CN112175872B

CN112175872B - 一种鼠李糖乳杆菌及其制剂、应用

Info

Publication number: CN112175872B
Application number: CN202011081771.XA
Authority: CN
Inventors: 严贤城; 柯媛萍
Original assignee: Zhongke Meida Fujian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongke Meida Fujian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN112175872A

Abstract

本发明涉及了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌及其制剂，其在促进人体胃肠道消化方面的运用，在抑制细菌生长方面的应用，在食品方面的应用、在饲料方面的运用。所述鼠李糖乳杆菌具有良好的人工胃液以及人工肠液耐受性，能够有效抵抗胃肠液的影响，能够在通过消化道后依然维持较高活性。同时可提高体内的中低聚糖转化率，促进肠道中的短链脂肪酸的生成，可提高人体胃肠道的消化功能。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，也可以达到促进消化的效果。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002可以抑制细菌生长，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

Description

一种鼠李糖乳杆菌及其制剂、应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种鼠李糖乳杆菌及其制剂、应用。

背景技术

益生菌是肠道菌群中重要的组成部分，国际上对于益生菌公认的定义为：含有生理活性活菌或含有其组分和代谢物的死菌，其被机体经过口服或者皮肤粘膜或其他给药方式摄入后，能够改善机体正常的微生物群平衡、酶系统的平衡以及能够刺激机体特异性、非特异性免疫机制，最终能够提高机体定殖力及免疫力的一类微生物。

益生菌在我国的研究与利用起步较迟，在基础研究和开发利用方面与发达国家都存在一定的差距。许多益生菌诸如乳酸菌等的应用效果不理想。迫切需要开发新型有效的益生菌产品。母乳是婴儿最适宜的天然食物，有婴儿配方奶无法复制的特殊组分。有研究表明，婴儿每天从母乳中约获得10⁴～10⁸的细菌，这些细菌在胃肠道具有很强的抗消化性，作为先头兵在胃肠道定植下来，构成肠道微生物区系的组成部分。相比其它来源的益生菌，源于母乳中的益生菌具有更好的抗逆、抑菌、抗感染和保持肠道健康的作用。

而鼠李糖乳杆菌的耐消化道逆环境能力、抑菌特性是保证其能够通过人体胃肠液并发挥益生功能的关键因素。目前鼠李糖乳杆菌耐酸耐胆盐能力较低，通过消化道后不能维持较高的活性。因此，获得耐消化道逆环境能力强、具有较好抑菌特性的鼠李糖乳杆菌，成为目前益生菌产品生产者亟需解决的问题。

发明内容

为此，需要提供一种耐消化道抗逆环境能力强、具有较好抑菌、促消化特性的鼠李糖乳杆菌。

为达到本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,的鼠李糖乳杆菌ZK002。保藏日期为：2020年05月15日，分类命名：鼠李糖乳杆菌；拉丁名称：Lactobacillus rhamnosus。

为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19826的鼠李糖乳杆菌ZK002在促进人体胃肠道消化方面的运用。鼠李糖乳杆菌ZK002具有良好的人工胃液以及人工肠液耐受性，能够有效抵抗胃肠液的影响，能够在通过消化道后依然维持较高活性。同时可提高体内的中低聚糖转化率，促进肠道中的短链脂肪酸的生成，可提高人体胃肠道的消化功能。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，也可以达到促进消化的效果。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供了一种胃肠道促消化剂，所述胃肠道促消化剂中含有鼠李糖乳杆菌ZK002作为其有效成分。

优选的，所述胃肠道促消化剂中还含有动物双岐杆菌作为其有效成分。李糖乳杆菌ZK001对肠道中的益生菌动物双歧杆菌没有抑制效果。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19826的鼠李糖乳杆菌ZK002在抑制细菌生长方面的应用，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供了一种口服抑菌剂，所述口服抑菌剂中含有鼠李糖乳杆菌ZK002作为其有效成分。

为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19826的鼠李糖乳杆菌在制备食品或保健品方面的应用。

