CN104480032B - 一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，及含有所述菌株的组合物，其中所述的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为：CGMCC6326。该菌株具有提高机体免疫力的能力，所述组合物为食品或药物组合物形式。本发明还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过提高调节机体的脏器指数、非特异性免疫及特异性免疫反应来达到提高机体免疫力的方法。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。

Description

一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有免疫调节活性的植物乳杆菌。
背景技术
益生菌是指一类对宿主产生有益作用的活性微生物，通过定植于宿主肠道、生殖系统内，能够对宿主产生确切的健康功效，从而改善宿主体内微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。乳酸菌作为益生菌中最具代表性的菌属，具有帮助消化、促进营养物质的吸收、缓解乳糖不耐症、预防和治疗腹泻、调节肠道菌群和缓解便秘、调节机体免疫功能、降低血液总的胆固醇、改善食物引起的过敏性疾病、延缓衰老及抗肿瘤等生理活性。
随着年龄的增长、人们的生活与工作压力不断增大、饮食作息不合理、以及环境污染等原因造成亚健康人群不断增加，而亚健康最明显的症状就是机体免疫力低下，从而易引起其他疾病。大量体内外及临床实验表明乳酸菌具有调节机体免疫力的活性，市场上也相继出现具有改善机体免疫力的乳酸菌产品，深受消费者的欢迎。然而，目前中国市场的乳酸菌产品使用的菌株多为国外供应商提供的菌株，如丹麦科汉森公司的动物双歧杆菌BB12、芬兰维利奥公司的鼠李糖乳杆菌LGG等，国内研发的具有自主知识产权的调节免疫力的菌株少之又少，能够成功上市的菌株更是凤毛麟角。
目前，国内外研究比较多的有双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌等菌株。然而，由于乳酸菌的益生活性具有菌株特异性，不同菌株之间的益生活性差别较大。因此，需要更有针对性的筛选具有特殊生理活性的菌株，特别是我国有大量的传统发酵食品，其中有大量的乳酸菌亟待研究与开发。
发明内容
本发明目的是提供一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，以便解决中国市场上乳酸菌产品使用的菌株的国产化问题。
本发明提供的植物乳杆菌是从中国传统泡菜中分离得到的植物乳杆菌BC299，该菌株具有提高机体免疫力的活性。该菌株由天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室分离并保藏，编号BC299；该菌株已于2012年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC 6326，建议分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
本发明同时提供了一种组合物，该组合物是包含所述植物乳杆菌BC299菌株的生理上可接受的赋形剂或稀释剂，可以是食品或药品。所述的植物乳杆菌BC299为活菌或死菌或该菌株的衍生物。
所述的食品可以是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬或其他含有该菌株或该菌株衍生物的食品的任何一种。所述的药品是胶囊、粉剂、片剂或其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂的任何一种。
本发明所提供的组合物可以用于增强机体的免疫反应，为口服形式。具体包括：
用于提高机体的免疫脏器指数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨噬细胞的吞噬活性、NK细胞的杀伤活性及DTH反应；
或者，用于调节机体的IL-12或IFN-γ或IL-10或免疫球蛋白IgG的产生；
或者，用于调节肠道菌群，抑制肠道大肠杆菌的增殖或促进肠道乳酸杆菌的增殖。
此外，本发明还提供了利用植物乳杆菌BC299菌株制备用于调节机体免疫力的食品或药品的方法。
本发明所述食品或药品的用途可广义包括一种提高机体免疫力、改善肠道菌群的方法，所述方法包括给予哺乳动物可达到提高免疫力效果剂量的该菌株的组合物。
无须做进一步阐述，本发明所属领域技术人员根据上述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，以下说明仅作为示例说明，并非以任何方式限制其余的揭露内容。若本文所述及的明确完整事物已在与本发明有关的相关技术中出现已知的同等物时，这些已知的同等物将视为独立事项并入本文中。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一株具有免疫调节及改善肠道菌群的植物乳杆菌BC299，该菌株可以通过调节机体的非特异性免疫功和特异性免疫功能，从而达到提高机体免疫力的目的。此外，植物乳杆菌BC299还可有效抑制肠道内大肠杆菌的增殖，促进乳酸杆菌的增殖，可有效改善机体内肠道菌群的平衡。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。本发明菌株可以是食品或药品形式的组合物，并可为发酵食品提供特殊的风味与口感。
