CN103937708B - 鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠李糖乳杆菌及其应用，涉及一株新的鼠李糖乳杆菌L1及其在改善细胞免疫调节中的应用。通过菌株分离、筛选，生物学鉴定：16SrDNA鉴定，特殊引物PCR和系统发育树分析，确定其在分类学上的属、种地位，判定其属于一株鼠李糖乳杆菌，并利用高效液相色谱法对其代谢产物做了检测，主成分为乳酸。同时，为确保安全性，对所述菌株抗生素抗性进行检测。进一步对所述菌株的胃肠道酸性和胆盐耐受性，肠上皮细胞粘附性，抗菌性，与病原菌竞争性粘附及长期服用对小鼠细胞免疫功能的影响进行研究，结果表明该乳杆菌安全有效，能明显提升动物机体免疫功能。

Description

鼠李糖乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及食品技术领域，更具体地讲，涉及从青贮饲料中分离的鼠李糖乳酸杆菌。

背景技术

国际上对益生菌的定义为：活的微生物，当摄入足够大数量时，对宿主有益健康作用。Probiotics: living microorganism, which when ingested or locally appliedin sufficient numbers, provide the consumer with one or more proven healthbenefits(EFFCA,2003)。益生菌的最大特点就在一个“活”字上，从饮用效果来说，普通乳酸菌要想到达肠胃产生良性作用，首先在销售过程中要保持存活，而且在饮用后还要抵抗胃液、胆汁的强酸性消化作用。

目前益生菌已经被认为是一类具有特定保健功能的微生态物质，对动物或人体健康具有重要意义。其保健功能大致有以下几点：A、减轻乳糖不耐受症状；B、抑制病原菌；C、提升胃肠道免疫功能；D、改善消化功能；E、抑制肿瘤发生；F、降低血浆胆固醇浓度。

迄今为止，科学家已发现的益生菌大体上可分成3大类，其中，市面上比较常见的是乳杆菌类和双歧杆菌类。

青贮饲料是把青饲料切碎，经密封、微生物发酵而成的一种耐贮存和适口性好的饲料。天然发酵青贮饲料中含丰富的微生物资源，其中乳酸菌的品质不仅决定了饲料质量的好坏，而且其自身也在食品、医药等轻工业有潜在的应用价值而倍受关注。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一株鼠李糖乳杆菌并保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供鼠李糖乳杆菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供鼠李糖乳杆菌L1，所述鼠李糖乳杆菌L1保藏编号为CCTCC NO: M 2014048。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供鼠李糖乳杆菌L1在制备发酵乳、健康食品及保健制品中的应用，所述健康食品及保健制品是指保护胃肠道系统、增强免疫力的食品或制品。

本发明鼠李糖乳杆菌L1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号 武汉大学 中国典型培养物保藏中心 邮编 430072，命名为鼠李糖乳杆菌L1（Lactobacillus rhamnosus L1），保藏日期为2014年2月27日，保藏编号为CCTCCNO: M 2014048。

本发明的有益效果：本发明从青贮饲料中分离鼠李糖乳杆菌，通过多种生物学方法，确定其在分类学上的属、种地位，判定其属于一株鼠李糖乳杆菌。本发明的鼠李糖乳杆菌对体内的不良环境，如溶菌酶、胃酸、胆汁酸盐具有较强的耐受性，并能在胃肠道定植，抵抗外界病原菌侵袭，对胃肠道系统产生保护作用，且具有增强免疫力的能力。因此，可应用于发酵乳、健康食品及保健制品中。

附图说明

图1. 采用乳酸菌通用16SrDNA扩增引物PCR扩增片段为1500bp左右证明该细菌属于乳酸菌。

图2. 利用该菌株16SrDNA序列结果和标准菌株进行比对分析（Mega4.1软件），以上系统发育树显示该菌株和鼠李糖乳杆菌亲缘关系最近，所述鼠李糖乳杆菌用1表示。

图3. 利用鼠李糖乳杆菌特殊引物进行PCR，得到约为586bp目标条带，进一步表明所述菌株属于鼠李糖乳杆菌。

图4. 高效液相色谱（HPLC）测定所述细菌发酵液的代谢物种类主要有乳酸、乙酸、柠檬酸，其中乳酸是其主要的代谢产物、含量较高。

图5. 溶钙环法测定所述鼠李糖乳杆菌产乳酸能力。在MRS固体培养基中添加1%的CaCO₃,划线培养所述鼠李糖乳杆菌，单菌落周围的CaCO₃被乳酸溶解，形成透明圈，进一步表明所述菌株具有产乳酸能力。

