CN112094785B - 一种动物双歧杆菌及其制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种耐酸、耐胆盐、可生存于15～25℃，可调节肠道微生物菌群，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用的动物双岐杆菌。所述动物双岐杆菌保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827，具有增加肠道中乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数量的作用，且可以和鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.19826、植物乳杆菌CGMCC NO.19825，协同生长，共同调节肠道微生物菌群。

Description

一种动物双歧杆菌及其制剂与应用

技术领域

本发明涉及一种微生物领域，更具体地涉及一种能调节肠道微生物菌群功能的动物双歧杆菌ZK003及其制剂与应用。

背景技术

人体胃肠道定植着各种细菌，根据其对人体健康的影响可分为有益菌、有害菌和中性菌。有益菌即对人体有益生作用的益生菌，当益生菌占人体胃肠道足够优势数量时有利于人体健康，其中双歧杆菌是人体肠道内典型的有益菌。国内外的多项研究报道指出，双歧杆菌具有多种生理活性功能，它的存在可以降低肠道的pH值，使肠道菌群发生变化，抑制和杀灭病原菌，从而增强人体免疫力。双歧杆菌也可以在肠道内合成多种维生素，具有润肠通便、降低胆固醇和抗衰老等功能。

双歧杆菌属于革兰氏阳性菌，是一类专性厌氧菌，对氧的环境及营养要求非常苛刻无运动属性，生长周期中不产生芽孢，无荚膜和鞭毛。

双歧杆菌对环境中的pH变化非常敏感。其最适生长的pH在6.7～7.0,一旦高于8.0或者低于5.0，双歧杆菌将停止生长。当处于低pH条件下，会导致细菌细胞大量的死亡，特别是人源性双歧杆菌对酸的耐受性非常差。

双歧杆菌对环境温度的变化也很敏感。当温度介于37～41℃时，生长最为迅速，当温度高于43℃或低于28℃时，其生长及其缓慢或停止生长。在生产应用中，双歧杆菌最适温度为35～40℃。

现今，随着人们越来越重视自身的身体状态与肠道健康，越来越多的益生菌产品进入人们的生活，人们除了需要关注益生菌对致病菌的抑制作用，更需要了解益生菌之间是否具有协同促进的效果，这对以后益生菌的利用和相关产品的多样性具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提供了一种耐酸、耐胆盐、可生存于15～25℃，可调节肠道中微生物菌群，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用的动物双岐杆菌。

为达到本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，的动物双岐杆菌ZK003。保藏日期为：2020年05月15日，分类命名：动物双岐杆菌；拉丁名称：Bifidobacterium animalis。

动物双歧杆菌ZK003可耐受pH值为2.0的酸性环境，可耐受0.3％的胆盐浓度，确保其可以通过消化道进入人体及动物体内发挥功效。同时，动物双歧杆菌ZK003在15～25℃下放置360天存活率高达45.7％，说明该菌具有较长的产品货架期。

为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19827的动物双岐杆菌ZK003在抑制细菌生长方面的应用，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供了一种抑菌剂，所述抑菌剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827的动物双歧杆菌作为其有效成分。

为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19827的动物双岐杆菌ZK003在调节肠道菌群方面的应用，可以增加肠道中乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数量。

为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供了一种用于调节肠道菌群的组合物，所述组合物肠道菌群调节剂中保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827的动物双岐杆菌ZK003作为其有效成分。

优选的，所述组合物中还包括植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌作为其有效成分；所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19825，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCCNO.19826。

动物双岐杆菌ZK003对鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.19826、植物乳杆菌CGMCCNO.19825没有抑制作用，可以达到协同作用，可以进一步的增加肠道中乳酸菌的数量，进一步降低大肠杆菌的数量。

为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19827的动物双歧杆菌在制备药品、食品或保健品方面的应用。

为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19827的动物双歧杆菌在制备饲料方面的运用。

为达到本发明的第八个发明目的，本发明提供了一种调节肠道菌群的饲料，所述调节肠道菌群的饲料中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827的动物双歧杆菌作为有效成分。

优选的，所述饲料中还含有植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌作为其有效成分；所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19825，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19826。

所述植物乳杆菌(ZK001)在pH2.0时存活率可达到60％，在pH3.5时存活率可达到80％；在0.3％胆盐浓度时存活率可达到83％，在0.5％胆盐浓度时存活率可达到76％；适用人体胃肠道环境，具有利用低聚糖进行生长繁殖的能力。低聚糖可以促进植物乳杆菌ZK001的繁殖,该菌株可有效利用人体肠道内难以吸收的各种低聚糖进行增殖。植物乳杆菌ZK001对氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、四环素、克林霉素、青霉素G、氯霉素敏感，而对庆大霉素、环丙沙星、万古霉素和多粘菌素B具有耐药性；抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核增生李斯特菌的生长；有降低胆固醇和甘油三酯的功效，其体外胆固醇降低率为65.52％，优于标准菌株植物乳杆菌299v的63.95％；植物乳杆菌ZK001在小白鼠体内试验时，和模型组对比，甘油三酯及胆固醇分别下降28.79％和23.86％。

所述鼠李糖乳杆菌(ZK002),具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。对肠道中的致病菌大肠杆菌/金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用；但对于白色念球菌没有抑制效果，多肠道中的益生菌双歧杆菌也没有抑制效果。

区别于现有技术，上述技术方案提供了一种耐酸、耐胆盐、可生存于15～25℃，可调节肠道微生物菌群，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用的动物双岐杆菌ZK003。ZK003具有增加肠道中乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数量的作用，且可以和鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.19826、植物乳杆菌CGMCC NO.19825，协同生长，共同调节肠道微生物菌群。

