CN108486004A - 一株抑制pedv黏附的乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株抑制PEDV黏附的乳杆菌，属于生物高技术领域。该菌株NAU2015807129分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，2017年3月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.13934。该菌株是农业部允许使用的饲用益生菌，能够通过发酵技术生产成猪的益生菌添加剂，以期用于猪流行性腹泻的防治。利用本发明的抑制PEDV黏附菌株NAU2015807129可以制备成药物或食品添加剂，可用于猪流行性腹泻的预防和治疗，具有很大的应用价值。

Description

一株抑制PEDV黏附的乳杆菌

技术领域

本发明涉及一株抑制PEDV黏附的乳杆菌NAU2015807129，属于生物高技术领域，涉及具有耐酸耐胆盐能力、黏附能力和抑制PEDV黏附作用的乳杆菌的分离、鉴定及筛选方法，并使用发酵技术对该菌扩大培养，利用生物防治的方法防治猪流行性腹泻，适用于制备具有防治猪流行性腹泻功能的益生菌制剂。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种急性、接触性、高度接触性肠道传染病。该病仅发生于猪，无品种差异。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤其以哺乳仔猪最易感且病死率高。母猪的发病率在15％～90％。7日龄以内仔猪越小，症状越重，发生腹泻后2～4天脱水死亡，死亡率高达70％～100％；7日龄以上仔猪持续3～4天腹泻后可能会死于脱水，死亡率为50％～90％；育肥猪死亡率为1％～3％；成年猪感染后一般经4～5天即可康复。我国从每年11月至翌年4月为此病的高发期。主要经消化道传播，粪口途径是主要的传播途径。病毒主要在猪空肠中后段、回肠、盲肠黏膜绒毛柱状上皮细胞内复制、增殖，由于病毒增殖首先造成细胞器的损伤，继而出现细细胞功能障碍，并破坏肠黏膜柱状上皮细胞，引起肠绒毛裸露、断裂、融合及肠上皮细胞内各种酶类活性降低或缺乏。组织病理学检查发现，小肠内微绒毛萎缩，形状由立方形变成矮柱状，刷状缘模糊不清；绒毛高度与隐窝深度比显著下降，微绒毛大量脱落；黏膜固有层有大量淋巴细胞、嗜酸性细胞和中性粒细胞浸润，有时可见充血和水肿。主要临诊症状为育肥猪、保育猪和母猪表现呕吐、水样腹泻，粪便呈水泥浆样或黄色。保育猪消瘦，体表沾满稀粪，多扎堆取暖；产房母猪常出现乳房萎缩，少乳和无乳奶水不足；哺乳仔猪最早出生后12小时内就出现呕吐，随后开始腹泻，粪便呈黄、棕、白等色，多数因深度脱水而死死亡；耐过猪一般成为僵猪或弱仔。剖检感染猪发现小肠道膨胀，充满黄色水样内容物，有时还含有未消化凝乳块，肠壁变薄变透明，肠系膜淋巴结有时肿大。

PED发现至今有40多年历史，1971年首次在英国暴发，但未查明病原。直至1977年才证实，比利时和英国发生的是猪流行性腹泻。之后PED相继在比利时、德国、匈牙利、瑞士等许多欧洲国家发生过暴发流行；20世纪80年代，日本、韩国、中国等一些亚洲国家也暴发了该病；2007年泰国发生PED，并蔓延全国；2013年首次在美国报道了此病的流行，同年古巴也报道有此病流行。此病在世界范围内逐渐蔓延，对全球的养猪业都产生极大危害，造成严重的经济损失。该病由于发病日龄小、发病急、病死率高，疫苗免疫接种是目前防治PED的主要措施。现行的疫苗大多是通过给母猪预防注射，依靠初乳中的特异性抗体给仔猪提供保护。但由于近几年PED的流行特点和发病情况发生很大的变化，单用疫苗显然效果不稳定，给防治工作带来了许多困难。

