伊氏乳杆菌接种于液体培养基中，接种至溶液浓度中菌浓为105-106cfu/mL，静置培养，温度为37℃，培养24小时；收集含菌体的培养液制得罗伊氏乳杆菌菌剂。
进一步地，所述预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品能抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌，且能同时抗TGEV病毒。
本发明的第三个目的是提供一种上述抗TGEV的罗伊氏乳杆菌在制备用于预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明所获得的罗伊氏乳杆菌，其可以有效的抗猪TGEV病毒，并且可以有效抑制阴性菌，比如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌，具体有益效果如下：
(1)经电镜观察为革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状，单个无规则排列；该菌菌落灰白色，边缘不整齐，不透明；硝酸盐还原试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、不液化明胶，不产生硫化氢，无运动性。
(2)罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果。同时在本实验中排除了酸和过氧化氢的抑菌性，经推测可能是罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵产生的一些细菌素对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌有抑制效果。
附图说明
本发明涉及的罗伊氏乳杆菌菌株命名为Yyg-24，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，其保藏编号为CGMCC NO.12566，保藏日期为2016年05月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
图1是本发明一实施例中L1-L20初筛结果的示意图；
图2是本发明一实施例中L21-L40初筛结果的示意图；
图3是本发明一实施例中L41-L60初筛结果的示意图；
图4是本发明一实施例中益生菌的耐酸和耐胆盐结果示意图；
图5是本发明一实施例中罗伊氏乳杆菌Yyg-24 48h生长曲线的示意图；
图6是本发明一实施例中罗伊氏乳杆菌Yyg-24的耐酸耐胆盐结果的示意图；
图7是罗伊氏乳杆菌同源性的系统发育树图；
图8是罗伊氏乳杆菌菌落图。
具体实施方式
本发明提供了一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，所述罗伊氏乳杆菌的pheS基因序列如SEQ ID No.2所示；并提供一株罗伊氏乳杆菌菌株，其命名为Yyg-24，其保藏编号为CGMCC NO.12566。本发明还涉及由上述罗伊氏乳杆菌制备的产品及上述罗伊氏乳杆菌的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为抗TGEV罗伊氏乳杆菌的筛选，其包括以下步骤：
1.粪样采集
采集上海市航头镇某猪场断奶仔猪新鲜粪样，放入冷藏盒中，带回分离筛选备用。
2.菌株的分离纯化
称取粪样5g加入45mL灭菌生理盐水中，充分混匀，取1mL混悬液加入9mL的无菌生理盐水中，十倍稀释至10-5、10-6、10-7，取0.1mL涂布于MRS固体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，无水乙酸钠5g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.19g，吐温80 1mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6.5)，每个稀释度三个重复，37℃厌氧培养48h，挑取单个菌落划线厌氧纯化培养。48h后，将纯化后的菌落进行过氧化氢试验和革兰氏染色镜检，其中过氧化氢试验阴性、革兰氏染色阳性的菌株，可以初步判定为乳酸菌，此时将对应的单个菌落接入灭菌的MRS液体培养基，37℃，培养24h，取菌液加入离心管，按照1：1的比例加入30％的甘油，混匀，-70℃冷冻保存备用。
3.抗TGEV益生菌株的初步筛选
将-70℃保存的猪肠道分离的甘油管中的益生菌进行活化，将活化好的细菌进行计数，调整细菌数目为108cfu/mL。将各菌株(108cfu/mL)及其代谢产物与100TCID50/0.1mL(用Reed-Muench法测定TGEV的半数组织感染量TCID50)TGEV等量混合，然后置于37℃培养箱中培养90min，4000r/min离心10min，取上清液加入96孔培养板中，再次在培养箱中培养90min，弃混合液，更换正常细胞维持液，继续培养。每个菌株做三个平行孔，同时设正常细胞对照组及病毒对照组。病毒抑制率＝((益生菌处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均0D值－病毒对照组平均0D值))×100％。
L1至L60表示分离了得到的60株益生菌，其分别使用分离得到的每株益生菌做实验，观察其对TGEV的抑制能力，根据对TGEV的抑制率做图，结果图1至图3所示，具有较好的抗TGEV益生菌株的初步筛选结果为L7、L15、L28、L33、L44、L50、L57，为了选择较好的益生菌，对该七组的益生菌进行耐酸、耐胆盐试验。
4.耐酸、耐胆盐试验
(1)耐酸试验
将益生菌菌株在液体培养基中活化2代，调整菌液浓度至108cfu/mL左右。取1％的菌液接种于用盐酸调节至pH 2.0的液体培养基中，以正常培养基为对照，37℃培养120min，培养前后分别进行平板计数，计算各组的菌株存活数。
(2)耐胆盐试验
将0.3％(w/v)的猪胆盐添加在MRS液体培养基中，以正常培养基为对照，接种5％(V/V)已活化的菌种，方法同上，处理4h后计算菌株存活数。
由步骤3(图1-3)中分离得到的具有较好的抗TGEV能力的L7、L15、L28、L33、L44、L50和L57这7株菌株进行了耐酸和耐胆盐实验，其结果见图4，经耐酸、耐胆盐试验，试验发现L28和L50两株益生菌比较好。
5.L28和L50两株菌的生化鉴定
对L28和L50两株菌进行染色，经电镜观察为革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状，单个无规则排列；该菌菌落灰白色，边缘不整齐，不透明；硝酸盐还原试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、不液化明胶，不产生硫化氢，无运动性。菌株糖发酵反应如下表。
