CN117143781B - 植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用 - Google Patents

植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微生物技术领域的植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用，所述Mix后生元包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物，所述植物乳杆菌KLDS 0318的保藏号为CCTCC NO:M 20231317，所述植物乳杆菌KLDS 1009的保藏号为CGMCC No.9962。本发明的Mix后生元能够促进RAW264.7巨噬细胞增殖性能和吞噬性能，具有一定的免疫调节能力。

Description

植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
免疫系统是机体用于防御感染、抵御疾病的生物学结构和生物学过程的集合体，它具有免疫自稳、免疫监视以及免疫防御的生理功能。
免疫系统通过特化的器官将进入机体组织的微生物滤出并与之反应（机体能够识别进入的微生物，产生进行免疫防御的信号，激活相应的免疫组分，进行防御攻击，最后清除微生物），以及运用血流中流动的分子和细胞“部队”对攻击快速应答。
随着食品科学的进步，已有文献证明一种新的非“活”性的微生物可以对人体健康产生积极影响，它们通常被称为“后生元”、“副益生菌”“热灭活益生菌”。2021年国际益生菌和益生元科学协会（International Scientific Association for Probiotics andPrebiotics, ISAPP）将“对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分”定义为后生元。
近年来，后生元被发现具有免疫调节能力，尤其增强肠道免疫来改善机体健康状况。研究表明，后生元通过肠道调节宿主免疫系统，从而提高机体免疫力。研究人员通过体外实验证明了嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌上清液能够减少肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor α, TNF-α)的分泌，增加抗炎因子白介素-10（Interleukin-10，IL-10）的分泌，从而达到抗炎的作用。热灭活的格氏乳杆菌TMC0356免疫调节功能被发现优于活的格氏乳杆菌TMC0356，具体表现在热灭活的格氏乳杆菌TMC0356能够诱导巨噬细胞产生更多的白介素-12（Interleukin-10，IL-12），以及对N-乙酰壁酰胺酶具有更强的抵抗力。后生元干酪乳杆菌可增强促炎细胞因子的表达和Toll样受体2、Toll样受体3、Toll样受体4和Toll样受体9的转录，从而增强巨噬细胞介导的先天免疫应答。因此，后生元显示出免疫调节活性，这为宿主提供了健康益处。对于老年人、移植患者和早产新生儿等免疫功能低下个体来说，它们可能是更安全的替代品，并且可以消除益生菌的各种缺点。
因此，本申请提出植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供植物乳杆菌、Mix后生元及其制备方法与应用，不仅具有一定的免疫调节能力，还能够促进RAW264.7巨噬细胞增殖性能和吞噬性能。
为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
一方面，本发明提供一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌KLDS 0318或植物乳杆菌KLDS 1009；
所述植物乳杆菌KLDS 0318的保藏号为CCTCC NO:M 20231317；
所述植物乳杆菌KLDS 1009的保藏号为CGMCC No.9962。
另一方面，本发明提供一种Mix后生元，所述Mix后生元包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物。
进一步的，所述灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与所述灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
另一方面，本发明提供一种Mix后生元的制备方法，包括以下步骤：
a培养植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009；
b灭活步骤a培养好的植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009，获得植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元；
c 将植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元混合，获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物的Mix后生元。
进一步的，所述步骤a包括：
a1将植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得一代菌株；
a2 将步骤a1获得的一代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得二代菌株；
a3 将步骤a2获得的二代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得活化后的植物乳杆菌KLDS 0318菌液。
进一步的，所述步骤b包括：
b1将培养好的植物乳杆菌溶液离心；
b2用无菌PBS缓冲液洗涤离心后的菌株沉淀；
b3用无菌PBS缓冲液和洗涤后的菌株沉淀制备菌悬液；
b4水浴加热菌悬液灭活植物乳杆菌，以获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 0318后生元或包括灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
进一步的，所述Mix后生元中所述灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与所述灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
另一方面，本发明提供一种包含上述的Mix后生元或上述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元的制剂，所述制剂的剂型包括液剂、片剂、颗粒剂型、丸剂或胶囊剂。
另一方面，本发明提供一种上述的Mix后生元或上述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或饮料中的应用。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明的Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞不仅无毒，且在一定浓度下能促进细胞增殖和吞噬性能。后生元：细胞=100:1时，Mix后生元组对细胞增殖和吞噬性能的促进作用均最好。