益生菌是指含有生理活性的活菌，或含有其组分和代谢产物的死菌，当被机体经过口服或其他给药方式摄入适当数量后，能够改善机体正常的微生物菌群平衡，从而发挥有益作用。乳杆菌(如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等)、双歧杆菌(如长双歧杆菌、短双歧杆菌等)、革兰氏阳性球菌(如粪肠球菌、乳肠球菌等)和一些酵母菌都可归入益生菌的范畴。益生菌具有提高机体特异性免疫与非特异性免疫能力，能增加优势菌群数量，抑制部分病原菌生长，维持肠道菌群平衡，并由此引发对机体的整体效果。临床上，益生菌制品主要用于防治腹泻、痢疾、肠炎、肝硬化、便秘、消化功能紊乱等疾病。随着对益生菌研究的深入，人们渐渐发现其在菌抑制致病菌和病毒方面的功能，早期关于益生菌抗病毒作用的研究主要集中在人医领域，包括对流感、轮状病毒(RV)腹泻、艾滋病(HIV)及其伴发病的防治上。随着研究的进展，更多的抗病毒菌株陆续被发现，同时在兽医领域也有了长足的发展，至今益生菌抗病毒研究范围已扩展到抗禽流感(H1N1)、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒 (NDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)等多种病毒。关于益生菌抗病毒作用的机制研究，已经初步取得一些进展，目前认为益生菌可通过受体封闭、调节宿主细胞代谢、增强机体免疫功能等方面发挥抗病毒活性。

综上所述，选择乳杆菌这种动物肠道中的优势菌群，从健康断奶仔猪的粪便中分离、鉴定、筛选具有耐酸耐胆盐能力、黏附能力和抑制PEDV黏附作用的乳杆菌为益生菌菌种。同时发挥出乳杆菌抑制PEDV黏附的功能和其作为益生菌固有的生物学活性(增加优势菌群数量、提高机体免疫力、促进营养物质转化吸等)，为PED的防治提供了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够抑制PEDV黏附的乳杆菌，通过发酵技术生产成猪的益生菌添加剂，以期用于猪流行性腹泻的防治。

本发明的另一目的在于提供上述菌株在防治猪流行性腹泻病毒中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供一株抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)黏附的乳杆菌，该菌株NAU2015807129分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，2017年3月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.13934。

本发明具有综合性能的菌株，该菌株能够抑制PEDV黏附、对IPEC-J2细胞有良好的黏附性、具有耐酸和胆盐能力、对抗生素敏感、对小白鼠无毒性；通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合16s rDNA序列测定并进行比对分析，最终确定该菌株为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

主要生物学特性：

本发明的罗伊氏乳杆菌NAU2015807129在MRS培养基上37℃培养18～24h后，长出乳白色、扁平、表面光滑、直径2毫米左右、边缘粗糙的菌落；显微镜下观察，为G+，菌体呈短杆状，大小(4～6)微米*(1.0～1.5)微米，链状排列、无芽孢；该菌株16S rDNA的区域具有序列1所示的碱基序列，Genbank登陆号KY863554，与Genbank中参照菌株(罗伊氏乳杆菌)同一区域碱基序列同源性均达到99％。

本发明的另一目的是提供一种筛选具有良好综合性能抑制PEDV黏附的罗伊氏乳杆菌 NAU2015807129的方法。该方法具体包括以下步骤：

(1)从约45日龄健康断奶仔猪的粪便中分离出乳杆菌；

(2)通过体外检测菌株耐酸、耐胆盐能力和黏附能力；

(3)使用猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)为模型，通过检测菌株对PEDV的抑制率，证明该菌株能够抑制PEDV在猪肠道上皮细胞的黏附。

本发明的第三目的在于开发罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的应用，用于制备具有防治猪流行性腹泻功能的益生菌制剂。

一种用于防治猪流行性腹泻的益生菌制剂，该益生菌制剂中含有上述的罗伊氏乳杆菌NAU2015807129。优选的，上述的罗伊氏乳杆菌NAU2015807129在益生菌制剂中的含量不低于1.0×10⁸CFU/g或1.0×10⁸CFU/ml。

本发明的有益效果：

本发明提供了抑制PEDV黏附菌株NAU2015807129。该菌株在IPEC-J2细胞上对PEDV的病毒抑制率达到78.03％。

体外模拟胃肠道环境发现，罗伊氏乳杆菌NAU2015807129在pH 2.5条件下处理2h后活菌数为10^8.01CFU/mL，存活率高达91.42％；在0.3％的胆盐环境中处理2h后活菌数为10^7.37CFU/mL，存活率达20.68％；罗伊氏乳杆菌NAU2015807129与IPEC-J2细胞混合培养2h后，黏附到细胞上的益生菌数量达10^6.23CFU/mL，黏附率达1.72％。

选择不同类型的抗生素，对罗伊氏乳杆菌NAU2015807129进行耐药性试验，结果表明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对大部分抗生素无耐药性。