为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19826的鼠李糖乳杆菌在饲料方面的运用。

为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供了一种抑菌促消化饲料，所述抑菌促消化饲料中含有鼠李糖乳杆菌ZK002作为有效成分。

优选的，所述饲料中还含有动物双岐杆菌作为其有效成分。

区别于现有技术，上述技术方案提供了一种耐消化道抗逆环境能力强、具有较好抑菌、促消化特性的鼠李糖乳杆菌，其保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826。具有良好的人工胃液以及人工肠液耐受性，能够有效抵抗胃肠液的影响，能够在通过消化道后依然维持较高活性。同时可提高体内的中低聚糖转化率，促进肠道中的短链脂肪酸的生成，可提高人体胃肠道的消化功能。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，也可以达到促进消化的效果。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002可以抑制细菌生长，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。同时可提高体内的中低聚糖转化率，促进肠道中的短链脂肪酸的生成，可提高人体胃肠道的消化功能。

同时，鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，也可以达到促进消化的效果。同时，鼠李糖乳杆菌ZK002可以抑制细菌生长，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。

实施例1鼠李糖乳杆菌ZK002菌株的筛选与鉴定

取健康母乳10mL加到40mL缓冲蛋白胨液中，摇匀，在37℃下，静置培养48h；富集培养后，直接将未经稀释的样品划线于MRS改良培养基平板上。37℃培养48h(平板放入自封袋中)；挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于MRS改良培养基进行划线纯化培养，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。如镜下观察结果一致，则将得到的纯培养物(平皿菌落)作为疑似菌株，将对应平皿编号，待鉴定；如镜下观察结果不一致，则继续进行上述操作。将筛选出的菌株进行革兰氏染色、产气实验、过氧化氢酶实验，经过多次筛选和培育，得到鼠李糖乳杆菌ZK002，将菌株保存至甘油中，-20℃下冻存。

鼠李糖乳杆菌ZK002菌株的形态特征为：菌体呈杆状；在MRS平板培养基上培养24～48h后，菌落呈圆形，乳白色，凸起，边缘整齐，不透明。

实施例2筛选的鼠李糖乳杆菌ZK002耐消化道逆环境实验

2.1人工胃液耐受性实验

将传代三次活化后的鼠李糖乳杆菌ZK002种子液按照5％(v/v)的接种量，分别接种于pH＝2、2.5、3、4的人工模拟胃液中，同时以90％的生理盐水作为空白组，37℃培养，分别在15h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养48h后计数，结果见表1。

上述人工胃液，取20ml 1mol/L的盐酸，用NaOH调节pH至2、2.5、3、4，然后按1g/100ml加入胃蛋白酶，充分溶解后，将配制好的人工胃液过孔径为0.22μm的滤膜除菌备用。

人工胃液耐受性数据指标：

测得空白对照的活菌数用N0表示，其他pH条件下测得的活菌数用N表示，其人工胃液耐受性活菌数对数比率计算公式如下：

受试菌株工胃液耐受性活菌对数比率(％)＝lg CFU N/lg CFU N0×100％；

表1 ZK002在人工胃液耐受性试验数据表

由表1可知，ZK002菌株在pH3.0的条件下经过15h后，与空白对照相比活菌数稍有下降，但活菌对数值仍可达8.59，活菌数可达3.9×10⁸CFU/mL，活菌对数比率高达88.47％；在pH2.0条件下，活菌数低于空白对照，但活菌对数值仍可维持在7.60，活菌数可达4.0×10⁷CFU/mL，活菌对数比率高达78.27％；在pH4.0条件下，活菌对数值仍达到8.87，活菌数可达7.4×10⁸CFU/mL，活菌对数比率高达91.35％。

2.2人工肠液耐受性实验

活化后的鼠李糖乳杆菌ZK002按照5％(v/v)的接种量接种于人工肠液中，同时设置90％的生理盐水为空白对照组，37℃培养，于0h、2h、4h、6h、8h取样，计活菌数，结果见表2。上述人工肠液，取KH₂PO₄ 0.27g，加蒸馏水20ml溶解，用1mol/L的NaOH调节pH至6.8，再按0.1g/L加入胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22μm的微孔膜过滤除菌，制得人工肠液备用。

