CN116445356B - 一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种ba67及其应用 - Google Patents
一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种ba67及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67，命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.Lactis BA67菌株，保藏编号为CGMCC No.24112，保藏日期为2021年12月15日。该菌株具有良好的耐酸能力、细胞粘附能力、胃肠液耐受能力，可以调节肠道菌群、增强免疫力，并且显著改善机体免疫低下问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67及其应用。
背景技术
免疫是指机体在对“抗原性异物”或“异己成分”的识别和应答过程中所产生的生物学效应总和。正常情况下是维持内环境稳定的一种特异性生理反应，免疫力更是机体自身的一种防御机制。年龄、体质和生活习惯是影响抵抗力的三个因素。此外，季节变化、营养不均衡、生活作息不规律、过度劳累及压力等，都会影响人的免疫系统功能。
人体的免疫系统约70%存在于肠道，且机体大量的免疫细胞如T细胞、B细胞、NK细胞等均集中在肠道粘膜，肠道是免疫的第一道防御系统。肠道作为营养物质消化吸收、微生物定殖和免疫细胞聚集的场所，促进了三者之间的互作。正常肠道菌群在促进免疫系统发育，维持正常免疫功能，协同拮抗病原菌入侵方面，发挥着重要作用。因此，当肠道菌群紊乱时，人体的抵抗力变差则容易受到病菌的攻击，增加感染流感、感冒、肠胃炎等疾病的患病率。
益生菌能够通过占位效应、营养竞争、分泌抑菌或杀菌物质、产生有机酸，刺激分泌型免疫球蛋白分泌等阻止致病菌及毒素黏附，抑制或抵抗致病菌和其他微生物生长，从而改善菌群失调。通过构成生物屏障，防止肠道有害细菌和内毒素移位。益生菌还能合成人体所需的130多种维生素。
因此，为应对我国老龄化社会、环境问题、生活压力等导致的疾病，提供一种可以调节肠道菌群、增强免疫力的产品，既不会增加人体的耐药性，同时，也不会对人体产生不良反应，提高增强免疫力临床治疗的效果，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67及其应用，所述动物双歧杆菌具有良好的耐酸能力、细胞粘附能力、胃肠液耐受能力，可以调节肠道菌群及增强免疫力，在制备调节肠道菌群及增强免疫力产品方面具有巨大的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67，所述调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67菌株，保藏编号为CGMCC No.24112，保藏日期为2021年12月15日。
本发明从健康婴幼儿粪便样本中分离获得并保藏了一株新的能够调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BA67菌株，该菌株具有良好的耐酸能力、细胞粘附能力、胃肠液耐受能力，可以调节肠道菌群、增强免疫力，并且显著改善因年龄、环境和生活习惯等导致的机体免疫低下问题，为强化个人健康、提高全民健康素养创造了条件。使用所述的调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67制成制剂，不会产生耐药性，治疗过程中也不会引起患者的不良反应，并且可以避免使用抗生素对环境造成污染，应用前景广阔。
第二方面，本发明提供根据第一方面所述的调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67的培养方法，所述培养方法包括将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67菌株接种于MRS培养基上进行培养，所述培养的温度为30-37℃，所述培养的时间为18-24 h。
培养温度例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，培养时间例如可以是18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h或24 h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂中的菌株包括第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67菌株。
本发明所涉及的动物双歧杆菌乳亚种BA67菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。
优选地，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂中的菌株还包括干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。
本发明还创造性地发现上述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp. lactis BA67菌株能够与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株进行复配使用用于调节肠道菌群及增强免疫力，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明BA67菌株和LC89菌株在增强免疫力上具有协同增效作用。
优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. LactisBA67菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的质量比为(1-3):(1-3)，例如1:3、1:2、1:1、2:1、3:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
优选地，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂还包括保护剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉。
优选地，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂还包括益生元，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、抗性糊精、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述菌剂可以被制成为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂等剂型。
第四方面，本发明根据第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. Lactis BA67菌株或第三方面所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂在制备调节肠道菌群及增强免疫力的产品中的应用，所述产品包括食品、保健品或药物。
优选地，所述食品包括豆制品、乳制品或果蔬制品中的任意一种。