附图说明

图1动物双歧杆菌ZK003在不同的酸性培养液中的存活状态LOG变化图；

图2动物双歧杆菌ZK003在不同浓度胆盐的培养液中的存活状态LOG变化图；

图3动物双歧杆菌ZK003冻干粉对20-25℃的耐受性图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合说明书附图1-3详予说明。

实施例1动物双歧杆菌ZK003菌株的分离、筛选及鉴定

采集近期无服用药物的健康婴幼儿粪便样品，用灭菌的蛋白胨水保存新鲜粪便，4℃冷藏，在4小时之内运送到实验室。用无菌玻璃棒将粪便样品捣碎，无菌水溶解，震荡均匀，取1ml样品溶液，加入9ml灭菌稀释液，按十倍稀释法将样品稀释至适宜的梯度，取稀释液1ml加入到灭菌的平板中，倒入灭菌好的改良MRS固体培养基充分混匀后冷却凝固，放入厌氧袋中，37℃厌氧培养48h。经过多次筛选和培育，得到动物双歧杆菌ZK003。

改良MRS固体培养基(每升)：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温-801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g，硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g，琼脂15.0g，待培养基灭菌冷却至45℃时，每100mlMRS培养基添加配套试剂(SR0370)半胱氨酸盐酸盐和莫匹罗星锂盐各一支，混合均匀。

动物双歧杆菌ZK003经革兰氏染色后镜检的形态特征：革兰氏阳性，呈杆状，不形成芽胞，无鞭毛。动物双歧杆菌ZK003的生理生化具体见表1。

表1动物双歧杆菌ZK003的生理生化特性

注：+表示阳性，—表示阴性。

实施例2动物双歧杆菌ZK003对酸的耐受性

改良MRS液体培养基(每升)：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温-801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H2O)0.2g，硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g，待培养基灭菌冷却至45℃时，每100mlMRS培养基添加配套试剂(SR0370)半胱氨酸盐酸盐一支，混合均匀。

将低温保存的动物双歧杆菌ZK003菌株，用改良MRS固体培养基活化2～3代后，转接到无菌改良MRS液体培养基，放入厌氧袋中，于37℃严格厌氧培养12h后，将菌液以1％的接种量接入不同pH值的无菌改良MRS液体培养基中(pH分别为2.0、2.5、3.0)，同时以pH7.0的培养液为对照，同样放入厌氧袋中，于37℃严格厌氧培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min后取样测定活菌数，并计算活菌数的LOG值。

式①中：N0是0min时的活菌数(CFU/ml)；N是用不同pH处理相应时间的活菌数(CFU/ml)。

动物双歧杆菌ZK003在不同的酸性培养液中的存活状态LOG值见表2，在pH2.0条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性，具体变化趋势见图1。

表2动物双歧杆菌ZK003在不同的酸性培养液中的存活状态LOG(CFU/ml)

时间(min)	0	30	60	90	120
						pH7.0	7.41	7.52	7.64	7.71	7.72
pH3.0	7.41	7.44	7.51	7.52	7.48
						pH2.5	7.41	7.34	7.32	7.26	7.28
pH2.0	7.41	7.30	7.17	7.11	7.04

由表2可知，在不同pH的的条件下动物双歧杆菌ZK003的存活状态良好，与空白对照组相比无明显差异。由式①计算公式得，pH在2.0的条件下，经过120min动物双歧杆菌ZK003的活菌对数比率为91.19％；pH在2.5条件下，经过120min后为94.43％；pH在3.0条件下，经过120min后高达96.89％。

实施例3动物双歧杆菌ZK003对胆盐的耐受性

将低温保存的动物双歧杆菌ZK003菌株，用改良MRS固体培养基活化2-3代后，转接到无菌改良MRS液体培养基，放入厌氧袋中，于37℃严格厌氧培养12h后，将菌液以1％的接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中(胆盐浓度为0.2％、0.3％、0.5％，1.0％)，同时以不含胆盐的改良MRS液体培养基为对照，同样放入厌氧袋中，于37℃严格厌氧培养0h、2h、4h、6h、24h后取样测定活菌数，并计算活菌数的LOG值。

式②中：N0是0h时的活菌数(CFU/ml)；N是用不同胆盐浓度处理相应时间的活菌数(CFU/ml)。

动物双歧杆菌ZK003在不同浓度胆盐的培养液中的存活状态LOG值见表3。人体小肠内胆盐浓度约为0.3％，本次实验，通过空白对照组可知，培养24h后，动物双歧杆菌ZK003在胆盐浓度0.3％和0.5％的条件下，仍有大量活菌存在，且菌数呈正增长，增长速度小于空白对照组，说明该菌株对胆盐有很强的耐受性，具体变化趋势见图2。

表3动物双歧杆菌ZK003在不同浓度胆盐的培养液中的存活状态LOG(CFU/ml)

时间(h)	0	2	4	6	24
						0.0％	7.80	8.32	8.54	8.62	9.60
0.2％	7.80	7.84	7.90	7.96	8.95
						0.3％	7.80	7.83	7.88	7.94	8.90
0.5％	7.80	7.98	7.51	7.88	8.81
						1.0％	7.80	7.95	7.23	7.79	8.62

由表3可知，在不同浓度胆盐的条件下动物双歧杆菌ZK003的存活状态良好，与空白对照组相比无明显差异。由式②计算公式得，胆盐浓度在0.3％的条件下，经过24h后动物双歧杆菌ZK003的活菌对数比率为92.7％。