如表2所示，鼠李糖乳杆菌ZK002在模拟肠液中处理8h存活状态良好，活菌数变化与空白组比较没有显著差异(p<0.05)，在人工肠液中暴露8h存活率超过100％。鼠李糖乳杆菌ZK002具有良好的人工肠液耐受性。

表2鼠李糖乳杆菌ZK002在人工肠液中存活状态(LOG(CFU/mL))

综上，说明该菌株具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。

实施例3筛选的鼠李糖乳杆菌ZK002抑菌功能特异性实验

指示菌株准备：取致病菌冻存管在37℃水浴锅中使其迅速溶化，按1％的接种量接种于适宜的液体培养基中，大肠杆菌/金黄色葡萄球菌/鼠伤寒沙门氏菌37℃恒温过夜培养；白色念珠菌培养28℃恒温摇床摇48h，转速100rpm；动物双岐杆菌37℃恒温厌氧培养。

制备固体培养基，将培养至对数期的致病菌稀释至菌液浓度为10⁶C FU/mL，取菌悬液100μL均匀涂布于固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有指示菌的平皿中，每个牛津杯中加入200μL浓度为10⁸CFU/mL的鼠李糖乳杆菌上清液。将平皿置于适宜温度的恒温培养箱中，培养适当时间后观察拍照，并用游标卡尺计量抑菌圈直径。

鼠李糖乳杆菌上清液的制备：将培养好的鼠李糖乳杆菌ZK002菌液1200g、4℃离心15min去菌体沉淀，上清液过0.22的微孔滤膜滤膜备用。

实验结果见表3。表3中采用牛津杯法，牛津杯内直径6mm，外直径8mm；使用受试菌株发酵液上清，分别进行5倍、8倍浓缩以及直接取原上清进行试验。

表3抑菌圈记录表

通过实验结果可以得出鼠李糖乳杆菌ZK002对肠道中的致病菌大肠杆菌/金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用；但对于白色念球菌没有抑制效果，多肠道中的益生菌双歧杆菌也没有抑制效果。

实施例4不同鼠李糖乳杆菌对小鼠粪便中短链脂肪酸浓度的影响

将鼠李糖乳杆菌ZK002,鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469分别接入MRS液体培养基中于37℃培养48h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。

取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠30只，随机分为3组，每组10只，3组分别为：空白组、灌胃鼠李糖乳杆菌ZK002菌悬液的ZK002组、灌胃鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌悬液的ATCC7469组、其中，ZK002组、ATCC7469组均为实验组。

实验共25天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌ZK002、ATCC7469菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃18天。

15天后，检测每只小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，结果见表4。

将粪便用生理盐水稀释与10％硫酸以25:1的体积比混合酸化后，加入4倍10％硫酸体积的乙醚振荡混匀以提取脂肪酸，得到提取液；将提取液于18000g的条件下离心15min后分离上层乙醚相，将上层乙醚相通过无水Na₂SO₄进行干燥后静置30min，继续于18000g的条件下离心5min，用GC-MS分析上层乙醚相中的各种短链脂肪酸。

表4不同组小鼠粪便中的短链脂肪酸的种类及含量

灌胃鼠李糖乳杆菌的小鼠粪便中的总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸的产量均普遍提高，以鼠李糖乳杆菌ZK002组提高幅度最大，而鼠李糖乳杆菌ATCC7469组粪便中总短链脂肪酸含量略少于ZK002组，较空白组也有大幅度提升。四类短链脂肪酸中丙酸的变化最为明显。

短链脂肪酸含量可以反映体内菌群活性及机体整体的健康状态，测定粪便中短链脂肪酸含量水平可以判断体内厌氧菌的变化，且短链脂肪酸能促进钠离子的吸收，维持肠道上皮细胞内外渗透压，促进细胞增殖和粘膜生长。