附图说明
图1所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299在显微镜和扫描电镜下观察到的个体形态。
图2所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299体外促进BALB/c小鼠脾细胞增殖的效果，RPMI-1640细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。
图3所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299体外促进鼠源巨噬细胞株RAW264.7增殖的效果，RPMI-1640细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。
图4所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对体重的影响，生理盐水为空白对照组。
图5所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其摄食量的影响，生理盐水为空白对照组。
图6所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其脾淋巴细胞转化的影响，生理盐水为空白对照组，其中包括脂多糖(LPS)诱导B细胞转化和刀豆蛋白A(ConA)诱导T细胞转化。
图7所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其脾脏巨噬细胞吞噬能力的影响，生理盐水为空白对照组，。
图8所示为BALB/c小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌BC299后，对其外周血T淋巴细胞亚群的影响，生理盐水为空白对照组，。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术特点，图中显示的具体实施例是目前最佳的，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
首先，本发明提供了一株分离自泡菜中、具有免疫调节活性的植物乳杆菌BC299，该菌株由天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室分离并保藏，编号BC299；于2012年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为：CGMCC 6326。
实施例1：菌株的分离与培养
采集中国传统泡菜，经研磨后，无菌生理盐水梯度稀释至适当浓度，采用平板涂布法涂布于MRS平板培养基上，于37℃下静置厌氧培养36～72h，培养得乳杆菌疑似菌株的各菌落。取该菌落涂布于MRS平板培养基上，于37℃下静置厌氧培养36～72h，挑取单菌落做进一步纯化，依照以下实施例2进行菌株鉴定，获得分离菌株BC299。
将分离菌株采用划线法接种于MRS平板培养基上，于37℃下厌氧培养36～72h，挑取单菌落至0.5～2mL新鲜无菌的MRS液体培养基中，于37±2℃下厌氧培养24～48h，待菌株生长状况良好后，以1％～4％(v/v)的接种量接种至5～8mL新鲜无菌的MRS液体培养基中，于37±2℃下厌氧培养18～24h。重复此步骤直至菌株回复活力，培养所得菌液供后续实验使用。
实施例2：菌株鉴定
2.1、初步分析
根据菌种鉴定的标准方法进行初步分析，结果表明本发明的分离菌株BC299为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性杆菌(附图1)，无运动性，不产孢子，于有氧及厌氧条件下均能生长。
2.2、16S rDNA的PCR分析
以菌株BC299的基因组DNA为模板，向PCR管中添加细菌通用引物(P1序列为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；P2序列为：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等试剂后，进行PCR扩增。
各试剂添加量及扩增程序如下：
各试剂添加量：DNA基因组(100ng/μL)1μL作为PCR反应模板，0.5mmol/L引物P1、P2各1μL，10×PCR buffer(含Mg2+)2μL，dNTPs(2mmol/L)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL，ddH2O 13μL；总体系20μL。
16S rDNA PCR反应程序：94℃，10min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，110s；30循环后72℃延伸10min。反应结束后，采用琼脂糖电泳分析PCR产物，对产物片段进行切胶回收。纯化后的产物进行序列分析。测序结果与GeneBank中的标准株序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源性比较，并计算同源性百分比，选取相似度最高的菌种名称作为初步鉴定结果。