图6. 检测所述鼠李糖乳杆菌溶菌酶耐受性。在MRS培养基中添加25ug/mL溶菌酶，以MRS培养基为对照，检测OD600，所述菌株生长情况不受溶菌酶抑制，表明其对口腔环境具有耐受性。

图7. 检测所述鼠李糖乳杆菌胃酸、胆盐耐受性。pH2.5和0.3% 胆盐对所述菌株生长基本不抑制，进一步表明该菌株能耐受胃肠不良环境。

图8. 通过HeLa细胞和LS-174T细胞检测所述鼠李糖乳杆菌对上皮细胞的粘附性。所述菌株对肠上皮细胞LS-174T的粘附性明显高于对宫颈细胞HeLa，表明该菌株能在肠道中进行定植。

图9. 通过所述鼠李糖乳杆菌和病原菌E. coli对LS-174T细胞的粘附性，检测该菌株对病原菌对肠道的粘附竞争力。Assays: S代表单独粘附，Assay: L/P代表所述菌株先粘附，1h后洗脱，再用病原菌粘附。进一步表明，所述菌株能保护肠道，降低病原菌粘附率。

图10. 通过炎症因子检测所述鼠李糖乳杆菌对免疫调节的影响。不同浓度的所述菌株都能引起轻微的炎症反应，和病原菌过量的反应相比，不会损伤细胞核机体，只会引起机体免疫反应。

图11. 通过小鼠粪便中总细菌量检测所述鼠李糖乳杆菌对机体肠道微生物大环境的影响。所述菌株没有引起肠道微生物总量的大变化，表明该菌株不会破坏肠道微生物系统。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）L1）的分离纯化

取自然发酵的优质青贮饲料20g为乳杆菌分离样品，将其放入装有灭菌的生理盐水锥形瓶中，充分振荡，静置沉淀。取上清液200uL梯度稀释涂MRS固体平板培养基，在37℃下培养24-72h，然后挑取典型的菌落（菌落形态规则、圆形、凸起、边缘整齐、不透明、菌落为乳白色），进行革兰氏染色、镜检。革兰氏染色结果阳性，菌体细胞呈杆状或球状的菌株继续分离纯化得到单克隆菌株，4℃保存备用，继续进行生理生化试验。

乳酸茵的初步筛选使用MRS+CaCO₃固体培养基，对上述菌株进行平板反复划线得到单菌落，挑取能形成直径为l—3mm钙溶圈单菌落，进行HPLC分析、抗生素耐性分析、胃酸与胆汁盐耐性分析、肠上皮细胞的粘附性分析，挑取产乳酸能力强、对抗生素耐性低、对胃酸与胆汁盐耐性强、肠上皮细胞的粘附性高的菌株。由此获得所述革兰氏阳性乳杆菌，鉴定为鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）L1），进一步体外、体内系统检测菌株的益生特性，得到所述安全有效、能明显提升动物机体免疫功能的乳杆菌。

所述鼠李糖乳杆菌低温保存为-80℃，50%甘油冷冻保存。较短期保存也可以为-20℃冷冻保存，或者更短期保存可以为4℃冷藏保存。将获得的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为鼠李糖乳杆菌L1，保藏编号为CCTCC NO: M 2014048。

实施例2.分离鉴定本发明的鼠李糖乳杆菌

按照实施例1的方法分离得到一株细菌，通过平板划线法得到单克隆，分离株通过表型和分子分类方法进一步定性。该菌株的系统鉴定方法为：分离-16SrDNA鉴定-系统发育树-特殊引物PCR鉴定。

16SrDNA鉴定

16SrDNA扩增引物采用乳酸菌通用引物，

正向引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQ ID NO.1）；

反向引物为1495r：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'（SEQ ID NO.2）；。

扩增条件：用25ul体系进行扩增：PCR mix (TaKaRa) 12.5uL，模板1uL，引物（20uM）各0.5 uL，灭菌水10.5 uL。94 °C，30s；55 °C，30s；72 °C，1min；共30个循环。扩增产物用1%琼脂核酸电泳进行分析，120V，20min，maker为DL5000，并用凝胶成像系统拍照观察。

