CN114836358A - 罗伊氏乳杆菌sxdt-32及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及益生菌领域,具体涉及罗伊氏乳杆菌SXDT‑32及其应用。其保藏编号为CGMCC No.24727。该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用;能在动物体内定植,并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强;可以牢固的黏附定植于动物肠道中,抑制病原微生物在肠道中生长,提高动物肠道免疫力,缓解动物结肠炎症,降低动物腹泻和死亡率,改善动物肠道健康,此外,还可提高动物生长性能。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌领域,具体涉及罗伊氏乳杆菌SXDT-32及其应用。
背景技术
早期断奶引起的应激主要表现为仔猪腹泻,从而导致仔猪生长性能降低,死亡率提高。虽然抗生素在过去的几十年里显著提高了腹泻的治疗效果,但常导致耐药菌株的产生、传播以及食品中的抗生素残留已经成为一个严重的问题。因此,许多国家正在逐步禁止在动物生产中使用抗生素。然而,禁抗导致了仔猪腹泻发生率和死亡率陡然增加。因此,迫切需要开发针对腹泻的绿色安全、高效无毒的治疗方法。
目前,对于益生菌的研究已然成为了热点。已发现益生菌能在肠道健康和疾病治疗方面表现出巨大的潜力。是一种潜在的抗生素替代品。
发明内容
本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32。
本发明的再一目的是提供上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的应用。
本发明的再一目的是提供一种生物菌剂。
本发明的再一目的是提供一种饲料添加剂。
本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32,其保藏编号为CGMCCNo. 24727。
本发明提供了含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的菌剂。所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂,可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明提供了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32用于制备以下制剂的应用:
抑制病原微生物;
促进动物生长的制剂
治疗结肠炎症的制剂;
降低腹泻率的制剂;或
提高肠道免疫力的制剂。
优选地,所述病原微生物为细菌。更优选为革兰氏阴性菌。
作为本发明的一种实施方式,所述病原微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。
根据本发明的动物饲料添加剂,其含有上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32。
以上所述的动物饲料添加剂或动物饲料含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的发酵菌体。
本发明提供含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32的菌剂。
本发明所述的菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂,可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明通过实验证明,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用;能在动物体内定植,并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强;可以促进动物生长,改善结肠炎症,降低腹泻率,提高肠道免疫力,改善肠道健康。
本发明的有益效果在于:本发明通过在马身猪粪便中分离获得一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32,该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌具有很好的抑制作用;能在动物体内定植,并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强;以葡聚糖硫酸钠(DSS)建立小鼠结肠炎症损伤模型,发现该菌株能够缓解并治疗小鼠结肠炎症,缓解因DSS引起的小鼠体重降低和结肠长度缩短;在对7-30日龄的仔猪饲养试验中也显示出,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32能显著降低仔猪腹泻率,并能提高仔猪21日龄和30日龄重。罗伊氏乳杆菌可以牢固的黏附定植于动物肠道中,抑制病原微生物在肠道中生长,提高动物肠道免疫力,缓解动物结肠炎症,降低动物腹泻和死亡率,改善动物肠道健康,此外,还可提高动物生长性能。
附图说明
图1为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的生长曲线;
图2为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32 的孔雀石绿染色后油镜镜检图;
图3为本发明实施例2中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的菌落形态图;
图4为本发明实施例3中小鼠试验方案实施图;
图5为本发明实施例3中试验小鼠整个试验期体重变化图;
图6显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第7天时体重变化情况;
图7显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第13天时体重变化情况;
图8显示本发明实施例3中试验小鼠在试验开始后第18天时体重变化情况;
图9显示本发明实施例3中试验小鼠的结肠长度;
图10显示本发明实施例3中试验小鼠结肠HE染色以及根据结肠HE染色进行的病理评分;
图11显示本发明实施例4中仔猪在第21日龄和30日龄时的体重变化情况;