实施例4动物双歧杆菌ZK003在20-25℃保存

动物双歧杆菌ZK003冻干粉的制备方法：

种子培养液：将动物双歧杆菌ZK003接种于改良MRS固体培养基中，在37℃活化2-3代后，然后挑取菌种接入液体MRS培养基中厌氧培养，静置37℃培养12h；

离心：将培养液充分适当离心，得到益生菌菌泥；

包埋：取出菌泥加入脱脂奶粉(高温水浴杀菌并冷却)，配制成液体；

冷冻干燥：将包埋好的益生菌通过冷冻干燥技术制成冻干粉，冷冻干燥技术条件为温度最低值-40℃，冷冻时长6-8h，干燥总时长36-40h。

动物双歧杆菌ZK003冻干粉，在20-25℃保存条件下，活菌数的变化与天数的关系见表4和图3，动物双歧杆菌ZK003冻干粉在20-25℃下放置360天存活率高达45.7％，说明动物双歧杆菌ZK003冻干粉在常温保存下的具有较长的产品货架期，具有较大的经济价值。

表4动物双歧杆菌ZK003对25℃的耐受性

储存月数(months)	活菌数(CFU/g)
		0	3.5×10<sup>11</sup>
1	3.3×10<sup>11</sup>
		3	3.1×10<sup>11</sup>
6	2.8×10<sup>11</sup>
		9	2.5×10<sup>11</sup>
12	2.3×10<sup>11</sup>
		18	1.9×10<sup>11</sup>
24	1.6×10<sup>11</sup>

实施例5动物双歧杆菌ZK003对肠道菌群的影响

(1)动物双歧杆菌ZK003对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用

培养基：改良MRS液体培养基，营养肉汤液体和固体培养基。

动物双歧杆菌ZK003活化：将置于低温保存的动物双歧杆菌ZK003放到室温下回温，活化2～3代，在无菌条件下，吸取0.2ml接种到改良MRS液体培养基中，放入厌氧袋中，37℃厌氧培养12～14h。

动物双歧杆菌ZK003发酵液的制备：将活化好的动物双歧杆菌ZK003发酵液采用低温离心的方法，制备上清液，得到抑菌液。

指示菌株准备：取致病菌冻存管在37℃水浴锅中使其迅速溶化，按1％的接种量接种于适宜的液体培养基中，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌37℃恒温过夜培养。

涂布营养琼脂平皿：将活化好的致病菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在10⁶cfu/ml。

牛津杯法：将铺好致病菌的营养琼脂平板晾干后进行抑菌试验，每个平皿均匀放置3个牛津杯，其中两个牛津杯加入动物双歧杆菌上清液，另一个加入未接种的MRS液体培养基作为对照，37℃厌氧培养24～48h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值，本次实验采用牛津杯内直径6mm，外直径8mm。

结果表明，双歧杆菌对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，抑菌圈透明度高，抑菌圈直径较大，具体结果见表5。

表5动物双歧杆菌ZK003对致病菌的抑制实验

致病菌	抑菌圈(mm)
		大肠杆菌	13.37
鼠伤寒沙门氏菌	11.38
		金黄色葡萄球菌	12.93

(2)动物双歧杆菌ZK003对其他乳酸菌的抑制实验

菌种：动物双歧杆菌ZK003、植物乳杆菌ZK001、鼠李糖乳杆菌ZK002。

植物乳杆菌(Lactobacilluspiantarum)ZK001，于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19825，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)ZK002，于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19826，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

培养基：MRS液体和固体培养基。

菌种活化：将置于低温保存的动物双歧杆菌ZK003、鼠李糖乳杆菌ZK002、植物乳杆菌ZK001的斜面试管置于25℃下回温若干分钟，然后在无菌条件下，各按照1％的接种量转接到MRS液体培养基中，37℃恒温静止培养12h。

动物双歧杆菌ZK003发酵液的制备：将活化好的动物双歧杆菌ZK003发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为4℃，7500rpm，5min。

将MRS固体培养基倒入无菌培养皿中，然后把活化好的植物乳杆菌ZK001、鼠李糖乳杆菌ZK002菌液稀释至一定梯度，用移液枪分别吸取0.1mL至MRS固体培养基中，要求涂布时培养基中的菌数达到一定量且均匀分布在培养基上，等待若干分钟至菌液被完全吸收，然后把已灭菌的牛津杯轻放于培养基上，稍微下压，使其与培养基接触面无空隙，然后吸取0.2mL动物双歧杆菌ZK003发酵上清液于杯中，每个培养基放3个牛津杯，其中2个作为实验组，1个作为对照组，对照组加入0.2mL的无菌生理盐水，37℃恒温厌氧培养24～48h，观察抑菌圈的大小，并测量抑菌圈的直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。

结果表明，双歧杆菌对鼠李糖乳杆菌ZK002、植物乳杆菌ZK001均无抑制作用，具体结果见表6。

表6动物双歧杆菌ZK003对其他乳酸菌的抑制实验

乳酸菌	抑菌圈
		鼠李糖乳杆菌ZK002	_
植物乳杆菌ZK001	_

实施例6含有动物双歧杆菌ZK003的乳酸菌对小鼠体内肠道菌群的影响

取12周龄的体重在20g左右的C57BL/6J雄性小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：

空白组：每只小鼠每天灌胃生理盐水；

ZK003组：每只小鼠每天灌胃动物双歧杆菌ZK003菌液活菌3×10⁸CFU/只；

ZK003+ZK002组：每只小鼠每天灌胃(动物双歧杆菌ZK003菌液1.5×10⁸CFU/只+鼠李糖乳杆菌ZK002菌液1.5×10⁸CFU/只)；

ZK003+ZK001组：每只小鼠每天灌胃(动物双歧杆菌ZK003菌液1.5×10⁸CFU/只+植物乳杆菌ZK001菌液1.5×10⁸CFU/只)；

ZK003+ZK002+ZK001组：每只小鼠每天灌胃(动物双歧杆菌ZK003菌液1×10⁸CFU/只+鼠李糖乳杆菌ZK002菌液1×10⁸CFU/只+植物乳杆菌ZK001菌液1×10⁸CFU/只)。