本发明中涉及的乳杆菌为罗伊氏乳杆菌，是农业部允许的可直接用于饲喂的益生菌，同时小鼠体内急性毒性试验也证明，罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对小鼠无急性毒性。

本发明还提供了抑制PEDV黏附菌株NAU2015807129的发酵方法，培养物中的活菌数量达到1.2×10¹¹CFU/mL。培养物中大量的活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等有益微生物生理代谢物质，可调节动物胃肠道菌群，拮抗病原微生物，提高机体免疫力和抗病力，促进营养物质的转化和吸收，提高生产性能。

利用本发明的抑制PEDV黏附菌株NAU2015807129可以制备成药物或食品添加剂，可用于猪流行性腹泻的预防和治疗。

附图说明

图1为本发明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129菌落的形态图。

图2为本发明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129菌株的形态图(革兰氏染色，1000×)。

图3为本发明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的16s rDNA的电泳鉴定图。

其中：M为DNA marker(2000)；7为阴性对照；1为NAU2015807129的PCR产物

具体实施方式

本发明提供具有很强的耐酸耐胆盐能力、对小肠上皮细胞黏附能力强、够抑制猪流行性腹泻病毒黏附的罗伊氏乳杆菌NAU2015807129；通过动物实验证实对小鼠无毒性。

为了获得所述罗伊氏乳杆菌NAU2015807129，本发明提供了一种制备这种乳杆菌的方法，具体而言，它采用下述步骤制得：(1)从约45日龄健康断奶仔猪的粪便中分离出乳杆菌，并通过常规鉴定方法和16s rDNA序列分析法鉴定该乳杆菌；(2)通过体外检测该菌株的耐酸、耐胆盐能力和黏附能力；(3)使用猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)为模型，通过检测菌株对PEDV的抑制率，证明该菌株能够抑制PEDV在猪肠道上皮细胞的黏附；(4) 通过体外检测该菌株抗药性、对小鼠的安全性并使用发酵的方法扩大培养。

实施例1：猪源乳杆菌的分离与鉴定

1.样本采集

动物粪便采集于某实验动物中心动物房，45日龄左右健康仔猪。用无菌棉拭子采集猪群30～60min内的新鲜粪样，装于封口袋中，立即放入冰盒中送回实验室，每间猪舍随机采样5份，4间猪舍采集粪样共计20份。所有的仔猪在近期均没有发生腹泻性疾病，没有使用过抗生素或含有抗生素的饲料，也没有使用含益生菌的饲料添加剂。采取样品送至实验室后4℃保存，4h内完成细菌的分离。

2.培养基

乳杆菌选择性培养基(MRS-万古霉素固体培养基)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.2g， MnSO₄·4H₂O0.05g，K₂HPO₄ 2g，琼脂20g，水1000mL，调节pH＝6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用。待温度降至45℃时加入盐酸万古霉素(上海源叶生物科技有限公司)，使其最终浓度达到20mg/L。

MRS固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g，K₂HPO₄ 2g，琼脂20g，水1000mL，调节pH＝6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用。

3.乳杆菌的分离和纯化

在10mL的试管中称取0.5g粪便，然后加入灭菌生理盐水4.5mL，充分混匀，稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7的稀释液。

从冰箱取出MRS-万古霉素固体培养基恢复至室温，取100uL粪便稀释液均匀涂布在平板上，每个样品做三个重复。之后在37℃温箱中培养，定期观察，约48h后可见大量菌落生长。挑取具有不同特征的菌落再次传代，然后涂片对菌株进行革兰氏染色，再通过氧化氢酶试验检测触媒活性。

挑选出革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的细菌作为后续筛选的菌株。得到的菌株可以在含有甘油的保存液中于-20℃冰箱长期保存。

4.罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的鉴定

(1)常规形态学鉴定

从菌落和菌体两方面进行形态学观察，37℃培养24h后，观察菌落特征；镜检观察染色后菌体的形态。观察到乳白色、扁平、表面光滑、直径2毫米左右、边缘粗糙的菌落 (见图1)；显微镜下观察，为G+，菌体呈短杆状，大小(4～6)微米*(1.0～1.5)微米，链状排列、无芽孢(见图2)，结果与罗伊氏乳杆菌相符。