优选地，在所述调节肠道菌群及增强免疫力的产品中，菌株的总活菌数不低于1×108 CFU/mL或1×108 CFU/g。例如可以是1×108 CFU/mL、2×108 CFU/mL、3×108 CFU/mL、4×108 CFU/mL、5×108 CFU/mL、6×108 CFU/mL、7×108 CFU/mL、8×108 CFU/mL或9×108CFU/mL，或1×108 CFU/g、2×108 CFU/g、3×108 CFU/g、4×108 CFU/g、5×108 CFU/g、6×108 CFU/g、7×108 CFU/g、8×108 CFU/g或9×108 CFU/g等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过耐酸实验、细胞黏附实验及胃肠液耐受能力（人工模拟），成功筛选到一株调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67，所述动物双歧杆菌乳亚种BA67具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3 h，存活率可达73.5%以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3 h，存活率可达91.2%以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达94.1%以上。良好的耐酸能力说明其能经受胃液的消化，达到肠道，为制备调节肠道菌群、增强免疫力制剂产品创造了条件；
所述调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67能够可以促进免疫低下小鼠的生长，有效缓解脏器的萎缩和损伤；改善免疫低下小鼠的肠渗漏现象，缓解肠道功能障碍；能促进小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6的表达水平，增强小鼠肠道粘膜免疫作用；此外，还能增加小鼠肠道内的微生物群落的α多样性以及双歧杆菌属、乳杆菌属和阿克曼菌属的相对丰度；所述调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67的产品可以提高人体免疫力，减少感冒患病次数及感冒持续时间。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料及方法：
动物双歧杆菌乳亚种BA67来自微康益生菌（苏州）股份有限公司菌种库，该菌株命名为动物双歧杆菌乳亚种 Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67，于2021年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 24112；
干酪乳杆菌LC89来自微康益生菌（苏州）股份有限公司菌种库，该菌株命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89，于2018年3月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 15409；
两歧双歧杆菌乳亚种BBi32来自微康益生菌（苏州）股份有限公司菌种库，该菌株命名为两歧双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium bifidum BBi32菌株，于2018年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 16923；
动物双歧杆菌乳亚种BLa80来自微康益生菌（苏州）股份有限公司菌种库，该菌株命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa80，于2018年3月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 15410。
Caco-2细胞（人克隆结肠腺癌细胞），购于北京北纳创联生物技术研究院；
MRS固体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2 g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g、琼脂20 g和半胱氨酸氨酸盐0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用；
MRS液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2 g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g和半胱氨酸氨酸盐0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后备用。
实施例1
本实施例提供一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67，其分离筛选方法如下：
选取健康婴幼儿粪便样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基（培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物）上，在37℃培养48 h后，挑取出不同形态的3株菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。
对分离得到的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株耐酸能力、Caco-2细胞粘附能力、胃肠液耐受能力（人工模拟）最好的单菌株。
具体实验方式：
（1）耐酸性实验
将纯化的菌株接种于pH3.0的MRS培养基中，37℃厌氧静置培养72h，以∆A600 (菌株在0h和72h时600nm处吸光度之差)为指标，筛选耐酸菌株。
（2）菌液制备
将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h，得到菌液；将菌液在8000×g下离心10 min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到上清液；使用PBS重悬菌体，得到菌悬液。
（3）人工胃液耐受性实验
人工胃液的配制：将胃蛋白酶溶解于无菌过滤的0.5%（w/v）NaCl溶液中，最终浓度为3g/L，用HCl溶液调节pH至2.0。
将0.2mL的菌悬液与0.3 mL NaCl (0.5% w/v) 和1.0 mL人工胃液（pH 2.0）混合。混合均匀后，于37℃下培养。考察胃液耐受性时，在0h和3h后取出0.1mL样品，用于测定总活菌数。
（4）人工肠液耐受性实验
人工肠液的配置：将胰蛋白酶溶解于无菌过滤的0.5%（w/v）NaCl溶液中，最终浓度为1g/L，含0.3%胆盐，并用无菌0.1mol/L NaOH调节pH至8.0。
将0.2mL的菌悬液与0.3 mL NaCl （0.5% w/v）和1.0 mL人工肠液（pH 8.0）混合。混合均匀后，于37℃下培养。考察肠液耐受性时，在0h和3h后分别取出0.1 mL样品，测定总活菌数。
（5）Caco-2细胞粘附能力实验
Caco-2细胞使用DMEM（含2mL的L-谷氨酰胺）和10%的胎牛血清为基础培养基，接种至24孔细胞培养板中，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。当细胞聚合度达到90%～100%时，吸走培养液，并用PBS（pH 7.4）洗两次，以除去过量的未黏附于板底的Caco-2细胞。
将1mL的菌悬液加入到Caco-2细胞中，在37℃、5%CO2培养箱中培养2小时。用移液枪头的尖端轻刮黏附的细胞，制成为细胞悬浮液。用DMEM溶液倍数稀释细胞悬液，并涂布于MRS琼脂平板上，在37℃、5%CO2培养箱内培养48h，计数。
实施例2
本实施例对实施例1中筛选到的动物双歧杆菌乳亚种BA67进行形态鉴定以及16SrRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
