CN110878269B - 一种新型植物乳杆菌rp1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型植物乳杆菌RP1及其应用，属于微生态技术领域。所述植物乳杆菌RP1为本申请发明人从某规模化养猪场健康断奶仔猪的粪便中分离筛选得到，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018802。植物乳杆菌RP1具有较强的抗逆性、产酸能力和体外抑菌能力，还具有较强的免疫活性调节能力，可用于制备预防或治疗细菌感染性疾病、提高免疫力的微生态制剂及药物制剂，还可用于预防仔猪腹泻、促进仔猪生长的饲料添加剂。

Description

一种新型植物乳杆菌RP1及其应用

技术领域

本发明属于微生态技术领域，具体涉及一种新型植物乳杆菌RP1及其应用。

背景技术

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于革兰氏阳性菌，是一种厌氧或兼性厌氧菌。在自然界广泛存在，也存在于人体胃肠道中，通过胃并定植于肠道发挥有益作用，是人体胃肠道内的益生菌群。目前已有大量研究表明，植物乳杆菌安全性高，具有多种益生功能如调节肠道菌群平衡、改善胃肠道功能、参与免疫系统调节等。在食品发酵、工业生产、动物饲料及医疗保健等领域，都有着广泛的应用。

现代养猪业普遍采用早期断奶技术，而断奶后的仔猪腹泻是影响生产性能的关键因素。据统计，我国因为仔猪腹泻而造成的经济损失每年多达上千万元。其中细菌感染引起的腹泻中大肠杆菌是最主要的病原之一，大肠杆菌是消化道内的常在菌，早期寄生于仔猪的结肠内。在哺乳期时，由于母源抗体的保护及母乳中其他抑制物质抑制了大肠杆菌的繁殖，当断奶后，当蛋白质等未消化的物质在肠道后段腐败发酵增多，仔猪本身主动免疫力降低，为大肠杆菌的入侵和繁殖提供了条件。另外沙门氏菌、魏氏梭菌(也称C型产气荚膜梭菌)也是引起仔猪腹泻的主要细菌性因素。因此，如何有效的预防断奶后仔猪腹泻、促进仔猪生长是养殖场亟待解决的一大问题。

由于抗生素的长期、大量使用，耐药性、肠道菌群失衡、药物残留等种种弊端已经日益严重，同时也潜在的危害到了人类健康。微生态制剂已成为目前使用较多的绿色、安全的饲料添加剂。

发明内容

本发明的第一方面，提拱了一种植物乳杆菌RP1，该菌株是本申请发明人从某规模化养猪场健康断奶仔猪的粪便中分离筛选得到，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，菌株号为RP1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏号是CCTCCNO：M 2018802，保藏日期为2018.11.19。

本发明的第二方面，提供了植物乳杆菌RP1在预防或治疗细菌感染性疾病的制剂中的应用。

本发明的第三方面，提供了植物乳杆菌RP1在提高免疫力的制剂中的应用。

上述所述制剂可以是微生态制剂，也可以是药物制剂。

本发明的第四方面，提供了植物乳杆菌RP1在饲料添加剂中的应用。

所述饲料添加剂可用于预防仔猪腹泻、促进仔猪生长。

本发明的第五方面，还提供了一种含有植物乳杆菌RP1的饲料添加剂。

所述饲料添加剂中各组分为植物乳杆菌RP1、益生元、有机酸盐、载体。

所述饲料添加剂中各组分按重量份计为：植物乳杆菌RP10.5-2份、益生元10-15份、有机酸盐100-300份，载体补至1000份。

所述植物乳杆菌RP1的菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/g。

所述益生元为低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖中的一种或几种。

所述有机酸盐为山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或几种。

所述载体为玉米芯粉、麦饭石、碳酸钙、谷壳粉、海泡石粉、稻壳粉、沸石粉、蒙脱石中的一种或几种。

所述饲料添加剂的制备方法为：按重量份配比分别称取原料，先将植物乳杆菌和益生元进行均匀混合，再加入有机酸盐混匀，再加入载体，将所有原料混合均匀，即得。

所述饲料添加剂的使用方法为：每吨饲料中添加1-2kg的本发明饲料添加剂。

有益效果：

1.本发明所述的新型植物乳杆菌RP1具有较强的抗逆性、产酸能力和体外抑菌能力，还具有较强的免疫活性调节能力，能显著提高RAW264.7细胞的增殖和吞噬活性，促进RAW264.7细胞NO以及细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-10的分泌量。该菌株性能优良，具有很高的研究价值和应用价值，可应用于预防或治疗细菌感染性疾病、提高免疫力的微生态制剂及药物制剂。