本发明的Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞具有一定的免疫调节作用，并在一定范围内呈现剂量依赖关系，在后生元：细胞=100:1时，Mix后生元能通过提高RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α基因的表达，从而促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-6、IL-1β和TNF-α。
此外，本发明的植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元以及Mix后生元均能促进RAW264.7巨噬细胞免疫活性，因此，植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009能够作为潜在的免疫调节后生元菌株。
附图说明
图1为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞增殖能力的影响的柱状图；
图2为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响的柱状图；
图3为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞NO分泌量的影响的柱状图；
图4为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-6分泌量的影响的柱状图；
图5为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞TNF-α分泌量的影响的柱状图；
图6为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-1β分泌量的影响的柱状图；
图7为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-6炎症因子mRNA表达的影响的柱状图；
图8为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞TNF-α炎症因子mRNA表达的影响的柱状图；
图9为本发明一种实施例中Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-1β炎症因子mRNA表达的影响的柱状图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本申请的植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009分离于新疆传统发酵乳制品。
（1）植物乳杆菌KLDS 0318的分离、鉴定与保藏
取新疆伊犁河谷农户家中酸马奶10mL与90mL无菌PBS缓冲液混合，并震摇混匀，使酸马奶分散，获得酸马奶样品。
将酸奶样品用稀释液10倍梯度稀释，在10-6、10-7稀释度下分别取100 µL 涂布于mMRS 固体培养基上，置于37℃培养箱培养48-72 h 后，选取光滑、凸起、边缘水润的白色或乳白色菌落镜检。
用接种环挑取呈V、Y 或两端钝圆的杆状形态菌落，划线于mMRS固体培养基上，置于37℃培养箱培养72 h后，选取革兰氏阳性的菌落，重复划线纯化，直至获得镜检为纯菌株为止，在纯菌株加入等体积12.5 %的无菌甘油，编号为植物乳杆菌KLDS 0318，并置于-20℃冰箱中保存。
挑取纯菌落接种于mMRS 液体培养基，置于37℃培养箱培养24 h 以活化，经相同方法传代3 次后，置于4℃冰箱保藏备用。
将活化后的进行细菌组DNA提取，16s rDNA基因片段扩增反应，将扩增后的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物长度为1500 bp 左右且无杂带，将其送至测序公司进行双向测序。
将活化后的菌株植物乳杆菌KLDS 0318 进行16s 测序，将16s测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLAST 比对，使用Mega 7.0 软件并采用Neighbor-Joining 方法构建系统发育树，确定目的基因的归属，菌株植物乳杆菌KLDS 0318为Lactobacillus plantarum 植物乳杆菌KLDS 0318。
将植物乳杆菌KLDS 0318，于2023年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 20231317。
（2）植物乳杆菌KLDS 1009的分离、鉴定与保藏
取新疆伊犁河谷农户家中酸马奶10mL与90mL无菌PBS缓冲液混合，并震摇混匀，使酸马奶分散，获得酸马奶样品。
将酸奶样品用稀释液10倍梯度稀释，在10-6、10-7稀释度下分别取100 µL 涂布于mMRS 固体培养基上，置于37℃培养箱培养48-72 h 后，选取光滑、凸起、边缘水润的白色或乳白色菌落镜检。
用接种环挑取呈V、Y 或两端钝圆的杆状形态菌落，划线于mMRS固体培养基上，置于37℃培养箱培养72 h后，选取革兰氏阳性的菌落，重复划线纯化，直至获得镜检为纯菌株为止，在纯菌株加入等体积12.5 %的无菌甘油，编号为植物乳杆菌KLDS 1009，并置于-20℃冰箱中保存。
挑取纯菌落接种于mMRS 液体培养基，置于37℃培养箱培养24 h 以活化，经相同方法传代3 次后，置于4℃冰箱保藏备用。
将活化后的进行细菌组DNA提取，16s rDNA基因片段扩增反应，将扩增后的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物长度为1500 bp 左右且无杂带，将其送至测序公司进行双向测序。
将活化后的菌株植物乳杆菌KLDS 1009 进行16s 测序，将16s测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLAST 比对，使用Mega 7.0 软件并采用Neighbor-Joining 方法构建系统发育树，确定目的基因的归属，菌株植物乳杆菌KLDS 1009为Lactobacillus plantarum 植物乳杆菌KLDS 1009。
将植物乳杆菌KLDS 1009，于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9962。
本申请的Mix后生元包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物。
其中，灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与所述灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
具体的，本申请的Mix后生元的制备方法，包括以下步骤：
a培养植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009。
应用时，需要预先分别将植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009活化处理。本领域技术人员能够采用三代活化技术活化植物乳杆菌。
实际应用时，将活化的菌株保存在4℃冰箱中备用。
本申请的步骤a具体包括以下步骤：
a1将植物乳杆菌接种于Man-Rogosa-Sharp(MRS)液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得一代菌株。