菌株BC299的16S rDNA PCR产物扩增片断的测序结果显示，该菌株的基因序列与乳杆菌属的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的同源相似性为99％(登录号：JX280493.1)。
2.3菌株BC299的API 50CHL系统鉴定
挑取活化好的乳酸菌菌落，在API 50CHL培养基中制得相当于2McFarland浑浊度的菌悬浮液，将此菌的悬浮液加入API 50CHL试剂条中，进行系统鉴定。阳性结果记为“+”，阴性结果记为“－”，将结果输入系统测定软件中，通过归纳菌株测试结果确定其归属的种类。
表1 菌株BC299的API鉴定分析结果
Figure BDA0000591123940000051
测试结果通过系统软件进行比对后，显示菌株BC299为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
综合上述结果，本发明的分离菌株BC299属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
实施例3：植物乳杆菌BC299的耐酸耐胆盐试验
为了检测植物乳杆菌BC299是否能够顺利通过胃肠道的酸性和高胆盐环境，从而得以顺利地在肠道发挥其提高免疫力的功能，实验流程如下：
将植物乳杆菌BC299于MRS液体培养基中连续活化至恢复活力后，以4％(v/v)的接种量接种于pH值为2.0的MRS液体培养基中，37℃静置厌氧培养。分别于0、30、60、90、120min进行取样，梯度稀释至10-5～10-7后，采用平板涂布法进行菌落计数(平均值±SD)，确定菌株对胃酸的耐受性。
此外，将活化后的植物乳杆菌BC299以4％(v/v)的接种量接种于含有0.3％(w/v)牛胆盐的MRS液体培养基中，以不含胆盐的MRS液体培养基作为对照，37℃静置厌氧培养。每隔30min取样，梯度稀释至10-4～10-6后，采用平板涂布法进行菌落计数(平均值±SD)，确定菌株对胃酸的耐受性。
表2 植物乳杆菌BC299在pH2.0条件下的耐胃酸能力
Figure BDA0000591123940000061
由表2可知，在pH 2.0的条件下，植物乳杆菌BC299在2h内菌活数由(2.51±1.01)×108cfu/mL下降到(1.81±1.58)×106cfu/mL，仍有足够数量的活菌可以通过胃部环境。
表3 植物乳杆菌BC299对胆盐的耐受性实验
Figure BDA0000591123940000062
由表3可知，植物乳杆菌BC299在0.3％(w/v)的胆盐浓度下，5h内其菌活由初始的5.34×107下降到1.94×106cfu/mL，说明该菌株具有良好的胆盐耐受性，可以在肠道中定植并发挥益生作用。
实施例4：免疫调节活性分析
4.1体外细胞试验
4.1.1对BALB/c小鼠脾细胞增殖的影响
颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，用RPMI-1640培养基进行漂洗，用注射器活塞芯轻轻挤压，过200目尼龙网后离心(1000r/min，5min)，弃去上清，加入红细胞裂解液(RPMI-1640：红细胞裂解液＝2：1)，吹打混匀2min，离心(1000r/min，5min)，重复2～3次，以除去红细胞，得到脾细胞悬液，备用。
将小鼠脾细胞悬液浓度调整至1×106/mL后加入至96孔板中(180μL/孔)，然后加入植物乳杆菌BC299的菌悬液(20μL/孔)，细胞:菌体＝1:10。混匀后，置于饱和湿度、37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养48h。采用MTT法检测植物乳杆菌BC299对BALB/c小鼠脾细胞增殖的影响，空白对照组为RPMI-1640培养基，阳性对照组为脂多糖(10μg/mL)。
统计分析结果如表4及图2所示，以平均值±SD表示。植物乳杆菌BC299可非常显著促进BALB/c小鼠脾细胞的增殖(p<0.01)。
表4 植物乳杆菌BC299对BALB/c小鼠脾细胞增殖的影响
Figure BDA0000591123940000071
4.1.2对巨噬细胞株RAW264.7的增殖的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，通过血球计数板计数后，用RPMI-1640培养基将细胞浓度调整至1×106个/mL。然后加入至96孔细胞培养板中(200μL/孔)，置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养24h。用PBS洗3次后，加入植物乳杆菌BC299的菌悬液，细胞:菌体＝1:10。混匀后，置于饱和湿度、37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养48h。采用MTT法检测植物乳杆菌BC299对巨噬细胞株RAW264.7增殖的影响。空白对照组为RPMI-1640培养基，阳性对照组为脂多糖(10μg/mL)。
统计分析结果如表5及图3所示，以平均值±SD表示。植物乳杆菌BC299可显著促进巨噬细胞株RAW264.7增殖(p<0.01)。
表5 植物乳杆菌BC299对巨噬细胞株RAW264.7增殖的影响
Figure BDA0000591123940000072
4.2动物实验
4.2.1菌粉的制备
将保存于-80℃的测试菌植物乳杆菌BC299进行平板划线、镜检、活化及扩大培养，经离心后(4℃，8000r/min，20min)，弃去上清收集菌泥，将菌泥重悬于适当的保护剂中，-80℃下预冻4h后进行真空冷冻干燥，得到本发明的植物乳杆菌BC299菌粉(1.2×1011cfu/g)。