PCR扩增片段为1450bp。从图中可以看出在1500bp左右有明显条带，证明本细菌属于乳酸菌（图1）。

通过16SrDNA测序，然后用Mega4.1软件把目标16SrDNA和标准菌株进行比对分析。所述鼠李糖乳杆菌用1表示，通过系统发育树可以看出本细菌和鼠李糖乳杆菌亲缘关系最近（图2）。

接下来用鼠李糖乳杆菌特殊引物进行PCR，

正向引物为RH f：5'-TTGCATCTTG ATTTAATTTTG-3'（SEQ ID NO.3）；

反向引物为RH r：5'-AGTTTCCCAGTTT CCGATGC-3'（SEQ ID NO.4）。

扩增条件如上述。PCR扩增片段约为586bp。从图3中可以看出在500bp和750bp之间出现明显条带，目标条带约为586bp，证明本细菌属于鼠李糖乳杆菌。其16SrDNA 序列已向NCBI提交，序列号为KF670602。

所述细菌在37℃，兼性有氧情况下，在MRS琼脂上和MRS液体基础培养基中生长良好。

实施例3.菌株的表型

通过高效液相色谱法（HPLC）测定所述细菌发酵液的代谢物种类及含量。

条件：柱子：inertsil ODS-4(5um,250*4.6mm1.D)，流动相20mM NH₄HPO₄(pH2.0，H₃PO₄)，流速：0.8ml/min，上样量：20ul，在UV210nm进行检测。

测得其代谢产物中含有多种有机酸，如乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸等，其中乳酸含量较高，是其主要的代谢产物（图4）。

产乳酸能力用溶钙环法测定：在MRS固体培养基中添加1%的CaCO₃,高压灭菌后，摇匀倒平板，划线培养，单菌落周围的CaCO₃会被乳酸溶解，形成透明圈，说明所述鼠李糖乳杆菌具有产乳酸能力（图5）。

实施例4.抗生素抗性

利用滤纸片扩散法测定抗生素抗性。

抗生素用无菌水配置（氯霉素用酒精配置），用0.45um滤膜过滤后用滤纸片吸附，20ul/片。终浓度：卡那霉素30ug/片，氨苄霉素10ug/片，四环素30ug/片，红霉素15ug/片，氯霉素30ug/片，万古霉素30ug/片，环丙沙星5ug/片，甲硝唑5ug/片。

所述鼠李糖乳杆菌培养至对数期，取100ul涂平板，吹干后贴滤纸片，37℃，兼性有氧情况下培养24h后，检测抑菌圈。除了甲硝唑和万古霉素不产生抑菌圈，即所述鼠李糖乳杆菌对两者不敏感，其他的抗生素，包括和临床相关的四环素和万古霉素，都对本细菌有不同程度的抑制作用（表1）。

表1. 兼性有氧情况下利用滤纸片扩散法检测鼠李糖乳杆菌抗生素敏感性

抗生素

氨苄青霉素

卡那霉素

四环素

氯霉素

环丙沙星

甲硝唑

万古霉素

红霉素

抑菌圈

++++

+

++++

++++

+++

-

-

++++

-:0mm +:1-10mm ++:11-15mm +++:16-20mm ++++:>21mm。

实施例5.胃肠道耐受性实验

溶菌酶耐受性：MRS液体培养基中加入25ug/ml溶菌酶，不加溶菌酶的MRS作为对照，分别培养所述鼠李糖乳杆菌，厌氧条件下，37℃培养0h，1h，3h，4h后，各取100ul检测OD600。从图中可看出溶菌酶没有对所述鼠李糖乳杆菌的生长产生抑制作用，表明该菌株能很好的耐受口腔溶菌酶环境（图6）。

胃肠道耐受性实验：24h培养的菌液，3000r，5min，4℃,用生理盐水洗两次，在pH2.5的MRS液体培养基中重悬，37℃，兼性有氧情况下培养1.5h后，3000r，5min，4℃,用生理盐水洗两次，在加入0.3%胆盐，pH6.8的MRS液体培养基中重悬，37℃，兼性有氧情况下培养2h，分别计算菌落形成单位（CFU），计算存活率。从图中可看出所述鼠李糖乳杆菌能很好的耐受胃酸与胆汁酸盐，生长基本不受抑制（图7）。