小白鼠两天预饲后进行实验，每天自由饮水，在每只小鼠3g饲料的基础上对小鼠进行灌胃，计量为0.2ml，其中空白组灌胃生理盐水。灌胃15天后采用脱颈法处死，在无菌条件下将小鼠进行解剖，拨离肠道并采取肠道内容物，剪碎，放入玻璃容器中，加入灭菌的生理盐水后进行匀浆，放入恒温震荡培养，220r/min摇床震荡30min后静止10min，制成混悬液，记为原液。将原液稀释涂板后，放入厌氧袋，置于37℃厌氧培养48h后，观察并进行乳酸菌菌落计数。37℃培养24h对大肠杆菌菌落进行计数。

灌胃15天后，试验结果如表7所示：

表7含有动物双歧杆菌ZK003的乳酸菌对小鼠体内肠道菌群的影响

组别	乳酸菌(10<sup>7</sup>CFU/mL)	大肠杆菌(10<sup>2</sup>CFU/mL)
			空白组	1.56±0.12	2.45±0.19
ZK003组	7.66±0.33	0.69±0.23
			ZK003+ZK002组	8.34±0.32	0.37±0.16
ZK003+ZK001组	8.12±0.23	0.46±0.30
			ZK003+ZK002+ZK001组	9.56±0.15	0.32±0.26

空白组小鼠肠道内乳酸菌数均在10⁷CFU/ml左右，试验组乳酸菌数均明显高于空白组，其中ZK003+ZK002+ZK001组>ZK003+ZK002组>ZK003+ZK001组>ZK003组。

空白组小鼠内大肠杆菌菌数均在2.50×10²CFU/ml左右，试验组大肠杆菌菌数明显低于对照组，其中ZK003+ZK002+ZK001组大肠杆菌菌数最少。

以上结果表明，ZK003具有增加肠道中乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数量的作用，且可以和鼠李糖乳杆菌ZK002、植物乳杆菌ZK001，协同生长，共同调节肠道微生物菌群；在活菌数固定的情况下，ZK003+ZK002+ZK001的比例为1:1:1时，效果最好。

实施例11植物乳杆菌ZK001菌株的分离、纯化与鉴定

植物乳杆菌ZK001菌株分离纯化：将福建传统农家泡菜发酵液混匀，取发酵液5ml，10倍系列稀释至适宜梯度，每个稀释浓度取200μL涂布于含有CaCO₃的选择性培养基MRS培养基上，37℃恒温厌氧培养48h后，挑取平板上典型的单菌落，在MRS固体培养基上划线纯化分离，37℃厌氧培养48h，得到纯的菌落，重复这种纯化方式2～3代，然后对纯化后的菌落进行革兰氏染色鉴定和过氧化氢酶实验。

植物乳杆菌ZK001菌株鉴定：挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果，保留革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌落。

植物乳杆菌ZK001菌种保藏：挑选纯化完成后的单菌落于5mlMRS液体培养基，于37℃厌氧静置培养24h，吸取1ml菌液至保菌管中，4000r/min离心5min，去上清，加入1ml的30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

植物乳杆菌ZK001菌株特性：植物乳杆菌ZK001经革兰氏染色后，在光学显微镜下观察，菌株的菌体呈短直圆杆状，成对。植物乳杆菌ZK001在MRS固体培养基上培养48h后呈表面光滑湿润、边缘整齐、圆形、乳白色、隆起的菌落。植物乳杆菌ZK001的常规生理生化实验鉴定结果如表11所示。

表11植物乳杆菌ZK001常规生理生化实验鉴定结果

实验项目	实验结果	实验项目	实验结果
				革兰氏染色	+	D-核糖	+
过氧化氢酶试验	-	蔗糖	+
				葡萄糖产酸产气	+	D-果糖	+
硝酸盐还原	-	乳糖	+
				H<sub>2</sub>S试验	-	D-半乳糖	+
吲哚试验	-	麦芽糖	+
				明胶液化	-	海藻糖	+
甘露醇	+	水杨苷	+
				山梨醇	+	淀粉	-
鼠李糖-		纤维二糖	+

注：+表示反应阳性，-表示反应阴性。

实施例12植物乳杆菌ZK001对胃肠道环境的耐受性

(1)植物乳杆菌ZK001对酸的耐受性

挑取低温保存的植物乳杆菌ZK001菌株，在MRS液体培养基中厌氧活化18h后，测其菌液浓度为10⁸～10⁹CFU/mL，用移液枪吸取150μL的植物乳杆菌ZK001菌液分别加入到4.5mL含不同pH(pH为2.0、2.5、3.0、3.5、6.5)的MRS液体培养基中，混匀，放置于37℃的厌氧环境静置培养2h，然后将其稀释10倍后，各取500μL倒入MRS固体培养基，混合均匀，待凝固后于37℃厌氧培养24～48h，计数，测定其中植物乳杆菌ZK001菌液的浓度，具体见表12。

按照下列计算公式计算植物乳杆菌ZK001在耐酸耐胆盐后的存活率

存活率计算公式：

式中：C为耐酸耐胆盐后的菌液浓度/(CFU/mL),C₀为起始菌液浓度/(CFU/mL)

表12植物乳杆菌ZK001对不同pH的耐受性测试结果

pH值	起始菌液浓度C<sub>0</sub>(CFU/mL)	处理2h后菌液浓度C(CFU/mL)	存活率(％)
				2.0	3.60×10<sup>8</sup>	2.16×10<sup>8</sup>	60
2.5	3.60×10<sup>8</sup>	2.45×10<sup>8</sup>	68
				3.0	3.60×10<sup>8</sup>	2.66×10<sup>8</sup>	74
3.5	3.60×10<sup>8</sup>	2.88×10<sup>8</sup>	80
				6.5	3.60×10<sup>8</sup>	3.46×10<sup>8</sup>	96