4.2.2动物来源及日常管理
选取SPF级BALB/c雌性小鼠，18-22g，购自中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK(京)2009-0017，饲养于天津科技大学食品工程与生物技术学院屏障系统动物实验中心。饲养条件：温度为23±1℃，昼夜光照交替12h，自由摄水和饮食。
将BALB/c小鼠分为空白对照组与实验组，10只/组。实验组每天灌喂0.4mL受试菌株悬浮液(1×109cfu/mL)，空白对照组灌喂无菌生理盐水，0.4mL/只，连续30d。
4.2.3数据统计分析
试验结果以平均值±SD表示。实验结果采用SPSS(Windows version 13.0，SPSSInc.，Chicago，IL，USA)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，均值比较用Lsd和Duncan法。
4.2.4BALB/c小鼠体重的检测
试验期间，每5d记录一次小鼠的摄食量，每6d称量一次小鼠体重，以评估喂食受试益生菌对小鼠生长的影响。
表6 小鼠摄食量的测定结果
Figure BDA0000591123940000081
表7 小鼠体重测定结果
Figure BDA0000591123940000082
试验结果如表6、表7以及图4和图5所示，与空白对照组相比，喂食本发明菌株能够提高小鼠摄食量，促进肠道对营养物质的吸收利用，进而增加体重。
4.2.5免疫脏器指数的测定
于实验第30d，颈椎脱臼致死后立刻解剖，摘取胸腺和脾脏，小心去除粘附的其它组织，用吸水纸轻轻吸取表面粘液后进行称重。试验结果以平均值±SD表示。
Figure BDA0000591123940000083
Figure BDA0000591123940000084
式中：m1—脾脏重量(mg)；
m2—胸腺重量(mg)；
M—体重(g)。
表8 小鼠免疫脏器指数测定结果
Figure BDA0000591123940000085
注：与空白对照组相比，*：p＜0.05。
实验结果由表8可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，能显著提高BALB/c小鼠免疫器官胸腺指数与脾指数(p<0.05)。
4.2.6小鼠血液中白细胞数的测定
于实验第30d，对BALB/c小鼠眼眶取血，准确吸血20μL，枪头外壁无血，迅速将血轻轻放入盛有380μL白细胞稀释液中，摇匀。按红细胞计数的方法，将白细胞混悬液滴入计数池内，静置2-3min，待白细胞下沉后计数。在低倍镜下，白细胞呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特点可与杂质相区别。
白细胞数＝5个大格的总数*500
表9 BALB/c小鼠血液中白细胞数测定结果
Figure BDA0000591123940000091
注：与空白对照组相比，**：p＜0.01。
由表9可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，血液中的白细胞的数量能非常显著的增加(p<0.01)，说明其能够降低机体免疫系统的损伤程度，起到免疫调节的作用。
4.2.7BALB/c小鼠脾淋巴细胞转化的测定
BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至1×106个/mL，加入至96孔细胞培养板中(100μL/孔)，分别添加100μL ConA(终浓度为5μg/mL)和LPS(终浓度为10μg/mL)，以RPMI-1640培养基为空白对照，每组均设3个平行孔，置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养48h。采用MTT法测定受试菌株对脾淋巴细胞转化的影响。结果以刺激指数表示如下：
刺激指数(SI)＝样品组OD570/空白组OD570
结果如图6所示，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，能够显著提高其脾淋巴细胞的转化(p<0.05)，说明本发明菌株能够提高BALB/c小鼠脾淋巴细胞的免疫水平。
4.2.8BALB/c小鼠脾脏巨噬细胞吞噬活性的测定
BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至1×106个/mL，加入至96孔细胞培养板中(200μL/孔)，置于饱和湿度、37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2h，弃去上清和未贴壁细胞，PBS洗2次，除去未贴壁细胞，则得巨噬细胞。加入RPMI-1640细胞培养基(200μL/孔)，置于饱和湿度、37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养4h，弃去培养基，加入0.072％(m/v)中性红溶液(100μL/孔)，反应30min后弃去中性红溶液。用PBS液洗2次，加入细胞溶解(V冰醋酸:V乙醇＝1:1，100μL/孔)，4℃过夜，待细胞完全溶解后，酶标仪570nm处测定吸光度值。
结果如图7所示，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，能够非常显著提高其脾脏巨噬细胞的吞噬能力(p<0.01)。说明本发明菌株具有活化巨噬细胞的能力，从而能够提高机体的非特异性免疫功能。