实施例6.所述鼠李糖乳杆菌对肠上皮细胞的粘附性

细菌准备

所述鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，约10⁷/ml~10⁸/ml，用PBS洗2次，然后用不含抗生素的RPMI 1640或DMEM细胞培养液重悬。

细胞准备

在24孔板中用RPMI 1640或DMEM细胞培养液培养HeLa和LS-174T细胞到10⁵/孔，用PBS洗2次。

把用RPMI 1640或DMEM重悬的细菌加入到细胞中，1ml/孔，共培养2h。然后用PBS洗2次，洗去未吸附的细菌，胰酶消化后，PBS重悬，计算粘附前后的菌落形成单位，并计算及粘附率。可看出所述鼠李糖乳杆菌对肠来源的细胞LS-174T有良好的粘附作用（图8）。

实施例7.抗菌性

为了检测所述鼠李糖乳杆菌对病原菌的抑制性，同用滤纸片扩散法测定。所述鼠李糖乳杆菌培养至对数期，10,000r，10min，取上清，用0.45um滤膜过滤后用滤纸片吸附，10ul/片。

病原菌：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌培养至对数期，各取100ul涂平板，吹干后贴滤纸片，37℃，兼性有氧情况下培养24h后，检测抑菌圈。所述鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌有一定的抑制性，对其他病原菌没有明显的抑制作用（表2）。

表2. 鼠李糖乳杆菌对其他病原菌的抑制作用

病原菌	大肠杆菌	沙门氏菌	志贺氏菌	单增李斯特菌	金黄色葡萄球菌
						抑菌圈(mm)	7.97±0.21	0	0	0	0

实施例8.对病原菌的抑制

细菌准备

所述鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，约10⁷/ml~10⁸/ml，用PBS洗2次，然后用不含抗生素的DMEM细胞培养液重悬。

大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，约10⁷/ml~10⁸/ml，用PBS洗2次，然后用不含抗生素的DMEM细胞培养液重悬。

细胞准备

在24孔板中用DMEM细胞培养液培养LS-174T细胞到10⁵/孔，用PBS洗2次。

把DMEM重悬的所述鼠李糖乳杆菌加入到细胞中，1ml/孔，共培养1h。然后用PBS洗2次，洗去未吸附的细菌。再用DMEM重悬的大肠杆菌加入到细胞中，1ml/孔，共培养1h。然后用PBS洗2次，洗去未吸附的细菌。胰酶消化后，PBS重悬，提取RNA，通过鼠李糖乳杆菌和大肠杆菌的引物进行Real-Time PCR。

引物：

LAB：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQ ID NO.5）；

5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'（SEQ ID NO.6）；

E. coli ：5'-GACCTCGGTTTAGTTCACAGA-3'（SEQ ID NO.7）；

5'-CACACGCTGACGCTGACCA-3' （SEQ ID NO.8）。

根据结果，先加入所述鼠李糖乳杆菌使大肠杆菌的粘附率下降了-84.1%，表明该菌株能明显抑制大肠杆菌对细胞粘附，有抑制病原菌，保护肠道的作用（图9）。

实施例9.对炎症因子的诱导

细菌准备

所述鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，稀释成3个浓度梯度，约10⁵/ml， 10⁶/ml， 10⁷/ml，用PBS洗2次，然后用不含抗生素的RPMI 1640细胞培养液重悬。

大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，稀释成3个浓度梯度，约10⁵/ml， 10⁶/ml， 10⁷/ml，用PBS洗2次，然后用不含抗生素的RPMI 1640细胞培养液重悬。

细胞准备

在24孔板中用RPMI 1640细胞培养液培养THP-1细胞到10⁵/孔，然后用不含抗生素的RPMI 1640细胞培养液重悬。

把用RPMI 1640重悬的不同浓度所述鼠李糖乳杆菌和大肠杆菌加入到细胞中，1ml/孔，共培养1h。提取RNA，通过炎症因子IL-8，IL-1β，TNFα的引物进行Real-Time PCR（β-action为内参）。