检测到植物乳杆菌ZK001在pH2.0时存活率可达到60％，在pH3.5时存活率可达到80％，说明该菌株具有较强的耐酸能力。

(2)植物乳杆菌ZK001对胆盐的耐受性

活化后植物乳杆菌ZK001菌液浓度为10⁸～10⁹CFU/mL，用移液枪吸取150μL的植物乳杆菌菌液分别加入到4.5mL含不同胆盐含量(0.1％、0.3％、0.5％和1.0％)的MRS液体培养基中，混匀，放置于37℃的厌氧环境静置培养2h，然后将其稀释10倍，分别向培养皿中加入500μL的植物乳杆菌菌液，倒入MRS固体培养基混合均匀，待凝固后于37℃厌氧培养24～48h，计数，测定其中植物乳杆菌ZK001菌液的浓度，具体见表13。

表13植物乳杆菌ZK001对不同胆盐浓度的耐受性测试结果

检测到植物乳杆菌ZK001在0.3％胆盐浓度时存活率可达到83％，在0.5％胆盐浓度时存活率可达到76％，说明该菌株具有较强的耐胆盐能力。

(3)植物乳杆菌对抗生素的耐药性

药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所的药敏纸片。抗生素含量为30μg/片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、四环素、克林霉素、青霉素G、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星、万古霉素和多粘菌素B。药敏结果判定标准按照NCCLS手册2010版。

活化后植物乳杆菌ZK001菌液浓度为10⁸～10⁹CFU/mL，将其稀释至适宜浓度后，用移液枪吸取100μL的植物乳杆菌ZK001稀释液至MRS固体培养基中，用涂布棒涂布整个培养基表面，反复几次，保证涂均匀，待植物乳杆菌ZK001稀释液完全吸收后，用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴3张纸片，其中2个为实验组，1个为对照组，以无抗生素的纸片为空白对照，每张纸片间保持合适的距离，整个过程在菌接种后15min内要贴完纸片。然后将培养皿正面朝上置于37℃厌氧培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。根据NCCLS标准进行判读：抑菌圈直径≤12mm为抗生素耐药，抑菌圈直径≥18mm为抗生素素敏感。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，这些都不作为抑菌环的边缘，具体见表14。

表14植物乳杆菌ZK001对12种常见抗生素的耐药性

注：药敏测试结果根据NCCLS 2010年发布的《抗微生物药物敏感性试验的执行标准(第20版)》进行判读。S：敏感，R：耐药。

由表14可知，植物乳杆菌ZK001对环丙沙星、万古霉素和多粘菌素B具有耐药性，对其他抗生素敏感。

实施例13植物乳杆菌ZK001的抑菌特性

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核增生李斯特菌作为病原菌，在LB液体培养基中各自震荡培养18h后，先向每个已灭菌的培养皿中加入约20ml的LB固体培养基，然后将病原菌稀释至一定梯度，用移液枪吸取100μL至LB固体培养基涂布，静置若干分钟待培养基凝固后，用镊子夹取已灭菌的牛津杯，轻放在培养基上，轻压一下，然后往牛津杯中加入200μL培养24h的植物乳杆菌ZK001菌液，每个培养皿中放3个牛津杯，其中2个做实验组，1个做对照组，对照组加入未添加任何菌液的MRS液体培养基，每个病原菌做3个平行实验，待菌液被完全吸收后，于37℃条件下厌氧培养24～48h，观察并测量抑菌圈直径的大小。

当选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核增生李斯特菌作为指示病原菌时，植物乳杆菌ZK001能够抑制这些病原菌的生长。如表15所示，对照组中的MRS液体培养基对这4种病原菌无抑制作用，而植物乳杆菌ZK001能够较强的抑制这4种病原菌的生长。

表15植物乳杆菌ZK001的抑菌圈直径

实验	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌	肠炎沙门氏菌	单核增生李斯特菌
					MRS液体培养基	0	0	0	0
植物乳杆菌	15.83±0.06	16.52±0.05	16.96±0.06	16.32±0.04

实施例14植物乳杆菌ZK001体外降解胆固醇能力的测定

本实验采购CGMCC的标准菌株植物乳杆菌299v作为对照。其中，植物乳杆菌299v是已经商业化的具有降胆固醇功能的菌株。具体如下：

首先配制含有胆固醇的MRS液体培养基和不含胆固醇的MRS液体培养基。

MRS-胆固醇培养基：由MRS液体培养基、巯基乙酸钠、胆盐和胆固醇组成，其中，巯基乙酸钠在MRS-胆固醇培养基中的浓度为2g/L，胆盐在MRS-胆固醇培养基中的占比为0.3％，胆固醇的浓度为120μg/mL。

将植物乳杆菌ZK001和植物乳杆菌299v分别转接于不含胆固醇的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养24h，待用。

实验组：活化的植物乳杆菌ZK001和植物乳杆菌299v菌液按1％接种量分别接种于10mL MRS-胆固醇培养基中。

对照组：没有接种菌株的10mLMRS液体培养基。

将这三组样品放置于37℃恒温培养箱培养24h后，取出摇匀，4000r/min离心15min，取上清液，用邻苯二甲醛显色剂测定上清中胆固醇含量，并计算胆固醇的降解率，其中，胆固醇降解率＝对照组胆固醇与实验组胆固醇的差值/对照组胆固醇含量。结果显示，植物乳杆菌ZK001降胆固醇降低率为65.52％，优于植物乳杆菌299v组的63.95％，可见植物乳杆菌ZK001有较强的体外降低胆固醇能力，并且其降胆固醇能力,略优于目前已经商业化应用的植物乳杆菌299v标准菌株。