4.2.9BALB/c小鼠NK细胞活性的测定
①靶细胞的制备：取处于对数生长期的H22肝癌细胞，用RPMI-1640培养基洗涤1次，离心(1000r/min，5min)弃去上清液，将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬后计数，并用台盼蓝染色检查活细胞数量(细胞活性应大于95％)，调整细胞浓度至1×106个/mL，备用。
②BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至2×107/mL，作为效应细胞。取靶细胞(H22细胞)和效应细胞各100μL(效靶比20:1)，加入至96孔细胞培养板中，另设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔，上述各项均设3个平行孔。于饱和湿度、37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4h，MTT法测定NK细胞的活性。NK细胞活性结果的表示如下：
Figure BDA0000591123940000101
式中：OD1—实验孔平均OD570值；
OD2—效应细胞孔平均OD570值；
OD3—靶细胞孔平均OD570值。
表10 BALB/c小鼠脾脏NK细胞活性的测定结果
Figure BDA0000591123940000102
注：与空白对照组相比，**：p＜0.01。
由表10可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，其脾脏NK细胞的杀伤活性得到非常显著的提高(p<0.01)。说明本发明菌株能够提高机体的非特异性免疫功能。
4.2.10小鼠迟发型变态反应(DTH)实验
BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d，于第25d时，对小鼠腹部进行刮毛，范围约3×3cm，将DNFB溶液(50μL)均匀涂抹致敏，以涂抹不含DNFB的丙酮橄榄油溶液的小鼠为对照。5d后，于每只小鼠的左耳两面均匀涂抹DNFB溶液，24h后脱臼致死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。左右耳之差即为DTH程度。
表11 BALB/c小鼠DTH反应的测定
Figure BDA0000591123940000111
注：与空白对照组相比，**：p＜0.01。
由表11可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，BALB/c小鼠左右耳的重量差值为18.9±1.06，呈现出非常显著的差异(p<0.01)。说明本发明菌株能有效地提高小鼠的细胞免疫，从而能够调节机体的免疫能力，使机体的免疫状态更加稳定。
4.2.11BALB/c小鼠血清中相关细胞因子和IgG的测定
BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d，末次灌喂菌悬液24h之后，摘除眼球取血于EP管中。待析出血清时，离心(3000r/min，15min)取上清液，置于-80℃低温冰箱中保存，待测。使用ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中相关细胞因子和IgG的水平。
表12 BALB/c小鼠血清中相关细胞因子和IgG的测定
Figure BDA0000591123940000112
注：与空白对照组相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01，n＝10。
由表12可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，血清中IL-12和IFN-γ的含量呈显著增加(p<0.05)，IL-10和IgG的含量成非常显著的增加(p<0.01)；而炎症因子TNF-α的含量无显著差别。说明本发明菌株具有提高机体细胞免疫及体液免疫的功能。
4.2.12BALB/c小鼠外周血T淋巴细胞亚群测定
此实验采用流式细胞术双抗标记法检测BALB/c小鼠外周血T淋巴细胞外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+细胞百分含量。BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d，末次灌喂菌悬液1h后，摘取眼球采集全血于EP管中，加入肝素钠抗凝血1～1.5mL(每毫升血液中加一个单位的肝素钠)，取100μL抗凝血，按照以下步骤制备流式细胞仪检测样品。
①将每份血样分别分装到试管中100μL，并进行编号，每个试管各加入经三蒸水10倍稀释的溶血素各1mL，溶解红细胞。
②常温下作用10min后，离心(1500r/min，5min)弃上清，倒置于滤纸上吸掉残留上清液。
③弃去上清液后，加入PBS缓冲液(pH值为7.3)1mL，均匀震荡后离心(5min，1500r/min)，弃上清液，倒置于滤纸上吸掉残留上清液。
④再重复③的操作，洗涤离心。
⑤加入PBS缓冲液各200μL。
⑥各测试管分别加入稀释好的CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群荧光抗体，避光冰浴30min。
⑦分别加入1mL PBS缓冲液，摇匀后离心(1500r/min，5min)弃去上清。