应用时，分别将活化的植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009接种以2%（v/v）的接种量接种于各自对应的MRS液体培养基中，并置于37℃恒温培养箱中恒温培养24h，分别获得一代植物乳杆菌KLDS 0318和一代植物乳杆菌KLDS 1009，并放置于4℃冰箱中备用。
实际应用时，一代植物乳杆菌KLDS 0318的OD600为8.95，一代植物乳杆菌KLDS1009的OD600为8.79。
a2 将步骤a1获得的一代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得二代菌株。
应用时，分别将一代植物乳杆菌KLDS 0318和一代植物乳杆菌KLDS 1009以2%（v/v）的接种量接种于各自对应的新的MRS液体培养基中，并置于37℃恒温培养箱中恒温培养24h，获得二代植物乳杆菌KLDS 0318和二代植物乳杆菌KLDS 1009，并放置于4℃冰箱中备用。
实际应用时，二代植物乳杆菌KLDS 0318的OD600为9.00，二代植物乳杆菌KLDS1009的OD600为8.96。
a3 将步骤a2获得的二代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得活化后的植物乳杆菌KLDS 0318菌液。
应用时，分别将二代植物乳杆菌KLDS 0318和二代植物乳杆菌KLDS 1009以2%（v/v）的接种量接种于各自对应的5mL MRS液体培养基中，并置于37℃恒温培养箱中恒温培养18h，获得植物乳杆菌KLDS 0318菌液和植物乳杆菌KLDS 1009菌液，并放置于4℃冰箱中备用。
实际应用时，植物乳杆菌KLDS 0318菌液的OD600为9.00，二代植物乳杆菌KLDS1009菌液的OD600为8.96。
b灭活步骤a培养好的植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009，获得植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
应用时，灭活步骤a3培养好的植物乳杆菌KLDS 0318菌液和植物乳杆菌KLDS 1009菌液，获得植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
本申请的步骤b具体包括以下步骤：
b1将培养好的植物乳杆菌溶液离心。
应用时，分别将a3培养好的植物乳杆菌KLDS 0318菌液和植物乳杆菌KLDS 1009菌液离心处理，获得植物乳杆菌KLDS 0318菌株沉淀和植物乳杆菌KLDS 1009菌株沉淀。
实际应用时，离心力为6000 g，离心时间为10 min。
b2用无菌PBS缓冲液洗涤离心后的菌株沉淀。
应用时，分别用无菌PBS缓冲液洗涤植物乳杆菌KLDS 0318菌株沉淀和植物乳杆菌KLDS 1009菌株沉淀。
实际应用时，用无菌PBS缓冲液洗涤3遍离心后的菌株沉淀。
b3用无菌PBS缓冲液和洗涤后的菌株沉淀制备菌悬液。
应用时，用无菌PBS缓冲液和洗涤后的植物乳杆菌KLDS 0318菌株沉淀和植物乳杆菌KLDS 1009菌株沉淀制备植物乳杆菌KLDS 0318菌悬液和植物乳杆菌KLDS 1009菌悬液。
实际应用时，各菌悬液的浓度均为109 CFU/mL。
b4水浴加热菌悬液灭活植物乳杆菌，以获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 0318后生元或包括灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
应用时，将植物乳杆菌KLDS 0318菌悬液进行水浴加热，使各菌悬液中的菌株灭活，以获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 0318后生元；将植物乳杆菌KLDS 1009菌悬液进行水浴加热，使各菌悬液中的菌株灭活，以获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物的植物乳杆菌KLDS 1009后生元，并放置于4℃冰箱中备用。
实际应用时，水浴加热的水温为100℃，加热时间为5min。
本领域技术人员能够通过平板涂布法，将灭活的菌液涂布在Man-Rogosa-Sharp(MRS)固体培养基上，并置于37℃恒温培养箱中培养24h，若培养基中无菌落出现，则说明菌体完全灭活。
c 将植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元混合，获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318及其代谢产物和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009及其代谢产物的Mix后生元。
应用时，Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与灭活的植物乳杆菌KLDS1009的体积比为1:1。
本领域技术人员能够根据实际需要分别将植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元进行脱色、浓缩、干燥、过筛处理，获得粉态Mix后生元。
实际应用时，Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318的浓度为109CFU/mL，植物乳杆菌KLDS 1009的浓度为109CFU/mL。
此外，本领域技术人员能够根据上述的Mix后生元或制备方法制备一种包含上述的Mix后生元或上述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元的制剂。
应用时，制剂的剂型包括液剂、片剂、颗粒剂型、丸剂或胶囊剂。
此外，本领域技术人员能够将上述的Mix后生元或上述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元应用于制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或饮料中。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中:
植物乳杆菌KLDS 0318 (Lactobacillus plantarum 植物乳杆菌KLDS 0318) 分离于新疆传统发酵乳制品，保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 20231317，保藏日期2023年7月17日。
植物乳杆菌KLDS 0318的核苷酸序列如下：
CCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTGCATGTATAG
植物乳杆菌KLDS 1009 (Lactobacillus plantarum 植物乳杆菌KLDS 1009) 分离于新疆传统发酵乳制品，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9962，保藏日期2014年11月13日。
植物乳杆菌KLDS 1009的核苷酸序列如下：
CCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGCTCGTTCGACTGCATGTATAG
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7巨噬细胞株，购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；
10×磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline, PBS），生产厂商为北京索莱宝科技有限公司；
脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），生产厂商为兰杰柯科技有限公司；
高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM），生产厂商为大连美仑生物技术有限公司；
细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK8），生产厂商为大连美仑生物技术有限公司；
无菌磷酸盐缓冲液（PBS），生产厂商为大连美仑生物技术有限公司；
胎牛血清，生产厂商为南京维森特生物科技有限公司；
qRT-PCR试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
APE×BIO，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
一氧化氮检测试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
TNF-α酶联免疫吸附分析试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
IL-6酶联免疫吸附分析试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
IL-1β酶联免疫吸附分析试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
RNA提取试剂盒，生产厂商为上海碧云天生物技术有限公司；
DNA提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
中性红染色液（活细胞专用），生产厂商为北京雷根生物技术有限公司；
胰蛋白酶-EDTA，生产厂商为南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
电热恒温培养箱DHP-9272，生产厂商为上海一恒科技有限公司；
实时荧光定量PCR仪，生产厂商为上海枫岭生物技术有限公司；
台式高速冷冻离心机，生产厂商为赛默飞世尔科技有限公司；
超低温冰箱，生产厂商为青岛海尔生物医疗股份有限公司；
多功能酶标仪，生产厂商为美国Molecular Devices公司；
7000 PCR扩增仪，生产厂商为美国Applied Biosystems公司；
全自动高压灭菌锅HVE-50，生产厂商为日本HIRAYAMA；
洁净工作台VD-1320，生产厂商为北京东联哈尔仪器制造有限公司。
CO2培养箱，生产厂商为力康医疗生物科技控股有限公司。
Man-Rogosa-Sharp(MRS)液体培养基：
蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2.0g，牛肉膏5.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至5.8，121℃条件下灭菌15min。
Man-Rogosa-Sharp(MRS)固体培养基：
蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2.0g，牛肉膏5.0g，琼脂16.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至5.8，121℃条件下灭菌15min。
脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）溶液制备
将无菌的10 mg LPS粉末溶于10 mL无菌PBS缓冲液，混合均匀，配置成浓度为1mg/mL LPS原液，置于-20℃环境保存备用。使用时，利用高糖培养基将1 mg/mL 的LPS原液稀释为1 µg/mL LPS。
RAW264.7巨噬细胞培养
将RAW264.7巨噬细胞接种于无菌细胞培养瓶中，当细胞生长状态良好时进行传代。应用时，本领域技术人员认为当单层细胞贴壁生长至70%-80%时，细胞生长状态良好。
采用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞1-2 min后，往无菌细胞培养瓶中加入高糖培养基，以终止消化过程，将无菌细胞培养瓶中全部液体转移至15 mL无菌离心管中，离心处理，弃去上清液，向细胞沉淀加入完全培养基，按照1：3比例进行传代，传代后的细胞置于CO2培养箱中培养。
离心过程中：离心转速为1000 r/min，离心时间为5 min。
实施例1
本实施例分析Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞增殖能力的影响。
S11取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，并置于CO2培养箱培养24 h。
S12去除96孔板中培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤2次后，往96孔板中加入Mix后生元，并置于CO2培养箱继续培养24 h。
其中，Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
应用时，设置不同的浓度组：后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1、后生元：细胞=100:1以及后生元：细胞=1000:1。
其中，后生元：细胞=1:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1:1；后生元：细胞=10:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为10:1；后生元：细胞=100:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为100:1；后生元：细胞=1000:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1000:1。
S13用无菌PBS缓冲液洗涤2次，往96孔板中加入200 μL CCK8溶液，孵育30 min后，在450 nm处测量吸光度值，并做空白对照组。
S14 利用下式计算细胞相对增殖率：
细胞相对增殖率(%) =（处理组吸光度值/空白对照组吸光度值）×100。
实施例2
与实施例1的区别为将Mix后生元替换为1 µg/mL LPS。
实施例3
与实施例1的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 0318后生元。
实施例4
与实施例1的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
实施例5
本实施例分析Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响。