实施例15植物乳杆菌ZK001体内降解胆固醇和甘油三脂能力的测定

(1)实验菌株的的制备

将活化两次的植物乳杆菌ZK001接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18h，6000r/min离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后加入0.85％生理盐水，调整菌数至1.0×10⁸CFU/mL，然后将活菌按每日使用量分装于15mL的离心管，服用剂量为每天2mL/只，每组10只，共4组，灌胃28天。

(2)实验动物分组及饲养方式

本实验采用5周龄健康昆明种雄性大鼠，自由饲喂至第28天，然后平均分为4组，每组10只，按照以下设置分别对四组进行灌胃28天。

第一组：植物乳杆菌ZK001组，该组灌胃活菌悬液，饲喂高脂饲料；

第二组：模型组，该组灌胃0.85％生理盐水，饲喂高脂饲料；

第三组：正常组，该组灌胃0.85％生理盐水，饲喂标准饲料；

第四组，血脂康组，该组灌胃血脂康(血脂康胶囊用生理盐水溶解，240mg/kg)，饲喂高脂饲料。

每天每只2mL灌胃，持续28天。其中，高脂饲料自行配制，是在购买的标准饲料的基础上添加脂肪或高脂肪物质，具体配方为：78.8％标准饲料、10％猪油、10％蛋黄粉、l％胆固醇、0.2％胆盐。标准饲料为购置于河南天驰实验动物饲料厂的鼠类专用饲料，血脂康胶囊(能显著降低大鼠体内的胆固醇和甘油三酯),规格：每粒0.3g，北京北大维信生物科技有限公司提供。

(3)样品采集与分析测试

正式实验前及第28天时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠股静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清，利用购自浙江东瓯诊断产品有限公司的总胆固醇测定试剂盒和变色酸显色法，分别检测胆固醇及甘油三酯。其中，酶标仪采用MolecularDevices公司的Spectra MAX190酶标仪。

(4)实验结果:

结果显示，用含植物乳杆菌ZK001菌株菌悬液喂养高脂饲料的大鼠，与模型组对照，两者相比大鼠血液中甘油三酯及胆固醇分别下降28.79％和23.86％，表明植物乳杆菌ZK001在大鼠体内确有降低胆固醇和甘油三酯的功效。

实施例16不同低聚糖对植物乳杆菌ZK001生长的影响

本实验采用健康昆明种小白鼠，40只，雄性，体重14～16g。

实验所用的低聚糖分别为低聚果糖(纯度≥95％)、低聚木糖(纯度≥98％)、低聚半乳糖(纯度≥98％)、低聚异麦芽糖(纯度≥90％)。

(1)低聚糖的筛选试验

将低聚糖添加浓度初步定为1％，分别添加到MRS液体培养基中，接种后于37℃厌氧静止培养48h后，用分光光度计测定菌液浓度，用涂布法测定菌数，从而筛选出在相同条件下效果较好的两种低聚糖进行以下实验。

试验结果表明：添加相同浓度的低聚糖时，低聚果糖和低聚半乳糖效果较明显，其植物乳杆菌ZK001菌落总数分别为2.76×10⁸、2.43×10⁸CFU/mL，明显高于对照组1.01×10⁸CFU/mL，且低聚果糖的促进效果最好。

(2)低聚糖最适添加量的确定

将确定效果优良的低聚果糖和低聚半乳糖按照不同浓度分别添加到MRS液体培养基中，使其质量浓度分别为0、1％、2％、3％、4％、5％，然后将植物乳杆菌ZK001按1％的接种量接种到不同的培养基中，对照组为将植物乳杆菌ZK001同样按1％的接种量接种到无任何添加物的MRS液体培养基中，利用分光光度计测定菌液浓度，观察不同低聚糖含量对植物乳杆菌ZK001生长状况的影响，从而确定最适添加浓度，然后测出各自最适添加浓度下的菌液，用涂布法确定细菌总数。

试验结果显示：随着低聚糖浓度的增加，植物乳杆菌ZK001总数增加(OD值)，到达一个峰值后，随着低聚糖浓度的增加，反而植物乳杆菌ZK001总数越少。最适添加浓度分别为低聚果糖3％，低聚半乳糖2％。

直接将最适浓度的菌液稀释涂布，然后菌落计数，试验结果：低聚果糖菌落总数为1.42×10⁸CFU/mL，低聚半乳糖菌落总数为1.10×10⁸CFU/mL，空白对照组菌落为0.87×10⁸CFU/mL。两种低聚糖组的菌落总数均明显高于空白对照组，其中3％的低聚果糖效果最为明显，2％低聚半乳糖效果次之。

(3)低聚糖联合使用试验

将筛选出来的低聚果糖和低聚半乳糖联合使用，观察是否有相加作用，低聚果糖：低聚半乳糖浓度分别为1％:9％、2％:8％、3％:7％、4％:6％、5％:5％、6％:4％、7％:3％、8％:2％、9％:1％，并设置低聚果糖组、低聚半乳糖组、不加低聚糖组，利用分光光度计来测定植物乳杆菌ZK001菌液浓度，最后确定其最佳浓度。

试验结果见表16，结果表明：当低聚果糖和低聚半乳糖比例为3:7时，植物乳杆菌ZK001菌液浓度达到1.410，为最高，低聚果糖单独使用时为1.382，低聚半乳糖单独使用时为1.210，空白组为0.254。P<0.05时差异显著，这说明了在混合使用时出现了协同作用，为今后低聚糖配合ZK001植物乳杆菌菌株作为食品或益生元添加剂提供了科学依据。