2.本发明通过将植物乳杆菌RP1应用到饲料添加剂中，与益生元共同作用增加肠道中有益菌的数量，并通过添加有机酸盐来抑制肠道中有害菌的生长，从而达到提高仔猪免疫力，预防断奶后仔猪细菌性腹泻并促进仔猪生长的效果。

附图说明

图1实施例1中菌株的镜检结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1植物乳杆菌RP1的分离和筛选及鉴定

实验材料：平谷地区28天正常仔猪的粪便、MRS琼脂培养基(1％的1.6％的溴甲酚紫)、TPY琼脂培养基(1％的1.6％的溴甲酚紫)、脱脂奶酵母粉琼脂培养基(1％的1.6％的溴甲酚紫)、MRS琼脂培养基(50ug/ml的链霉素)、TPY琼脂培养基(50ug/ml的链霉素)、脱脂奶酵母粉琼脂培养基(50ug/ml的链霉素)、9ml无菌水的试管。

实验步骤：

(1)菌落分离纯化：称取1g粪便，加入到9ml无菌水试管中，混匀，依次做10倍稀释。分别取稀释了10⁵、10⁶、10⁷的试管中0.1ml上清液分别涂布到三种培养基表面，每个梯度做2个平行；用无菌接种环蘸取稀释了10³、10⁴的试管中的上清液，分别在三种培养基表面三区划线，每个梯度做2个重复。37℃厌氧培养48h后，找出能使培养基变黄的单菌落，镜检并记录。

(2)抗性平皿检测菌株：植物乳杆菌为革兰氏阳性菌，可以在含有50ug/ml链霉素的培养基上生长，而革兰氏阴性菌则不生长。将纯化后的菌株在抗性培养基上三区划线，37℃培养40h，观察平皿上是否有菌落，镜检后与是否与接种菌相同。

(3)将经抗性检测后所得菌株进行基因测序。

实验结果：

从粪便中共分离得到12种单菌落，将12株菌进行抗性实验后，除去相同培养基不同梯度间的相同菌落，最终分离结果为：MRS琼脂培养基上有三种菌分别编号为M1、M2、M3，脱脂奶酵母粉琼脂培养基上有两种菌分别编号为N1、N2，TPY琼脂培养基上有三种菌分别编号T1、T2、T3。将这8株菌进行镜检，结果如图1所示。

将8株菌进行测序后，通过序列对比，筛选出一株新的植物乳杆菌，即植物乳杆菌RP1(如图1中N1所示)。植物乳杆菌RP1的16S rDNA序列测序结果显示的碱基序列如SEQIDNO.1所示。