S11取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，并置于CO2培养箱培养24 h。
S12往96孔板中加入Mix后生元，并置于CO2培养箱继续培养24 h后，去除96孔板中培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤2次。
其中，Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
应用时，设置不同的浓度组：后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1、后生元：细胞=100:1以及后生元：细胞=1000:1。
其中，后生元：细胞=1:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1:1；后生元：细胞=10:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为10:1；后生元：细胞=100:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为100:1；后生元：细胞=1000:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1000:1。
S13往96孔板中加入200 μL中性红染色液，孵育30 min后，去除上清液，用无菌PBS缓冲液洗涤3次。
S14往96孔板中加入裂解液，孵育2h后，用多功能酶标仪测量540 nm处的吸光度值，并做空白对照组。
其中，裂解液为体积比为1:1混合的冰醋酸和无水乙醇。
实施例6
与实施例5的区别为将Mix后生元替换为1 µg/mL LPS。
实施例7
与实施例5的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 0318后生元。
实施例8
与实施例5的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
实施例9
本实施例分析Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞NO分泌量的影响。
S11取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，并置于CO2培养箱培养24 h。
S12去除6孔板中培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤2次后，往6孔板中加入Mix后生元，并置于CO2培养箱继续培养24 h。
其中， Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
应用时，设置不同的浓度组：后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1、后生元：细胞=100:1以及后生元：细胞=1000:1。
其中，后生元：细胞=1:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1:1；后生元：细胞=10:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为10:1；后生元：细胞=100:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为100:1；后生元：细胞=1000:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1000:1。
S13根据一氧化氮检测试剂盒(Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China)说明书，采用一氧化氮检测试剂盒检测RAW264.7巨噬细胞NO分泌量，并做空白对照组。
实施例10
与实施例9的区别为将Mix后生元替换为1 µg/mL LPS。
实施例11
与实施例9的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 0318后生元。
实施例12
与实施例9的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
实施例13
本实施例分析Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α分泌量的影响以及Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子mRNA表达的影响。
S11取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，并置于CO2培养箱培养24 h。
S12去除6孔板中培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤2次后，往6孔板中加入Mix后生元，并置于CO2培养箱继续培养24 h。
其中，Mix后生元中灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
应用时，设置不同的浓度组：后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1、后生元：细胞=100:1以及后生元：细胞=1000:1。
其中，后生元：细胞=1:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1:1；后生元：细胞=10:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为10:1；后生元：细胞=100:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为100:1；后生元：细胞=1000:1中Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞的体积比为1000:1。
S13根据TNF-α酶联免疫吸附分析试剂盒说明书、IL-6酶联免疫吸附分析试剂盒说明书以及IL-1β酶联免疫吸附分析试剂盒说明书，采用TNF-α酶联免疫吸附分析试剂盒、IL-6酶联免疫吸附分析试剂盒以及IL-1β酶联免疫吸附分析试剂盒检测RAW264.7巨噬细胞TNF-α分泌量、IL-6分泌量以及IL-1β分泌量，并做空白对照组。
S14 取步骤S13培养好的细胞，按照RNA抽提试剂盒说明书，采用RNA抽提试剂盒提取总RNA。
应用时，取浓度组为后生元：细胞=100:1组的细胞。
S15采用qRT-PCR试剂盒进行反转录和荧光定量PCR，并做空白对照组。
其中，平行实验为3组，反应体系为20uL，扩增反应条件为95℃、3min；95℃，5s；60℃，34s；95℃，15s；60℃、60s；95℃，15s。
应用时，实时荧光定量qRT-PCR引物参见表1，以GAPDH内参基因作对照。
实际应用时，采用2 –ΔΔCt法进行分析数据进行计算基因表达的相对倍数变化。
表1 实时荧光定量qRT-PCR引物
实施例14
与实施例13的区别为将Mix后生元替换为1 µg/mL LPS。
实施例15
与实施例13的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 0318后生元。
实施例16
与实施例13的区别为将Mix后生元替换为植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