图12显示本发明实施例4中仔猪在整个试验期内的腹泻率统计结果。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32,该菌株于2022年 4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri,保藏编号为CGMCC No. 24727。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的分离与16S rRNA鉴定
罗伊氏乳杆菌的分离与鉴定:罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)分离自山西省大同市阳高县古城镇北方四季牧场的马身猪粪便中。
1、粪便收集:采集20头育肥马身猪粪便各1g,加入20ml含有20%甘油的无菌生理盐水进行旋涡混匀,并分装到无菌冻存管中,每管1ml。处理完成后置于干冰中,带回实验室保存于-80°C冰箱,直到使用。
2、菌株分离:取马身猪粪样1ml,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,吸取合适稀释度的稀释液0.1mL在MRS琼脂上均匀涂布,37°C培养48h后,将生长出的菌落通过平板划线接种到新的MRS固体培养基进行纯化培养48h。
3、菌株富集:将纯化培养后的菌株,在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌MRS肉汤培养基中,置于摇床中,37°C培养48h后进行16S rRNA鉴定,并将剩余部分与含有50%甘油的生理盐水混合,保存至-80°C冰箱。
4、16S rRNA鉴定:将富集后的菌液,使用细菌通用引物27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,进行菌落PCR扩增后,进行16S rDNA测序鉴定,将各个菌株的16S rDNA序列与数据库中所有已测定细菌的16S rDNA序列进行比对,其中发现有6株与乳杆菌属的Lactobacillus reuteri DSM20016的16S rDNA 序列的同源相似性最高,确定这6株菌种类别为罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)。
实施例2 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的特性检测
1、抑菌能力检测
病原指示菌选用2种常见致病菌:大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028。
采用牛津杯法测定菌株的抑菌活性。将大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028分别接种在LB肉汤培养基中,放置37°C培养箱中培养12-18h。将大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028菌株浓度分别用无菌生理盐水调整至1×108CFU/mL,各取200μl, 均匀涂布在LB琼脂培养基,将灭菌后的牛津杯均匀轻放在LB培养基上,在牛津杯中分别加入200μL已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的带有MRS肉汤的菌液。放置37°C培养箱中培养12h。用游标卡尺测量抑菌圈大小并评价抑菌效果。结果显示(表1),相比于其它5株罗伊氏乳杆菌,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32对大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028均有较强抑制效果,取得了最大的抑菌圈直径,并且显著高于SXDT-1菌株(p<0.05)。
表1 罗伊氏乳酸菌对病原菌的抑制能力
注:以上数值为抑菌圈直径,单位mm。
2、耐胆盐检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100mL的无菌生理盐水中,1h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示(表2),在0.3g/100mL的胆盐浓度下,相比较其它5株罗伊氏乳杆菌,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的存活率显著高于其它菌株(p<0.05),存活率达到18.44%左右。
表2罗伊氏乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%
3、耐人工胃液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml PH=1.5的人工胃液中,1h后采用平板涂布法测定活菌数。结果显示(表3),在pH=1.5的人工胃液1h后,相比较其它5株罗伊氏乳杆菌,其中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的存活率显著高于其它菌株(p<0.05),存活率达到19.60%左右。
表3罗伊氏乳杆菌在PH=1.5的人工胃液中的存活率%
4、耐人工肠液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml pH=6.8的人工胃液中,4h后采用平板涂布法测定活菌数。结果显示(表4),在人工肠液4h后,相比较其它5株罗伊氏乳杆菌,罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32存活率取得最大值,达到18.96%左右,并且显著高于SXDT-1、SXDT-21、SXDT-31菌株(p<0.05)。
表4罗伊氏乳杆菌在人工肠液的存活率%
5、生长曲线测定
按1%接种量从浓度为1×108CFU/mL的罗伊氏乳杆菌SXDT-32菌液中吸取定量的菌液接种到MRS肉汤培养基中,放入37°C的摇床中。每隔1h使用酶标仪测定发酵液在OD600的值。结果显示(图1),罗伊氏乳杆菌SXDT-32菌株在4h后即可进入对数生长期,14h进入平台期,最大活菌数达到2.7×108CFU/mL。
6、形态及菌落观察
将菌体涂抹在载玻片并对其烘干,用含有1%的孔雀石绿染色3分钟,染色完成后用去离子水缓慢冲洗,洗掉多余的染色液,烘干玻片后置于显微镜下油镜观察并拍照,结果显示于(图2)。用接种环蘸取一环菌液在MRS琼脂培养基进行划线,37°C培养48h后对其菌落形态进行观察,结果显示于(图3)。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32的微生物学特性如下:
(1)菌落形态:单菌落圆形,直径约1~2mm,呈现乳白色,不透明,菌落表面光滑微凸,边缘规则。
(2)染色后细菌形态呈现短杆状,无鞭毛,不运动。
(3)生长特性:在MRS液体培养基中,置于37°C摇床培养,4小时后开始进入对数生长期,14h进入平台期,最大活菌数为2.7×108CFU/mL。
实施例3 罗伊氏乳杆菌SXDT-32对DSS造模小鼠肠道健康的影响
通过以上实验,确定罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32菌株具有最好的抗逆益生特性,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 24727。因此保留罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32菌株用于后去实验。
一、实验方法
1、选取36只20日龄的ICR雄性小鼠,饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中,将鼠房的温度控制在21±2℃,光照/黑暗时间为12小时,并自由取食和饮水。
2、以葡聚糖硫酸钠(DSS)建立小鼠结肠炎症损伤模型,将所有小鼠随机分为三组:Con组,DSS组,L.r+DSS组。Con组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml的生理盐水,为期18天;DSS组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml的生理盐水(NS),为期18天,在试验的第8-13天,给小鼠饮用含有3%DSS的自来水6天;L.r+DSS组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml浓度为1×108CFU/mL的菌液,为期18天,在试验的第8-13天,给小鼠饮用含有3%DSS的自来水6天。具体试验方案见图4。试验过程中,每天测量小鼠体重,观察并记录小鼠的状态,存活情况,有无临床异常症状等。试验结束后测量结肠长度并采集小鼠结肠组织样本,将样本保存在4%的甲醛溶液中,用于HE染色,观察小鼠结肠形态,并对其进行病理评分。
二、实验结果
1、生长情况:整个试验中小鼠生长变化情况如图5所示,第7天各组间的小鼠体重没有明显差异(图6);第13天时,Con组小鼠体重显著高于DSS组和L.r+DSS组的小鼠体重,虽L.r+DSS组与DSS组的小鼠体重无显著差异,但是从数值上来看,L.r+DSS组的小鼠体重高于DSS组(图7);第18天时,L.r+DSS组小鼠体重与Con组无显著差异,且显著高于DSS组(图8)。
2、结肠长度:如图9所示,虽然Con组小鼠结肠长度与L.r+DSS组存在显著差异,但L.r+DSS组的小鼠结肠长度显著高于DSS组。
3、结肠形态及病理评分:如图10所示,DSS组小鼠结肠肠道出现严重的炎症细胞浸润,出现严重的炎症情况,L.r+DSS组小鼠肠道局部出现了炎症情况;病理评分显示,DSS组分值显著高于L.r+DSS组。这些结果预示着罗伊氏乳杆菌SXDT-32菌株可以很好的缓解和治疗小鼠结肠炎症,促进肠道健康。
实施例4罗伊氏乳杆菌SXDT-32对仔猪肠道健康的影响
一、实验方法
选用河北唐山某养殖场产的健康母猪40头(3 ~ 4岁,5 ~ 6胎)及其临产仔猪。在断奶前,所有育有哺乳仔猪的母猪分别被圈养在封闭的产房内,并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风,并定期消毒。
所有母猪被随机分为对照组(Con)和菌液饲喂组(L.r)。每组20头母猪,每窝选取14头仔猪。两组仔猪初始体重相近(初始BW =1.73±0.03 kg),并在21日龄开始断奶。Con组:从仔猪7日龄开始,对仔猪饲喂商用教槽料,使其自由采食,直至30日龄结束试验;L.r组:从仔猪7日龄开始,对仔猪饲喂额外含有5×1010CFU/kg罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32的同品牌商用教槽料,使其自由采食,直至30日龄结束试验。试验过程中,第21、30天测量仔猪体重,观察并记录仔猪的状态,统计仔猪腹泻率等。
二、实验结果
1、仔猪体重情况:如图11所示,L.r组仔猪在21日龄时的体重显著高于Con组;L.r组仔猪在30日龄时的体重也显著高于Con组。
2、腹泻率:如图12所示,L.r组仔猪的腹泻率显著低于Con组。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32,其特征在于,所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32的保藏编号为CGMCC No. 24727。
2.包含权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂是液体菌剂或固体菌剂。
4.权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32的用于制备以下制剂的应用:
抑制病原微生物的制剂;
促进动物生长的制剂
治疗结肠炎症的制剂;
降低腹泻率的制剂;或
提高肠道免疫力的制剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述病原微生物为细菌。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述病原微生物为革兰氏阴性菌。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述病原微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。
8.一种动物饲料添加剂,其特征在于,含有包含权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) SXDT-32,或者由所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SXDT-32发酵制备而得。
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