实施例2植物乳杆菌RP1的抗逆性研究

实验材料：无菌生理盐水、试管、猪胆盐、稀盐酸、MRS液体培养基

实验菌种：植物乳杆菌RP1、植物乳杆菌1、植物乳杆菌2、植物乳杆菌3

实验步骤：

(1)将实验菌种活化两代，得到实验菌种菌液。将4种菌液离心得到菌泥，检测菌泥的活菌数。

(2)用生理盐水配制0.1％的猪胆盐溶液和pH＝3的溶液。用0.1％猪胆盐溶液和pH＝3的溶液分别溶解4种菌泥，将每种菌泥稀释成1×10¹⁰CFU/mL。

(3)在37℃恒温培养箱中静置6h后，检测每种溶液的菌数，计算成活率。耐胆盐实验结果见表1，耐酸实验结果见表2：

表1 4种实验菌种的耐胆盐实验结果

实验菌种	存活率
		植物乳杆菌1	78％
植物乳杆菌2	75％
		植物乳杆菌3	76％
植物乳杆菌RP1	88％

表2 4种实验菌种耐酸实验结果

实验菌种	存活率
		植物乳杆菌1	82％
植物乳杆菌2	84％
		植物乳杆菌3	85％
植物乳杆菌RP1	92％

由表1结果可知，植物乳杆菌RP1的存活率明显高于其他3种植物乳杆菌，说明植物乳杆菌RP1具有较强的胆盐耐受能力。

由表2结果可知，植物乳杆菌RP1的存活率都明显高于其他3种植物乳杆菌，说明植物乳杆菌RP1具有较强的酸耐受能力。

综合以上实验结果得，植物乳杆菌RP1对胆盐和酸均表现出良好的耐受能力，说明植物乳杆菌RP1具有良好的抗逆性。

实施例3植物乳杆菌RP1与3株植物乳杆菌抑菌试验

实验材料：MRS液体培养基、营养肉汤固体培养基、营养肉汤液体培养基、培养皿

实验菌种：植物乳杆菌RP1、植物乳杆菌1、植物乳杆菌2、植物乳杆菌3

指示菌种：大肠杆菌标准菌株、金黄色葡萄球菌标准菌株

实验步骤：

(1)将实验菌种和指示菌种分别活化两代，得到实验菌种菌液和指示菌种菌液。

(2)在营养肉汤固体培养基40℃左右时，将活化好的指示菌种菌液接种到营养肉汤固体培养基中，混合均匀，倒入培养皿中，制得大肠杆菌固体指示培养基和金黄色葡萄球菌固体指示培养基。用12mm的打孔器在固体指示培养基打4个孔。

(3)将每种实验菌种菌液注入孔中，每孔70uL，每种实验菌种4个平行。将培养皿置于37℃恒温培养箱培养16h。实验结果见表3：

表3实验菌种抑菌试验结果

实验菌种	大肠球菌抑菌圈直径(mm)	金黄色葡萄球菌抑菌圈直径(mm)
			植物乳杆菌1	15.18	20.45
植物乳杆菌2	17.35	18.25
			植物乳杆菌3	16.07	19.85
植物乳杆菌RP1	23.45	25.68

植物乳杆菌RP1和植物乳杆菌1、植物乳杆菌2、植物乳杆菌3对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的大小可表明其抑菌效果，抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。由表3实验结果可知植物乳杆菌RP1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果比其他3种植物乳杆菌都强，说明其具有优良的抑菌效果，可用于制备防治细菌感染性疾病的制剂。

实施例4植物乳杆菌RP1的免疫调节活性

实验材料：小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7体外细胞模型、DMEM培养基、MRS液体培养基、Griess试剂、0.1％(m/v)中性红溶液、细胞裂解液等

实验菌种：植物乳杆菌RP1、植物乳杆菌1、植物乳杆菌2

实验步骤：

(1)菌株的活化及前处理

将7株植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，连续活化两代后用于菌活计数(梯度稀释涂布法)及细胞实验。将培养至对数期的菌株，在4℃条件下，5000rpm离心10min，收集菌体后，PBS重悬稀释后，使用DMEM完全培养基调整至工作浓度。

(2)3株植物乳杆菌对RAW264.7细胞的增殖、吞噬活性、NO及细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-10)分泌量的影响

以小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7体外细胞模型，以植物乳杆菌RP1及其他2种植物乳杆菌为实验对象，以DMEM培养基作为空白对照，分别采用MTT法、中性红法、Griess法及ELISA试剂盒法测定3株植物乳杆菌对RAW264.7细胞的增殖、吞噬活性、NO及细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-10)分泌量的影响，初步确定具有潜在免疫调节活性的益生植物乳杆菌菌株。实验结果见表4。

表4不同菌株对小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7体外细胞的影响

项目	空白对照	植物乳杆菌RP1	植物乳杆菌1	植物乳杆菌2
					细胞增值能力	0.90±0.04b	1.06±0.02a	0.93±0.02b	0.87±0.08b
细胞吞噬能力	0.53±0.01b	0.59±0.01a	0.63±0.03a	0.55±0.02b
					NO分泌能力	7.71±0.01b	11.16±0.03a	10.45±0.06a	8.12±0.03b
细胞因子TNF-α的分泌能力	98.85±0.81b	125.52±0.84a	98.37±3.82b	100.25±1.67b
					细胞因子IFN-γ的分泌能力	110.38±1.07b	148.24±1.09a	103.37±1.25b	108.25±0.79b
细胞因子IL-10的分泌能力	80.25±1.60b	118.54±2.20a	98.22±1.36a	88.25±1.28b

注：a、b表示各处理组间有显著性差异(p＜0.05)

巨噬细胞不仅广泛分布于机体中，而且它是机体抵抗病原微生物感染的重要防线之一，在天然免疫中发挥极其重要的作用。巨噬细胞将各类病原性微生物摄入后形成吞噬体，再与溶酶体进行融合，形成吞噬溶酶体，在多种酶的作用下，通过多种途径杀灭或消化抗原性异物，从而达到保护机体免受感染的目的。