结合实施例1-4可知：
与control组相比，即与空白组相比，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组，均没有使RAW264.7巨噬细胞的细胞活性显著下降。
与植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组相比，Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞的细胞增殖的促进作用显著优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组（p<0.05）。
与后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1以及后生元：细胞=1000:1时相比，后生元：细胞=100:1时，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞的细胞增殖的促进作用最好，作用效果是极显著的（p<0.01），且效果优于LPS组。
参考图1可知，本发明的Mix后生元对RAW264.7巨噬细胞不仅无毒，且在一定浓度下能促进RAW264.7巨噬细胞的细胞增殖。
结合实施例5-8可知，本申请通过RAW264.7巨噬细胞对中性红染色液的吞噬作用来分析RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性。
与control组相比，即与空白组相比，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组，均能促进RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力，且作用效果是极显著的（p<0.01）。
与植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组相比，Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞的吞噬性能的促进作用显著优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组（p<0.05）。
与后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1以及后生元：细胞=1000:1时相比，后生元：细胞=100:1时，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞的吞噬性能的促进作用最好，作用效果是极显著的（p<0.01），且效果优于LPS组。
参考图2可知，本发明的Mix后生元在一定浓度下能促进RAW264.7巨噬细胞的细胞吞噬性能。
结合实施例9-12可知：
与control组相比，即与空白组相比，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组，均能促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO。
与植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组相比，Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞NO分泌的促进作用优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组。
与后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1以及后生元：细胞=1000:1时相比，后生元：细胞=100:1时，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞NO分泌的促进作用最好。
参考图3可知，本发明各浓度的Mix后生元组均能促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO（p<0.01），本发明Mix后生元的免疫活性仅在一定范围内呈现剂量依赖关系，且在后生元：细胞=100:1时，对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的促进作用最强。
结合实施例13-16可知：
参考图4-图6可知，与control组相比，即与空白组相比，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组，均能促进RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α，且促进作用是显著的（p<0.05）。
参考图4-图6可知，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的促进作用均远强于对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6的促进作用。此外，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β的促进作用均强于对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6的促进作用。
参考图4-图6可知，与植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组相比，Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的促进作用优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组。
参考图4-图6可知，与后生元：细胞=1:1、后生元：细胞=10:1以及后生元：细胞=1000:1时相比，后生元：细胞=100:1时，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS1009后生元组以及Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的促进作用最好。
参考图4-图6可知，本发明的Mix后生元具有一定的免疫调节能力，且在后生元：细胞=100:1时，对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的促进作用最强。
参考图7-图9可知，与control组相比，即与空白组相比，植物乳杆菌KLDS 0318后生元组、植物乳杆菌KLDS 1009后生元组以及Mix后生元组，均能促进RAW264.7巨噬细胞的IL-6、IL-1β和TNF-α基因的相对表达量，且促进作用是极显著的（p<0.01）。
参考图7-图9可知，与植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组相比，Mix后生元组对RAW264.7巨噬细胞的IL-6、IL-1β和TNF-α基因的相对表达的促进作用优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元组和植物乳杆菌KLDS 1009后生元组。