种名 L28 L50
阿拉伯糖 + +
苦杏仁苷 - -
纤维二塘 - -
七叶苷 - -
果糖 + +
半乳糖 + +
葡萄糖 + +
乳糖 + +
麦芽糖 + +
甘露醇 - -
甘露糖 - -
蜜二糖 + +
棉子糖 + +
L-鼠李糖 - -
D-核糖 + +
水杨苷 - -
山梨醇 - -
蔗糖 + +
海藻糖 - -
D-木糖 - -
发酵葡萄糖产气 + +
精氨酸产氨 + +
依据这2株菌的生化实验及糖发酵试验结果，同时参见《伯杰细菌鉴定手册》，最终鉴定这两株菌为罗伊氏乳杆菌，图7为罗伊氏乳杆菌同源性的系统发育树图，由此图可以看出，罗伊氏乳杆菌独树一支，确定为罗伊氏乳杆菌；图8为罗伊氏乳杆菌菌落图。
6.分子鉴定结果
设计特异性引物，其引物序列如下所示：
16S rDNA基因序列的引物序列：
Sense Primer：5'-GGCTTTGGCTATCACTCTG-3'(SEQ ID No.3)
Anti-sense Primer：5'-CGTTTACGGCATGGACTA-3'(SEQ ID No.4)
pheS基因序列的引物序列：
Sense Primer：5'-TATGTTACGCCATCTGTT-3'(SEQ ID No.5)
Anti-sense Primer：5'-CAAATTGCACAACCCTTA-3'(SEQ ID No.6)
用PCR扩增后对该菌的16SrRNA基因序列和pheS基因序列测定，与基因库的标准菌比对，结果显示该两株菌均为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。所述抗TGEV的罗伊氏乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述抗TGEV的罗伊氏乳杆菌的pheS基因序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
实施例2
本实施例为在实施例1的基础上进行抗TGEV罗伊氏乳杆菌菌株Yyg-24的筛选。
本实施例采用甲基磺酸乙酯诱变获得高产菌，其步骤包括：
将分离得到的较好的两株罗伊氏乳杆菌L28和L50接于MRS于37℃培养16h，调单细胞菌悬液浓度为106cfu/mL，取10mL菌液加入甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfone，EMS)，使EMS终浓度为0.5％，37℃水浴处理30min，间歇震荡；到达预定时间后，加入等体积的2％的NaS2O3中和EMS。进行10倍梯度稀释，取105稀释梯度涂布50uL于MRS培养基的平皿上，两株菌共涂平皿80个。37℃培养48小时。
将诱变后的罗伊氏乳杆菌用接种环接于液体MRS中，37℃培养24小时。调整细菌数目为108cfu/mL，将各菌株，及其代谢产物与100TCID50/0.1mL TGEV等量混合进行抗病毒实验，操作见上诉。结果获得一株超级抗TGEV的诱变菌株，病毒抑制率达到92％，将此菌株每隔四天传代一次，共传十代，分别比较每代菌株及上清液的病毒抑制能力，确定所获得菌株的稳定性，将此菌株命名为Yyg-24。
实施例3
本实施例为罗伊氏乳杆菌Yyg-24的生长状况验证，其结果由罗伊氏乳杆菌Yyg-24生长曲线表示，其根据罗伊氏乳杆菌Yyg-24每小时生长对应的OD600的吸光度值做的曲线，反应的是该菌的生长状况。
接1％罗伊氏乳杆菌Yyg-24于新鲜MRS培养基中，37℃静置培养48h，每小时测量OD600值变化。生长曲线如图5所示，图5为本发明罗伊氏乳杆菌Yyg-24 48h生长曲线的示意图；罗伊氏乳杆菌Yyg-24于第3小时开始进入对数期，第36h后吸光度就会呈现下降趋势，进入衰退期。
实施例4
本实施例为罗伊氏乳杆菌Yyg-24的耐酸、耐胆盐试验。
1.耐酸试验
将罗伊氏乳杆菌Yyg-24在液体培养基中培养，调整菌液浓度至108cfu/mL左右。取1％的菌液接种于用盐酸调节至pH 2.0的液体培养基中，以L28为对照，37℃培养120min，培养前后分别进行平板计数，计算各组的菌株存活数。
2.耐胆盐试验
将0.3％(w/v)的猪胆盐添加在MRS液体培养基中，以L28为对照，接种5％(V/V)已活化的菌种，方法同上，处理4h后计算菌株存活数。结果见图6，诱导后的罗伊氏乳杆菌Yyg-24的耐酸耐胆盐均进一步提高。
实施例5
本实施例为罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌的抑菌试验。
罗伊氏乳杆菌Yyg-24经培养24后，10000r/min离心10min，取上清液对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌进行抑菌实验。抑菌实验每个平板加致病菌100uL进行涂板，使用牛津杯进行加样，每孔加样品200uL，每种致病菌做2个平行，样品加入后在4℃冰箱扩散1h，然后置于37℃培养箱中培养8h。罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌的抑菌结果如下表所示：
注：牛津杯直径7.8mm；
说明：本表为罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌的抑菌结果，其中牛津杯直径为7.8mm，共进行8个平行试验，由上述可以看出Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用。
实验结果表明，罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵上清对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果。同时在本实验中排除了酸和过氧化氢的抑菌性，经推测可能是罗伊氏乳杆菌Yyg-24发酵产生的一些细菌素对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌有抑制效果。
由上述实施例可知，本发明提供一种可以有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌的抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，弥补了现有技术的空白。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海源耀生物股份有限公司
<120> 一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌及其应用
<130> IPI184300
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 988
<212> DNA
<213> 16Sr DNA的核苷酸序列(Lactobacillus reuteri)