引物：

IL-8：5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGT-3'（SEQ ID NO.9）；

5'-TCCTTGGCAAAACTGCACCT-3'（SEQ ID NO.10）；

IL-1β：5'-GCAGTCTACACAGCTTCGGG-3'（SEQ ID NO.11）；

5'-CCGCCTCAGCCTCCCAAAG-3'（SEQ ID NO.12）；

TNFα：5'-AGGCGCTCCCCAAGAAGACA-3'（SEQ ID NO.13）；

5'-TCCTTGGCAAAACTGCACCT-3'（SEQ ID NO.14）；

β-action：5'-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3'（SEQ ID NO.15）；

5'-GGATAGCACAGCCTGGATAG-3'（SEQ ID NO.16）。

数据用2^-∆∆CT方法进行处理。根据结果，所述鼠李糖乳杆菌能产生一定炎症因子，促进免疫调控发生，同时诱导的炎症因子产量比大肠杆菌的诱导量明显微弱，说明不至于引起过量的炎症因子而对细胞及机体造成损伤，有调控免疫功能的作用（图10）。

实施例10.对BALB/C小鼠免疫功能的作用

细菌准备

所述鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃，兼性有氧情况下培养24h，4000r，15min，然后用10%脱脂牛奶重悬成约 1*10⁶/ml， 1*10⁷/ml，2*10⁷/ml。

小鼠准备

24只四周龄的BALB/C小鼠饲养2周，分成4组，为对照组，低剂量组，中剂量组，高剂量组。然后持续灌胃35天，对照组只灌脱脂牛奶，低剂量组，中剂量组和高剂量组分别用10%脱脂牛奶重悬成约 1*10⁶/ml， 1*10⁷/ml，2*10⁷/ml的鼠李糖乳杆菌灌胃，灌胃剂量为10uL/g。

灌胃期间对小鼠粪便中微生物数量进行检测，每周取新鲜小鼠粪便用生理盐水进行稀释，TSA培养基涂板，计菌落数目（图11）。根据结果，所述鼠李糖乳杆菌不会对宿主胃肠道菌群大环境造成改变。

灌胃结束后，小鼠眼眶取血400ul，红细胞裂解液进行处理，处理后的细胞用100uLPBS重悬，并用CD3-FITC，CD8-PE，CD4-PerCP抗体各0.8uL ，4℃避光染色40min，然后用100uL 4%多聚甲醛进行固定。流式细胞仪测CD3，CD4，CD8细胞含量（表3）。根据结果，所述鼠李糖乳杆菌能提高淋巴细胞CD3，CD4，CD8的含量，并增大CD4/CD8的比值，即能增强宿主免疫力。

表3. 鼠李糖乳杆菌对宿主免疫力的影响

%	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
					对照	54.48±6.11	35.12±1.18	16.32±0.63	2.16±0.15
低剂量	55.95±3.99	38.31±4.24	17.64±1.07	2.18±0.31
					中剂量	56.28±1.63	39.58±1.89	16.69±1.78	2.40±0.34
高剂量	56.70±5.21	38.80±2.79	17.92±2.76	2.19±0.24

该菌株能明显提高淋巴细胞CD3，CD4，CD8的含量，并增大CD4/CD8的比值。

本发明从自然发酵的优质青贮饲料样品中分离、筛选性状优良的乳酸杆菌鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）L1，采用体外耐酸实验、耐胆酸盐实验、肠上皮细胞粘附性实验等证实该菌株具有潜在益生作用，动物实验也表明该乳杆菌安全有效，能明显提升动物机体免疫功能。所以，本发明的鼠李糖乳杆菌对体内的不良环境，如溶菌酶、胃酸、胆汁酸盐具有较强的耐受性，并能在胃肠道定植，抵抗外界病原菌侵袭，对胃肠道系统产生保护作用，且具有增强免疫力的能力，可应用于发酵乳、健康食品及保健制品中。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 鼠李糖乳杆菌及其应用

<130> /

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctacggctac cttgttacga 20

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<211> 21

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ggatagcaca gcctggatag 20

Claims (2)

1.鼠李糖乳杆菌L1，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌L1保藏编号为CCTCC NO: M2014048。

2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌L1在制备发酵乳、健康食品及保健制品中的应用，所述健康食品及保健制品是指保护胃肠道系统、增强免疫力的食品或制品。