⑧加入PBS缓冲液200μL，均匀震荡，移入进样管。
⑨将上述上样管逐个安放在流式细胞仪上，进行检测分析。
表13 BALB/c小鼠外周血T淋巴细胞亚群测定
Figure BDA0000591123940000121
注：与空白对照组相比，*：p＜0.05，n＝10。
由表13及图8可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，其外周血T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞的含量(p<0.05)呈现出显著升高。CD3+T淋巴细胞含量的升高使BALB/c小鼠的T淋巴细胞处于激活状态，这种现象是免疫增强的表现；CD4+T淋巴细胞含量的升高有利于辅助体液免疫，并且介导细胞免疫来调节机体的免疫作用，而CD8+T淋巴细胞的含量的升高，有利于机体免疫水平的提高。
此外，CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值一般在2/1左右，比值过高或者过低都会对机体的免疫调节产生不良的影响，从而影响机体的健康。BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，CD4+/CD8+T淋巴细胞的比例得到了优化，改善了小鼠外周血T淋巴细胞亚群的动态平衡，促进机体的免疫反应，增强机体的免疫功能。
4.2.13BALB/c小鼠粪便中微生物菌数变化的测定
BALB/c小鼠连续灌喂受试菌悬液30d，以无菌生理盐水为空白对照。于试验的第6、12、18、24、30d收集小鼠粪便，进行乳杆菌和大肠杆菌计数。采用梯度稀释法将粪便稀释至适当浓度后，均匀涂布在LBs和EMB琼脂平板中，每组实验均设三个平行。乳杆菌于37℃下厌氧静置培养48h后进行计数，大肠杆菌于37℃有氧静置培养24h后进行计数。
表14 BALB/c小鼠粪便中乳杆菌的变化
Figure BDA0000591123940000122
注：与空白对照组相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01，n＝3。
表15 BALB/c小鼠粪便中大肠杆菌的变化
Figure BDA0000591123940000131
注：与空白对照组相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01，n＝3。
由表14及表15可知，与空白对照组相比，BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株后，随灌喂时间的延长粪便中大肠杆菌的数量逐渐降低(由3.8×109cfu/g降低到1.5×108cfu/g)；而乳杆菌的数量逐渐升高(由1.5×109cfu/g升高到1.4×1010cfu/g)。BALB/c小鼠在灌喂本发明菌株24d后，粪便中乳杆菌的数量显著高于空白对照组组。这说明本发明菌株能够调节机体的肠道菌群。
以上结果证实，本发明分离菌株植物乳杆菌BC299能够提高机体的免疫脏器指数、非特异性免疫功能和特异性免疫功能，并能够调节机体的肠道菌群，从而达到提高机体免疫力的活性。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。
本发明的组合物，含有以上所述菌株及其衍生物所组合而成的各种组合物，可以是食品，如发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有该菌株及其衍生物的任何一种食品。或者，该组合物含有该菌株及其衍生物的胶囊、粉剂、片剂或其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂。
以上所述是通过实施例说明本发明的特点，其目的在于使本领域的研究技术人员能够在了解本发明及不背离本发明精神的基础之上，据以实施。需要注意的是，本发明并不受限于说明书中实施事例所揭示的专利范围。故凡其他未脱离本发明所揭示的精神而完成的等效修饰或修改，仍应包含在所述的权利要求范围中。

Claims (3)

1.一株植物乳杆菌BC299 (Lactobacillus plantarum BC299)在制备增强免疫功能的食品或药品中的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌BC299保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 6326；
所述增强免疫功能包括用于提高机体的免疫脏器指数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨噬细胞的吞噬活性、NK细胞的杀伤活性及DTH反应；或者，用于调节机体的IL-12或IFN-γ或IL-10或免疫球蛋白IgG的产生；
所述的植物乳杆菌BC299为活菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食品是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬中的任何一种。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药品剂型为胶囊、粉剂、片剂中的任何一种。
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