结合实施例13-16可知，本申请的Mix后生元能够促进RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α基因的表达，因此，能够促进RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α。可见，本发明的Mix后生元具有一定的免疫调节能力，且在后生元：细胞=100:1时，能够促进RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α基因的表达，且对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的促进作用最强。
综上实施例可知：
通过体外对RAW264.7巨噬细胞增殖能力、吞噬能力进行测定的结果分析，当植物乳杆菌KLDS 0318后生元、植物乳杆菌KLDS 1009后生元或Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞比例为1:1、10:1、100:1及1000:1时，各后生元对RAW264.7巨噬细胞无毒，且在比例为10:1、100:1及1000:1时能显著促进巨噬细胞增殖（p<0.05），但是，Mix后生元的促进效果优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元、植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
当植物乳杆菌KLDS 0318后生元、植物乳杆菌KLDS 1009后生元或Mix后生元与RAW264.7巨噬细胞比例为1:1、10:1、100:1及1000:1时，各后生元均能显著促进RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力（p<0.05），且吞噬效果随剂量依赖性增加。但是，Mix后生元的促进效果优于植物乳杆菌KLDS 0318后生元、植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
RAW264.7巨噬细胞能够通过表面受体蛋白在吞噬入侵者的过程中产生一些反应性氮介质、白介素类和肿瘤坏死因子，促进血小板的产生，刺激B淋巴细胞的增殖，促进骨髓巨核细胞的分化和成熟。因此用RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-6、IL-1β和TNF-α的水平来评价各后生元的体外免疫调节活性。
当植物乳杆菌KLDS 0318后生元、植物乳杆菌KLDS 1009后生元或Mix后生元与巨噬细胞比例为1:1、10:1、100:1及1000:1时，各后生元均能通过提高RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α基因的表达，从而促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、IL-6、IL-1β和TNF-α，且对分泌IL-1β和TNF-α的促进效果优于对分泌NO和IL-6的促进效果。
综上所述，植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元以及Mix后生元均能促进RAW264.7巨噬细胞免疫活性，因此，植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009能够作为潜在的免疫调节后生元菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1. 一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌KLDS 0318或植物乳杆菌KLDS 1009；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 0318的保藏号为CCTCC NO:M20231317；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 1009的保藏号为CGMCC No.9962。
2.一种Mix后生元，其特征在于，所述Mix后生元包括灭活的权利要求1所述的植物乳杆菌KLDS 0318和灭活的权利要求1所述的植物乳杆菌KLDS 1009。
3. 根据权利要求2所述的Mix后生元，其特征在于，所述灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与所述灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
4.一种Mix后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a培养权利要求1所述的植物乳杆菌KLDS 0318和权利要求1所述的植物乳杆菌KLDS1009；
b灭活步骤a培养好的植物乳杆菌KLDS 0318和植物乳杆菌KLDS 1009，获得植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元；
c 将植物乳杆菌KLDS 0318后生元和植物乳杆菌KLDS 1009后生元混合，获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318和灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的Mix后生元。
5.根据权利要求4所述的Mix后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤a包括：
a1将植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得一代菌株；
a2 将步骤a1获得的一代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得二代菌株；
a3 将步骤a2获得的二代菌株接种于新的MRS液体培养基中，并置于恒温培养箱中恒温培养，获得活化后的植物乳杆菌KLDS 0318菌液。
6.根据权利要求4所述的Mix后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤b包括：
b1将培养好的植物乳杆菌溶液离心；
b2用无菌PBS缓冲液洗涤离心后的菌株沉淀；
b3用无菌PBS缓冲液和洗涤后的菌株沉淀制备菌悬液；
b4水浴加热菌悬液灭活植物乳杆菌，以获得包括灭活的植物乳杆菌KLDS 0318的植物乳杆菌KLDS 0318后生元或包括灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的植物乳杆菌KLDS 1009后生元。
7.根据权利要求4所述的后生元的制备方法，其特征在于，所述Mix后生元中所述灭活的植物乳杆菌KLDS 0318与所述灭活的植物乳杆菌KLDS 1009的体积比为1:1。
8.一种包含权利要求2-3任一项所述的Mix后生元或权利要求4-7任一项所述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型包括液剂、片剂、颗粒剂型、丸剂或胶囊剂。
9.一种权利要求2-3任一项所述的Mix后生元或权利要求4-7任一项所述的Mix后生元的制备方法制备而成的Mix后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、药品、食品或饮料中的应用。
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