(2)16s rDNA序列测定进行菌株的鉴定

引物：采用16S rDNA基因的通用引物，将引物浓度稀释至20μmol/L，-20℃保存。引物的序列、位置及扩增片段大小见表1。

表1 PCR使用的引物序列

Table 1 Sequence of primers used for PCR

模板：将筛选出的菌株按5％(v/v)接种量接种到MRS液体培养基，传代3次，是菌株充分活化，取最后一次培养的菌液作为模板。

PCR反应体系组成(50μL)：取一洁净薄壁PCR管，采用总量50μL的反应体系，各试剂用量见表2，阴性对照时用无菌水代替菌液。

表2 PCR反应体系

Table 2 The PCR reaction system

PCR反应条件：94℃预变性变性5min；94℃解链30s，52℃退火30s，72℃延伸90s循环32次；72℃10min。

PCR扩增产物检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的产物，加样后开始电泳。电泳条件，电压80V(5V/cm)，时间20min，结束后拍照，可见大小约为1500bp的目的条带 (见图3)。

将扩增产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序。将序列导入美国NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blastn在线软件比对。

表3 16S序列分析结果

Table 3 Analysis of the 16S rDNA sequence

注：参照序列来自GeneBank数据库

该菌株的16S rDNA区域具有序列1所示的碱基序列，该序列GenBank登录号KY863554，与已经发表的罗伊氏乳杆菌株序列比对，相似性为99％，表明本研究分离所得菌株为罗伊氏乳杆菌。

该菌株NAU2015807129分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，2017年3月 27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号CGMCC No.13934。

实施例2：罗伊氏乳杆菌NAU2015807129耐酸、耐胆盐、黏附能力试验

1.耐酸试验

将试验菌株按5％(v/v)接种量接种在MRS液体培养基中，活化2到3代以保证菌株高活性。将活化好的菌液按1％(v/v)接种量接入用盐酸酸化到分别为pH 1.5、pH 2.0和 pH2.5的液体培养基和未酸化的培养基中(作为对照)，37℃处理2h，之后将样品稀释不同的梯度，用琼脂平板倾注法测定菌落总数，对比处理前后活菌数的变化。每个实验重复三次。

表4 NAU2015807129在不同pH的MRS中培养2h的生长情况(平均值±标准差)

Table 4 Survival analysis of NAU2015807129in MRS with different pH(Means±SD，n＝3)

注：同行字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同者表示差异不显著

The different letters in the Figure represent significant different(P<0.05)

结果如表4所示，罗伊氏乳杆菌NAU2015807129分别接种到pH值为2.5、2.0和1.5的MRS培养基2h后活菌数量分别为10^8.01、10^7.92、10^4.96CFU·mL^－1，存活率分别为91.42％、74.56％、0.08％。表明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对酸的耐受力很强。

2.耐胆盐试验

将试验菌株按5％(v/v)接种量接种在MRS液体培养基中，活化2到3代以保证菌株高活性。将最后1次活化好的菌液按1％(v/v)接种量接种于含胆汁的液体培养基中(0.3％和0.5％猪胆盐)，同时1％接种于不含胆汁的培养基中作为对照。37℃条件下处理 2h，之后将样品稀释不同的梯度，用琼脂平板倾注法测定菌落总数，然后对比处理前后活菌数的变化。每个实验重复三次。

表5 NAU2015807129在胆盐培养基中的生长情况(平均值±标准差)

Table.5 Survival analysis of NAU2015807129in bile salt MRS medium(Means±SD，n＝3)

注：同行字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同者表示差异不显著

The different letters in the Figure represent significant different(P<0.05)

结果如表5所示，罗伊氏乳杆菌NAU2015807129分别接种到胆盐浓度为0.3％和0.5％的MRS培养基2h后活菌数量分别为10^7.37、10^6.87CFU·mL^－1，存活率分别为20.68％、6.56％。表明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对胆盐的耐受性很强。

3.黏附试验

将长成单层的IPEC-J2细胞模拟肠道上皮细胞作为乳杆菌黏附的细胞，IPEC-J2细胞接种到12孔培养板中，接种量为每孔2.0×10⁵个，培养48h长成单层。将处理好的菌体和DMEM/F12细胞培养液重混合，调整菌液浓度1×10⁸CFU/mL。长成单层的12孔细胞培养板PBS洗2次，加入1mL乳杆菌-DMEM/F12混合液，将12孔细胞培养板在5％CO₂培养箱中37℃培养2h，之后将混合液移除，用PBS清洗3次除去未黏附的乳杆菌。为了测定全部黏附细菌的数量，使用含有0.05％Triton X-100的PBS，吹打多次将细胞完全破坏，然后收及裂解液，稀释后通过平板倾倒法计算活菌数。每个实验重复三次。