<400> 1
gggggagtgc tatacatgca gtcgtacgca ctggcccaac tgattgatgg tgcttgcacc 60
tgattgacga tggatcacca gtgagtggcg gacgggtgag taacacgtag gtaacctgcc 120
ccggagcggg ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac aaaagccaca 180
tggcttttgt ttgaaagatg gctttggcta tcactctggg atggacctgc ggtgcattag 240
ctagttggta aggtaacggc ttaccaaggc gatgatgcat agccgagttg agagactgat 300
cggccacaat ggaactgaga cacggtccat actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360
tccacaatgg gcgcaagcct gatggagcaa caccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc 420
gtaaagctct gttgttggag aagaacgtgc gtgagagtaa ctgttcacgc agtgacggta 480
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acagtggaac tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720
aaggcggctg tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct aggtgttgga gggtttccgc 840
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<210> 2
<211> 453
<212> DNA
<213> pheS的核苷酸序列(Lactobacillus reuteri)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 16S rDNA基因序列 Sense Primer(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 18
<212> DNA
<213> 16S rDNA基因序列 Anti-sense Primer(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> pheS基因序列 Sense Primer(Artificial Sequence)
<400> 5
tatgttacgc catctgtt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> pheS基因序列 Anti-sense Primer(Artificial Sequence)
<400> 6
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Claims (10)

1.一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，所述罗伊氏乳杆菌的pheS基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌菌株命名为Yyg-24，其保藏编号为CGMCC NO.12566。
3.根据权利要求1所述的一种抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，用于扩增所述16SrDNA基因序列的引物序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示；用于扩增所述pheS基因序列的引物序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求2所述的抗TGEV的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌菌株的单菌落在培养基上为灰白色，不透明，边缘不整齐，经电镜观察为革兰氏染色呈阳性，菌体细胞呈杆状，单个无规则排列；硝酸盐还原试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、不液化明胶，不产生硫化氢，无运动性。
5.一种由权利要求1～4中任一项所述的抗TGEV的罗伊氏乳杆菌制备的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品。
6.根据权利要求5所述的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品，其特征在于，所述预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品包括罗伊氏乳杆菌菌剂、罗伊氏乳杆菌肠道功能调节剂、罗伊氏乳杆菌药用组合物。
7.根据权利要求6所述的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌菌剂的活性成分包括罗伊氏乳杆菌的发酵培养物、罗伊氏乳杆菌细胞的超声裂解上清、罗伊氏乳杆菌细胞的超声裂解沉淀中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌菌剂的制备包括如下步骤：
(1)菌株活化：将罗伊氏乳杆菌甘油管接种于120mL新鲜液体MRS培养基中，于37℃静置培养24小时，培养结束后菌浓在2×109-6×109cfu/mL之间；
(2)发酵菌剂制备：将步骤(1)的活化菌株罗伊氏乳杆菌接种于液体培养基中，接种至溶液浓度中菌浓为105-106cfu/mL，静置培养，温度为37℃，培养24小时；收集含菌体的培养液制得罗伊氏乳杆菌菌剂。
9.根据权利要求6所述的预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品，其特征在于，所述预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品能抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄菌，且能抗TGEV病毒。
10.一种如权利要求1～4中任一项所述的抗TGEV的罗伊氏乳杆菌在制备用于预防和治疗仔猪病毒性腹泻的产品中的应用。
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