由表4可得，植物乳杆菌RP1能显著促进RAW264.7细胞的增殖和吞噬活性的提高，能够显著提高RAW264.7细胞NO、TNF-α、IFN-γ和IL-10的分泌量。本发明植物乳杆菌RP1具有突出的免疫活性调节能力，具有用于提高免疫力的制剂的较大潜力。

实施例5饲料添加剂的制备

按以下用量(1kg包装)称取各物质按照顺序依次进行混合：取植物乳杆菌RP10.5g和低聚木糖10g先进行混合，混合均匀后加入丙酸钙100g，加入玉米芯粉至1000g，混匀后即得本发明所述的饲料添加剂。

实施例6饲料添加剂的制备

按以下用量(1kg包装)称取各物质按照顺序依次进行混合：取植物乳杆菌RP12g和低聚果糖15g先进行混合，混合均匀后加入苯甲酸钠300g，加入海泡石粉至1000g，混匀后即得本发明所述的饲料添加剂。

实施例7饲料添加剂的制备

按以下用量(1kg包装)称取各物质按照顺序依次进行混合：取植物乳杆菌RP11g和低聚异麦芽糖13g先进行混合，混合均匀后加入双乙酸钠200g，加入麦饭石至1000g，混匀后即得本发明所述的饲料添加剂。

实施例8本发明饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响

实验材料：按照实施例7制得的饲料添加剂，每1kg拌料1000kg

实验动物：30日龄三元断奶仔猪

实验分组与管理：将150头健康平均体重在7kg左右的断奶仔猪，随机分成2组，每组3个重复，试验组添加1‰饲料添加剂，对照组不添加，其他实验条件不变，饲喂21d。

结果见表5：

表5饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响

项目	对照组	试验组
			头数(头)	75	75
初始均重(kg)	7.02±0.65	7.80±0.56
			结束均重(kg)	12.66±1.21	14.85±1.08
日均增重(g)	269±0.15	336±0.24
			日均采食量(g)	452±2.35	535±1.88
料肉比	1.68±0.90	1.59±0.85
			腹泻率(％)	1.43	0.40

由表5可知：试验组日均增重比对照组提高24.91％，饲料报酬率比对照组提高5.36％。仔猪腹泻率比对照组降低72.03％，有效缓解了断奶仔猪的腹泻的发生。结果表明该发明能够有效保持断奶仔猪肠道健康，缓解断奶应激，减少腹泻，提高仔猪生产性能，值得大力推广和应用。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种改进和变化，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。

序列表

<110> 瑞普（天津）生物药业有限公司

天津瑞普生物技术股份有限公司

<120> 一种新型植物乳杆菌RP1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1315

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 60

gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga atggctttaa 120

gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 180

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240

ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac tgataataag ggttgcgctc 300

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360

atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg catagtatgt caagacctgg 420

taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480

tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 540

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc attcatcgtt tacggtatgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc gagcctcagc gtcagttaca 660

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 720

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcttc 780

ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 840

ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900

gtggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta ctctcagata tgttcttctt 960

taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1020

ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1080

cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1140

gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1200

ctttcaaact cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1260

gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactc 1315

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RP1，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏号是CCTCC NO：M 2018802。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌RP1在制备用于预防或治疗动物细菌感染性疾病的制剂中的应用，所述细菌感染性疾病中的细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的一种或两种。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌RP1在制备用于提高动物免疫力的制剂中的应用。

4.如权利要求2或3所述的制剂，其特征在于，所述制剂是微生态制剂。

5.如权利要求2或3所述的制剂，其特征在于，所述制剂是药物制剂。

6.如权利要求1所述的植物乳杆菌RP1在制备饲料添加剂中的应用。

7.一种饲料添加剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的植物乳杆菌RP1。

8.根据权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中各组分为植物乳杆菌RP1、益生元、有机酸盐、载体；所述饲料添加剂中各组分按重量份计为：植物乳杆菌RP10.5-2份、益生元10-15份、有机酸盐100-300份，载体补至1000份。

9.根据权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于，所述益生元是低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖中的一种或几种；所述有机酸盐是山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或几种；所述载体是玉米芯粉、麦饭石、碳酸钙、谷壳粉、海泡石粉、稻壳粉、沸石粉、蒙脱石中的一种或几种。

Images