表16两种不同浓度的低聚糖混合使用试验结果

果：半乳	OD600nm	果：半乳	OD600nm	OD600nm
					空白组	0.254	2％：8％	1.380#	1.340#
3％：0	1.382#	3％：7％	1.410##	1.356
					0：2％	1.210	4％：6％	1.394#	1.310
1％：9％	1.230	5％：5％	1.371#	1.223

注：果为低聚果糖，半乳为低聚半乳糖，与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01。

实施例21鼠李糖乳杆菌ZK002菌株的筛选与鉴定

取健康母乳10mL加到40mL缓冲蛋白胨液中，摇匀，在37℃下，静置培养48h；富集培养后，直接将未经稀释的样品划线于MRS改良培养基平板上。37℃培养48h(平板放入自封袋中)；挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于MRS改良培养基进行划线纯化培养，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。如镜下观察结果一致，则将得到的纯培养物(平皿菌落)作为疑似菌株，将对应平皿编号，待鉴定；如镜下观察结果不一致，则继续进行上述操作。将筛选出的菌株进行革兰氏染色、产气实验、过氧化氢酶实验，经过多次筛选和培育，得到鼠李糖乳杆菌ZK002，将菌株保存至甘油中，-20℃下冻存。

鼠李糖乳杆菌ZK002菌株的形态特征为：菌体呈杆状；在MRS平板培养基上培养24～48h后，菌落呈圆形，乳白色，凸起，边缘整齐，不透明。

实施例22筛选的鼠李糖乳杆菌ZK002耐消化道逆环境实验

2.1人工胃液耐受性实验

将传代三次活化后的鼠李糖乳杆菌ZK002种子液按照5％(v/v)的接种量，分别接种于pH＝2、2.5、3、4的人工模拟胃液中，同时以90％的生理盐水作为空白组，37℃培养，分别在15h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养48h后计数，结果见表21。上述人工胃液，取20ml 1mol/L的盐酸，用NaOH调节pH至2、2.5、3、4，然后按1g/100ml加入胃蛋白酶，充分溶解后，将配制好的人工胃液过孔径为0.22μm的滤膜除菌备用。

人工胃液耐受性数据指标：

测得空白对照的活菌数用N0表示，其他pH条件下测得的活菌数用N表示，其人工胃液耐受性活菌数对数比率计算公式如下：

受试菌株工胃液耐受性活菌对数比率(％)＝lg CFU N/lg CFU N0×100％；

表21 ZK002在人工胃液耐受性试验数据表

由表21可知，ZK002菌株在pH3.0的条件下经过15h后，与空白对照相比活菌数稍有下降，但活菌对数值仍可达8.59，活菌数可达3.9×10⁸CFU/mL，活菌对数比率高达88.47％；在pH2.0条件下，活菌数低于空白对照，但活菌对数值仍可维持在7.60，活菌数可达4.0×10⁷CFU/mL，活菌对数比率高达78.27％；在pH4.0条件下，活菌对数值仍达到8.87，活菌数可达7.4×10⁸CFU/mL，活菌对数比率高达91.35％。

2.2人工肠液耐受性实验

活化后的鼠李糖乳杆菌ZK002按照5％(v/v)的接种量接种于人工肠液中，同时设置90％的生理盐水为空白对照组，37℃培养，于0h、2h、4h、6h、8h取样，计活菌数，结果见表22。上述人工肠液，取KH₂PO₄0.27g，加蒸馏水20ml溶解，用1mol/L的NaOH调节pH至6.8，再按0.1g/L加入胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22μm的微孔膜过滤除菌，制得人工肠液备用。

如表22所示，鼠李糖乳杆菌ZK002在模拟肠液中处理8h存活状态良好，活菌数变化与空白组比较没有显著差异(p<0.05)，在人工肠液中暴露8h存活率超过100％。鼠李糖乳杆菌ZK002具有良好的人工肠液耐受性。

表22鼠李糖乳杆菌ZK002在人工肠液中存活状态(LOG(CFU/mL))

综上，说明该菌株具有较强的耐酸耐胆盐能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。

实施例23筛选的鼠李糖乳杆菌ZK002抑菌功能特异性实验

指示菌株准备：取致病菌冻存管在37℃水浴锅中使其迅速溶化，按1％的接种量接种于适宜的液体培养基中，大肠杆菌/金黄色葡萄球菌/鼠伤寒沙门氏菌37℃恒温过夜培养；白色念珠菌培养28℃恒温摇床摇48h，转速100rpm；动物双岐杆菌37℃恒温厌氧培养。

制备固体培养基，将培养至对数期的致病菌稀释至菌液浓度为10⁶C FU/mL，取菌悬液100μL均匀涂布于固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有指示菌的平皿中，每个牛津杯中加入200μL浓度为10⁸CFU/mL的鼠李糖乳杆菌上清液。将平皿置于适宜温度的恒温培养箱中，培养适当时间后观察拍照，并用游标卡尺计量抑菌圈直径。

鼠李糖乳杆菌上清液的制备：将培养好的鼠李糖乳杆菌ZK002菌液1200g、4℃离心15min去菌体沉淀，上清液过0.22的微孔滤膜滤膜备用。

实验结果见表23。表23中采用牛津杯法，牛津杯内直径6mm，外直径8mm；使用受试菌株发酵液上清，分别进行5倍、8倍浓缩以及直接取原上清进行试验。

表23抑菌圈记录表

通过实验结果可以得出鼠李糖乳杆菌ZK002对肠道中的致病菌大肠杆菌/金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用；但对于白色念球菌没有抑制效果，多肠道中的益生菌双歧杆菌也没有抑制效果。