表6 NAU2015807129对IPEC-J2细胞黏附试验(平均值±标准差)

Table 6 Adhesion assay of NAU2015807129in IPEC-J2(Means±SD，n＝3)

结果如表6所示，总量为10⁸CFU/mL罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的IPEC-J2细胞混合培养2h后，黏附到细胞上的益生菌活菌数量为10^6.23CFU·mL^－1，黏附率为1.72％。表明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对猪肠道上皮细胞黏附能力良好。

实施例3：罗伊氏乳杆菌NAU2015807129抑制PEDV黏附试验

本试验以vero细胞扩繁PEDV，使用100TCID₅₀的攻击计量感染IPEC-J2细胞。

96孔板上培养IPEC-J2细胞，待细胞融合至单层后，弃去培养基，用灭菌PBS洗涤一次，然后进行如下试验，试验分三种处理如下：

(1)组1预防组。预先将浓度为1×10⁸CFU/mL的菌液0.1mL加入细胞处理1.5h，彻底洗去，再加入滴度为100倍TCID₅₀/0.1mL的PEDV病毒0.1mL处理1.5h，彻底洗去后 37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，每个样品4个重复。

(2)组2修复组。预先将滴度为100倍TCID₅₀/0.1mL的PEDV病毒0.1mL加入细胞处理1.5h，彻底洗去，再加浓度为1×10⁸CFU/mL的菌液0.1mL处理1.5h，彻底洗去后 37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，每个样品4个重复。

(3)组3竞争组。将浓度为1×10⁸CFU/mL的菌液和滴度为100倍TCID50/0.1mL的PEDV病毒等体积混合1.5h后，取0.1mL加入细胞，1.5h彻底洗去后37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，每个样品4个重复

为了减小试验的偶然误差，提高结果的统计学意义，试验做4个重复，包括空白对照和病毒对照组。试验后定期观察，当病毒对照组细胞病变达到60％～80％时，可使用MTT方法检测定各细胞孔的OD值，然后通过公式计算病毒抑制率。

表7 NAU2015807129不同接入顺序抗PEDV活性比较(平均值±标准差)

Table 7 Different subsequence of NAU2015807129 on the comparison ofanti-PEDV activity

(Means±SD，n＝4)

注：同行字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同者表示差异不显著

The different letters in the Figure represent significant different(P<0.05)

结果表明(表7)罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对病毒的抑制率在预防组最强(78.03％)，其次是竞争组(62.76％)，修复组对病毒的抑制率也达到45.26％。说明罗伊氏乳杆菌NAU2015807129具有显著的抗病毒活性。

实施例4：罗伊氏乳杆菌NAU2015807129药敏试验

选择不同类型的抗生素，对罗伊氏乳杆菌NAU2015807129进行耐药性试验，结果表明(表8)罗伊氏乳杆菌NAU2015807129对大部分抗生素无耐药性，且对抗革兰氏阳性菌的抗生素非常敏感。

表8 NAU2015807129药敏试验

Table 8 Drug sensitivity test of NAU2015807129

实施例5：罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的急性毒性试验

为了检测罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的安全性，使用固定计量法进行小鼠的急性毒性试验。该方法1984年由英国毒理学会提出，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性反应作为终点进行评价。本试验选用标准中最高计量2000mg/Kg的固定计量进行试验，试验动物选用健康的昆明小鼠10只，体重25±2g，雌雄各半。从-70℃超低温冰箱中取出 20％(v/v)甘油中保存的菌种，快速解冻后，接种MRS平板。传代3次，进行活化。然后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，调整菌液的活菌数达到10¹⁰CFU/mL。实验动物禁食6～12h后，每只灌胃0.5mL菌液，再禁食3～4h后正常饲养。之后观察2周，每天至少观察2次。

给受试物后2周内小鼠未死亡，没有不适症状，皮肤、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现正常。在2周后处死实验动物进行尸检，尸检发现各器官均未见任何异常。试验结果证明，罗伊氏乳杆菌NAU2015807129无严重急性毒性的危险性。

