CN111096397A - 一种猪用合生元微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪用合生元微生态制剂及其制备方法和应用。一种猪用合生元微生态制剂，由活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌L47菌液，所述菌液质量2～3％的菊粉和/或2～3％的低聚果糖，及所述菌液质量5‑10％的菌体保护剂混合均匀后冻干而成。本发明提供合生元制剂在体外生长24h，乳酸菌活菌数能够达到9.4log cfu/mL以上，乳酸浓度能够达到176.56mM以上。该合生元微生态制剂可在单胃动物生产上应用，改善动物肠道菌群环境，促进动物生长。

Description

一种猪用合生元微生态制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于猪饲料添加剂领域，涉及一种猪用合生元微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
近些年来，越来越多的益生菌和益生元产品投入到畜牧生产中，以改善畜禽的肠道健康和生长性能。乳酸菌作为一类常用的益生菌，能够抑制病原菌的生长，促进机体对营养物质的吸收，提高机体免疫力和抗腹泻等；而益生菌要达到以上目的，必须能够通过胃肠道的过度，在结肠中定植，从而发挥作用。其面临的主要障碍是胃中的酸性条件及肠道中高浓度(1-10mM)的胆汁酸环境。益生元是指不能被单胃动物机体本身所分泌的酶消化的物质，通过选择性地刺激结肠中一种或几种细菌的生长或活性，从而改善肠道微生态环境，促进宿主健康；许多难以消化的碳水化合物(低聚果糖、菊粉、乳果糖、低聚半乳糖等)作为益生元在生产中使用。菊粉、低聚果糖是自然界中普遍存在的碳水化合物，绝大多数植物中都可以发现菊粉的存在，已有研究报道其能够作为益生元使用，它们对肠道的功能包括：调节微生物发酵，增加短链脂肪酸产量，降低pH和氨产量等。合生元制剂是指益生菌与益生元的复合制剂，其中益生元能够促进益生菌的生长，在发挥其益生作用的同时，促进益生菌在胃肠道中的生长和在结肠的定植。因此，合生元制剂在畜牧生产中具有广泛的应用前景。
目前市场上有大量的合生元组合产品，但由于不同益生菌与益生元和组合效应具有特异性，现有的合生元微生态制剂中菌株的稳定性得不到保证，益生元对益生菌的促进效应不明确。须了解特定益生菌与特定益生元的相容性和共生效应，才能获得更加适合在生产中使用的产品，改善畜禽肠道环境，促进机体健康。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种猪用合生元微生态制剂。
本发明的另一目的是提供该猪用合生元微生态制剂的制备方法。
本发明的又一目的是提供猪用合生元微生态制剂的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种猪用合生元微生态制剂，由活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L47菌液，所述菌液质量2～3％的菊粉和/或2～3％的低聚果糖，及所述菌液质量5-10％的菌体保护剂混合均匀后冻干而成；所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L47保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为CCTCC NO:M2019967。
作为本发明的一种优选，所述的低聚果糖聚合度DP＝2-9，菊粉聚合度DP＝2-60，均为多种不同聚合度果聚糖的混合物。
作为本发明的一种优选，所述的菌体保护剂选自脱脂奶粉、甘油或明胶。
本发明所述的猪用合生元微生态制剂的制备方法，包含以下步骤：
①植物乳杆菌L47通过在MRS培养基中，37℃培养24h进行菌体富集，离心、重悬后得到纯菌液；
②活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌菌液中加入所述菌液质量3％的菊粉和/或 3％的低聚果糖，加入所述菌液质量5-10％的菌体保护剂，混合后冻干即得。
其中，所述的MRS培养基配方组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL。
本发明所述的猪用合生元微生态制剂在猪饲料中的应用。
有益效果：
本发明提供合生元制剂在体外生长24h，乳酸菌活菌数能够达到9.4log cfu/mL以上，乳酸浓度能够达到176.56mM以上。
本发明通过配伍相互作用较强的益生菌及益生元，使两者能够协同作用，发挥“1+1>2”的效应，使用本发明提供的合生元饲料添加剂能够同时发挥乳酸菌和菊粉、低聚果糖的双重益生效果。该合生元微生态制剂可在单胃动物生产上应用，改善动物肠道菌群环境，促进动物生长。
本发明提供菌株筛选自猪胃肠道，能够很好的耐受猪胃肠道的环境，有利于菌株在肠道中存活、增殖和定植；该菌株特异性强，生长速度快、产酸高、抑菌、无毒害；
本发明提供的合生元饲料添加剂可在猪生产中使用，在高度集约化养殖模式下，能够达到改善猪生长性能及预防疾病的效果，促进养猪业的健康稳定发展。
附图说明
图1菌株在人工模拟胃肠液下的存活率
图2不同益生元对益生菌生长曲线的影响
生物材料保藏信息
L47,分类命名为植物乳杆菌L47 Lactobacillus plantarum L47,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉.武汉大学,保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为CCTCC NO:M2019967。