实施例24不同鼠李糖乳杆菌对小鼠粪便中短链脂肪酸浓度的影响

将鼠李糖乳杆菌ZK002,鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469分别接入MRS液体培养基中于37℃培养48h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。

取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠30只，随机分为3组，每组10只，3组分别为：空白组、灌胃鼠李糖乳杆菌ZK002菌悬液的ZK002组、灌胃鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌悬液的ATCC7469组、其中，ZK002组、ATCC7469组均为实验组。

实验共25天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌ZK002、ATCC7469菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃18天。

15天后，检测每只小鼠粪便中短链脂肪酸的含量。短链脂肪酸的测定，结果见表4。

将粪便用生理盐水稀释与10％硫酸以25:1的体积比混合酸化后，加入4倍10％硫酸体积的乙醚振荡混匀以提取脂肪酸，得到提取液；将提取液于18000g的条件下离心15min后分离上层乙醚相，将上层乙醚相通过无水Na₂SO₄进行干燥后静置30min，继续于18000g的条件下离心5min，用GC-MS分析上层乙醚相中的各种短链脂肪酸。

表24不同组小鼠粪便中的短链脂肪酸的种类及含量

灌胃鼠李糖乳杆菌的小鼠粪便中的总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸的产量均普遍提高，以鼠李糖乳杆菌ZK002组提高幅度最大，而鼠李糖乳杆菌ATCC7469组粪便中总短链脂肪酸含量略少于ZK002组，较空白组也有大幅度提升。四类短链脂肪酸中丙酸的变化最为明显。

短链脂肪酸含量可以反映体内菌群活性及机体整体的健康状态，测定粪便中短链脂肪酸含量水平可以判断体内厌氧菌的变化，且短链脂肪酸能促进钠离子的吸收，维持肠道上皮细胞内外渗透压，促进细胞增殖和粘膜生长。

实施例25鼠李糖乳杆菌ZK002对不同低聚糖的利用能力

在MRS固体培养基的基础上，去掉配方中的葡萄糖与牛肉膏，以不添加任何糖作为空白对照，分别添加0.5％(m/v)的葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖以及低聚半乳糖作为碳源，并加入溴甲酚紫作为酸碱指示剂，得到无糖、含葡萄糖、含低聚果糖、含低聚木糖或含低聚半乳糖的固体培养基平板，备用。

将鼠李糖乳杆菌ZK002和鼠李糖乳杆菌ATCC7469分别接入MRS液体培养基中，于37℃培养48h，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至OD₆₀₀为0.5，获得菌液。

吸取10μL菌液分别点在上述固体培养基平板上，待菌液完全吸收后，于37℃倒置培养，12h后，观察固体培养基平板内的溴甲酚紫指示剂是否变黄，若变黄，则表明碳源被利用，若不变黄，说明碳源没被利用。结果如表25所示。

表25鼠李糖乳杆菌对不同低聚糖的利用能力

碳源	ZK002	ATCC7469
			空白	-	-
葡萄糖	+	+
			低聚果糖	+	+
低聚木糖	+	+
			低聚半乳糖	+	+

其中，+表示乳杆菌能利用该种碳源，-表示不能利用。

实施例26鼠李糖乳杆菌ZK002对小鼠肠道乳酸菌和大肠杆菌的影响

将鼠李糖乳杆菌ZK002，鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469分别接入MRS液体培养基中于37℃培养48h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中，获得菌悬液，将液于-80℃下保存待用。

取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠30只，随机分为3组，每组10只，3组分别为：空白组、灌胃鼠李糖乳杆菌ZK002菌悬液的ZK002组、灌胃鼠李糖乳杆菌ATCC7469菌悬液的ATCC7469组、其中，ZK002组、ATCC7469组均为实验组。

进行两天预饲后进行实验，每天进行自由饮水，并在每只小鼠3g的饲料的基础上对小鼠进行灌胃，计量为0.2ml，其中空白组灌胃生理盐水。灌胃15天后采用脱颈法处死，在无菌条件下将小鼠进行解剖，拨离肠道并采取肠道内容物，剪碎，放入玻璃容器中，加入灭菌的生理盐水后进行匀浆，放入恒温震荡培养摇床220r/min震荡30min后、静止10min，制成混悬液，记为原液。稀释涂板后，37℃厌氧培养48h后取出观察，用计数器进行乳酸菌菌落计数。37℃培养24h对大肠杆菌菌落进行计数，结果如表26所示。

灌胃15天后，空白组小鼠肠道内乳酸菌数均在10⁷CFU/ml；实验组乳酸菌数均明显高于空白组，其中ZK002组乳酸菌数高于ATCC7469组乳酸菌数。

小鼠内大肠杆菌属均为10²CFU/ml，实验组大肠杆菌低于对照组，其中ZK002组大肠杆菌菌数最少。

表26不同鼠李糖乳杆菌对小鼠肠道乳酸菌和大肠杆菌的影响

组别	乳酸菌(10<sup>7</sup>CFU/ml)	大肠杆菌(10<sup>2</sup>CFU/ml)
			空白组	1.52±0.27	2.31±0.34
ZK002组	7.83±0.33	0.68±0.19
			ATCC7469组	6.55±0.41	0.82±0.23

鼠李糖乳杆菌ZK002还可以促进肠道内的乳酸菌生成，同时降低大肠杆菌的数量，也可以达到促进消化以及灭菌的效果。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于调节肠道菌群的组合物，其特征在于，所述组合物中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827动物双歧杆菌作为其有效成分；所述组合物中还包括植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌作为其有效成分；所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19825，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19826。

2.一种调节肠道菌群的饲料，其特征在于，所述调节肠道菌群的饲料中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19827的动物双歧杆菌作为有效成分；所述饲料中还含有植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌作为其有效成分；所述植物乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19825，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CGMCC NO.19826。

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