实施例6：罗伊氏乳杆菌NAU2015807129的扩大培养

1.培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1mL，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g，定容至1L，调节pH 6.2～6.4；115℃，灭菌20min后备用。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨400g，酵母膏200g，葡萄糖400，定容至15L，调节pH 6.2～6.4，115℃灭菌20min。

2.培养条件

菌种活化：从-70℃超低温冰箱中取出20％(v/v)甘油中保存的菌种，快速解冻后，接种MRS平板。传代3次，进行活化。

一级种子培养：用250mL锥形瓶在摇床上培养，装50mL种子培养基，将活化后的罗伊氏乳杆菌NAU2015807129接入种子培养基中，37℃，150rpm摇床培养24小时。

二级种子培养：用1L锥形瓶在要床上培养，装500mL种子培养基，按5％接种量加入一级种子培养液，37℃，150rpm摇床培养24小时。

发酵罐培养：30L全自动搅拌发酵罐装入发酵培养基20L，实消后按5％接种量加入二级种子培养液。设定参数：温度37℃，pH 6.2，溶氧80％，培养48h。

3.发酵结果

发酵结束后，用平板倾倒法检测培养物中的活菌数量，结果表明培养物中的活菌数量达到1.2×10¹¹CFU/mL。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一株抑制PEDV黏附的乳杆菌

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)

<400> 1

tcctcctaat ggttaggcca ccgactttgg gcgttaaaac tcccatggtg tgacgggcgg 60

tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt 120

ccgacttcgt gtaggcgagt tgcagcctac agtccgaact gagaacggct ttaagagatt 180

agcttactct cgcgagcttg cgactcgttg taccgtccat tgtagcacgt gtgtagccca 240

ggtcataagg ggcatgatga tctgacgtcg tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300

gtctcactag agtgcccaac ttaatgctgg caactagtaa caagggttgc gctcgttgcg 360

ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacgac catgcaccac ctgtcattgc 420

gtccccgaag ggaacgcctt atctctaagg ttagcgcaag atgtcaagac ctggtaaggt 480

tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt 540

cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctcc 600

ggcactgaag ggcggaaacc ctccaacacc tagcactcat cgtttacggc atggactacc 660

agggtatcta atcctgttcg ctacccatgc tttcgagcct cagcgtcagt tgcagaccag 720

acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg cattccaccg ctacacatgg 780

agttccactg tcctcttctg cactcaagtc gcccggtttc cgatgcactt cttcggttaa 840

gccgaaggct ttcacatcag acctaagcaa ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat 900

ccggataacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtgact 960

ttctggttgg ataccgtcac tgcgtgaaca gttactctca cgcacgttct tctccaacaa 1020

cagagcttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggt gttgctccat caggcttgcg 1080

cccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tatggaccgt gtctcagttc 1140

cattgtggcc gatcagtctc tcaactcggc tatgcatcat cgccttggta agccgttacc 1200

ttaccaacta gctaatgcac cgcaggtcca tcccagagtg atagccaaag ccatctttca 1260

aacaaaagcc atgtggcttt tgttgttatg cggtattagc atctgtttcc aaatgttatc 1320

ccccgctccg gggcaggtta cctacgtgtt actcacccgt ccgccactca ctggtgatcc 1380

atcgtcaatc aggtgcaagc accatcaatc agtgggccag tg 1422

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacgggtacc ttacgactt 19

Claims (5)

1.一株抑制猪流行性腹泻病毒黏附的乳杆菌，该菌株NAU2015807129分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，2017年3月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.13934。

2.权利要求1所述的乳杆菌在制备用于防治猪流行性腹泻的益生菌制剂中的应用。

3.一种用于防治猪流行性腹泻的益生菌制剂，其特征在于，该益生菌制剂中含有权利要求1所述的抑制猪流行性腹泻病毒黏附的乳杆菌。

4.根据权利要求3所述的用于防治猪流行性腹泻的益生菌制剂，其特征在于，权利要求1所述的抑制猪流行性腹泻病毒黏附的乳杆菌在益生菌制剂中的含量不低于1.0×10⁸CFU/g或1.0×10⁸CFU/ml。

5.如权利要求1所述抑制猪流行性腹泻病毒黏附的乳杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从40～50日龄健康断奶仔猪的粪便中分离出乳杆菌；

(2)通过体外检测菌株耐酸、耐胆盐能力和黏附能力；

(3)使用猪小肠上皮细胞为模型，通过检测菌株对PEDV的抑制率，证明该菌株能够抑制PEDV在猪肠道上皮细胞的黏附。