具体实施方式
乳酸菌在肠道内发挥益生作用，需具有较快的生长速度，这有利于其在肠道内快速生长繁殖，而良好的产酸性能有助于抑制肠道内有害菌增殖。此外乳酸菌还需对胃肠道具有良好的耐受能力，以保证通过胃部的强酸性环境和肠道内的胆盐环境。同时，有些益生乳酸菌对抗生素不敏感，说明其本身可能存在耐药基因，这种耐药基因存在于稳定性较差的质粒上，可能会对畜禽和人类造成危害。依据以上原则初步筛选一株具有益生性能的猪源植物乳杆菌。并筛选与该益生菌株配伍效果较好的益生元作为组合，制备合生元饲料添加剂。
实施例1
1.乳酸菌的分离、筛选
从不同生长阶段猪(仔猪、生长育肥猪、母猪)的肠道粘膜、食糜、粪便中初步筛选出 155猪乳酸菌，通过常规生化鉴定、产酸能力等筛选出4株产酸能力较强的乳酸菌。
2.模拟胃肠道消化
人工胃液：在pH为2.5的无菌生理盐水中，分别加入3.0g/L胃蛋白酶，充分溶解后，用无菌微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，得到人工胃液，备用。人工肠液：在pH为8.0的无菌生理盐水中，加入1.0g/L胰蛋白酶和1.8g/L胆盐，充分溶解后，过滤除菌备用。将活化后的菌液按10％(v/v)的接种量接入上述人工胃液中，于37℃培养4h；接入人工肠液中培养20h。采用涂布平板法对菌液进行活菌计数，并计算存活率。三株乳酸菌在胃肠道中的存活率较高。其中，L47在pH 2.5的人工胃液消化4h，其存活率达到了99.11％，且在模拟肠液消化后存活率达到了60％。将L47送交CCTCC保藏，保藏编号为CCTCC M 2019967。3益生菌、益生元复配组合筛选
分别将菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和乳果糖(10g/L)作为唯一碳源替代MRS中的葡萄糖制备培养基，以含葡萄糖的MRS培养基作为阳性对照。将活化至平台期(1.0×108)的乳酸菌按1％(v/v)的比例分别接种至上述培养基(10mL)中，于不同时间点测定菌液的光密度值(OD600)并绘制生长曲线，评价不同益生元对益生菌生长的影响，筛选出最优组合。如图2所示，与葡萄糖组相比，植物乳杆菌L47在与菊粉和低聚果糖复配时其最大OD600 值最高(分别为1.05vs 0.96和1.04vs 0.96)。因此，选择植物乳杆菌L47分别与菊粉和低聚果糖作为最佳组合进行下一步试验。
实施例2益生元与益生菌最适配比筛选
通过在培养基中添加不同比例(1-3％)的菊粉或低聚果糖，选择对植物乳杆菌L47产酸性能及生长速率影响最大的浓度，作为合生元微生态制剂的添加浓度。由表1和表2可知，在添加量为3％时，植物乳杆菌L47的产乳酸量及活菌数最大，因此选择3％为益生元的配伍添加含量。
表1不同低聚果糖添加比例对植物乳杆菌的影响
Figure RE-GDA0002400522210000041
表2不同菊粉添加比例对植物乳杆菌的影响
Figure RE-GDA0002400522210000042
实施例3合生元微生态制剂的制备
①植物乳杆菌通过在MRS培养基中，37℃培养24h进行菌体富集，离心、重悬后得到纯菌液，其中MRS培养基配方组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL。
②活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌菌液中加入所述菌液质量3％的菊粉和(或) 3％的低聚果糖，加入所述菌液质量5-10％的菌体保护剂(脱脂奶粉、甘油或明胶)，混合后冻干。其中低聚果糖聚合度DP＝2-9，菊粉聚合度DP＝2-60(多种不同聚合度果聚糖的混合物)。

Claims (6)

1.一种猪用合生元微生态制剂，其特征在于由活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L47菌液，所述菌液质量2～3％的菊粉和/或2～3％的低聚果糖，及所述菌液质量5-10％的菌体保护剂混合均匀后冻干而成；所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L47保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为CCTCC NO:M2019967。
2.根据权利要求1所述的猪用合生元微生态制剂，其特征在于所述的低聚果糖聚合度DP＝2-9，菊粉聚合度DP＝2-60，均为多种不同聚合度果聚糖的混合物。
3.根据权利要求1所述的猪用合生元微生态制剂，其特征在于所述的菌体保护剂选自脱脂奶粉、甘油或明胶。
4.权利要求1所述的猪用合生元微生态制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
①植物乳杆菌L47通过在MRS培养基中，37℃培养24h进行菌体富集，离心、重悬后得到纯菌液；
②活菌数大于10.0log cfu/mL的植物乳杆菌菌液中加入所述菌液质量3％的菊粉和/或3％的低聚果糖，加入所述菌液质量5-10％的菌体保护剂，混合后冻干即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于MRS培养基配方组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL。
6.权利要求1-3中任一项所述的猪用合生元微生态制剂在猪饲料中的应用。
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