实施例5鼠李糖乳杆菌ZK002对不同低聚糖的利用能力

在MRS固体培养基的基础上，去掉配方中的葡萄糖与牛肉膏，以不添加任何糖作为空白对照，分别添加0.5％(m/v)的葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖以及低聚半乳糖作为碳源，并加入溴甲酚紫作为酸碱指示剂，得到无糖、含葡萄糖、含低聚果糖、含低聚木糖或含低聚半乳糖的固体培养基平板，备用。

将鼠李糖乳杆菌ZK002和鼠李糖乳杆菌ATCC7469分别接入MRS液体培养基中，于37℃培养48h，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至OD₆₀₀为0.5，获得菌液。

吸取10μL菌液分别点在上述固体培养基平板上，待菌液完全吸收后，于37℃倒置培养，12h后，观察固体培养基平板内的溴甲酚紫指示剂是否变黄，若变黄，则表明碳源被利用，若不变黄，说明碳源没被利用。结果如表5所示。

表5鼠李糖乳杆菌对不同低聚糖的利用能力

碳源	ZK002	ATCC7469
			空白	-	-
葡萄糖	+	+
			低聚果糖	+	+
低聚木糖	+	+
			低聚半乳糖	+	+

其中，+表示乳杆菌能利用该种碳源，-表示不能利用。

实施例6鼠李糖乳杆菌ZK002对小鼠肠道乳酸菌和大肠杆菌的影响

将鼠李糖乳杆菌ZK002，鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469分别接入MRS液体培养基中于37℃培养48h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中，获得菌悬液，将液于-80℃下保存待用。

进行两天预饲后进行实验，每天进行自由饮水，并在每只小鼠3g的饲料的基础上对小鼠进行灌胃，计量为0.2ml，其中空白组灌胃生理盐水。灌胃15天后采用脱颈法处死，在无菌条件下将小鼠进行解剖，拨离肠道并采取肠道内容物，剪碎，放入玻璃容器中，加入灭菌的生理盐水后进行匀浆，放入恒温震荡培养摇床220r/min震荡30min后、静止10min，制成混悬液，记为原液。稀释涂板后，37℃厌氧培养48h后取出观察，用计数器进行乳酸菌菌落计数。37℃培养24h对大肠杆菌菌落进行计数，结果如表6所示。

灌胃15天后，空白组小鼠肠道内乳酸菌数均在10⁷CFU/ml；实验组乳酸菌数均明显高于空白组，其中ZK002组乳酸菌数高于ATCC7469组乳酸菌数。

小鼠内大肠杆菌属均为10²CFU/ml，实验组大肠杆菌低于对照组，其中ZK002组大肠杆菌菌数最少。

表6不同鼠李糖乳杆菌对小鼠肠道乳酸菌和大肠杆菌的影响

组别	乳酸菌(10<sup>7</sup>CFU/ml)	大肠杆菌(10<sup>2</sup>CFU/ml)
			空白组	1.52±0.27	2.31±0.34
ZK002组	7.83±0.33	0.68±0.19
			ATCC7469组	6.55±0.41	0.82±0.23

鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，同时降低大肠杆菌的数量，也可以达到促进消化以及灭菌的效果。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。

2.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌在制备促进人体胃肠道消化药品方面的运用。

3.一种胃肠道促消化剂，其特征在于，所述胃肠道促消化剂中含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌作为其有效成分。

4.根据权利要求3所述的胃肠道促消化剂，所述胃肠道促消化剂中还含有动物双岐杆菌作为其有效成分。

5.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌在制备抑制细菌生长药品方面的应用，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

6.一种口服抑菌剂，其特征在于，所述口服抑菌剂中含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌作为其有效成分。

7.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌在制备食品或保健品方面的应用。

8.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19826的鼠李糖乳杆菌在制备饲料方面的运用。

9.一种抑菌促消化饲料，其特征在于，所述抑菌促消化饲料中含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的饲料，其特征在于，所述饲料中还含有动物双岐杆菌作为其有效成分。