（1）形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48 h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落为乳白色，呈半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
（2）16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20 mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养18 h后进行离心分离，8000 rpm下离心10 min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。
该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No: 1所示。
SEQ ID No: 1：
CTACCATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCTAAGGTA。
将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株确实为动物双歧杆菌乳亚种。
实施例3
本实施例对动物双歧杆菌乳亚种BA67的培养条件进行优化，步骤如下：
将动物双歧杆菌乳亚种BA67接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48 h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。测试结果如表1所示。
表1
结果显示，动物双歧杆菌乳亚种BA67在30-37℃下生长最佳，培养18-24 h即可达到生长稳定期。
实施例4
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA67的耐胃酸能力，步骤如下：
（1）制备人工胃液：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用；
（2）耐胃酸能力测试：
取1.0mL动物双歧杆菌乳亚种BA67菌悬液（浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度），分别与9.0 mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0h）和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(%)=N1/N0×100%，
其中，N1：人工胃液处理3 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。
测试结果如表2所示。
表2
由表2可以看出，本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种BA67具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3 h，存活率可达73.5%以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达91.2%以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达94.1%以上。良好的耐酸能力说明其能经受胃液的消化，达到肠道，为制备调节肠道菌群及增强免疫力制剂产品创造了条件。
实施例5
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BA67对免疫功能低下小鼠的免疫调节效果，步骤如下：
选用ICR小鼠56只（体重：22g±3g），随机分组，空白对照组（CTL组）、模型组（MC组）、益生菌BA67干预组（BA67组）、益生菌LC89干预组（LC89组）、益生菌BA67和LC89联合干预组（BA67+LC89组）、益生菌BA67和BBi32联合干预组（BA67+BBi32组）、益生菌BLa80和LC89联合干预组（BLa80+LC89组），每组8只。
给予适应性饲养一周后，CTL组给予生理盐水；MC组采用环磷酰胺80mg／kg bw剂量连续注射3d（第7，8，9天），造成相应免疫低下，不再强化；BA67组给予环磷酰胺80mg／kg bw剂量连续注射3d（第7，8，9天）+益生菌BA67菌悬液109CFU／mL每天灌胃1次，一次0.2mL；LC89组给予环磷酰胺80mg／kg bw剂量连续注射3d（第7，8，9天）+益生菌LC89菌悬液109CFU／mL每天灌胃1次，一次0.2mL；BA67+LC89组给予环磷酰胺80mg／kg bw剂量连续注射3d（第7，8，9天）+益生菌LC89菌悬液109CFU／mL每天灌胃1次+益生菌BA67菌悬液109CFU／mL每天灌胃1次，一次各0.1mL；其他联合组依次类推（菌比均为1:1）。同时CTL组和MC组灌胃等体积的生理盐水，连续2周。
（1）BA67对免疫功能低下小鼠体重和脏器指数的影响：
胸腺和脾脏指数的测定：摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重（mg），分别除以小鼠体重(g)，再乘以10，得到胸腺指数和脾脏指数：胸腺指数=胸腺重量/（小鼠体重×10）、脾脏指数=脾脏重量/（小鼠体重×10），结果如下表3：
表3
根据表中结果，各组初始体重均无显著差异，益生菌BA67组的最终体重及脏器指数显著高于模型组，说明益生菌BA67可以促进免疫低下小鼠的生长，有效缓解脏器的萎缩和损伤。且BA67菌株能够与LC89菌株进行复配使用具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明BA67菌株和LC89菌株在促进免疫低下小鼠的生长，有效缓解脏器的萎缩和损伤上具有协同增效作用。
（2）BA67对免疫功能低下小鼠肠道通透性的影响：
D-乳酸与肠道屏障损伤间关系密切，血浆中D-乳酸含量的升高可作为免疫力低下小鼠早期肠屏障功能损伤，肠道通透性增加的预警指标。采用分光光度法测定血浆中D-乳酸活性，结果如下表4所示：
表4
根据表4中结果，我们发现益生菌BA67组的干预对环磷酰胺导致的免疫低下小鼠血浆中的D-乳酸含量有显著影响，改善小鼠的肠渗漏现象，缓解肠道功能障碍。且BA67菌株能够与LC89菌株进行复配使用具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果。
（3）BA67对免疫功能低下小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6表达水平的影响：
对上述各组给药2周后的小鼠进行采血，离心得到上层血清，利用酶联免疫吸附实验对血清中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、含量进行检测，结果见表5。
表5
根据表5的结果，我们发现，与模型组相比，益生菌BA67干预组促进了小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6的表达水平，即增强了小鼠肠道粘膜免疫作用。且BA67菌株能够与LC89菌株进行复配使用具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果。
（4）动物双歧杆菌乳亚种BA67调节肠道菌群影响：
对给药2周后的小鼠肠道菌群分析：
收取大鼠粪便。使用QIAamp粪便DNA提取试剂盒(Qiagen)，从200 mg粪便中提取总DNA。采用341F(SEQ ID No: 2：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(SEQ ID No: 3：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)引物PCR扩增16S rRNA V3-V4区。最终的16S rRNA基因扩增子文库在MiSeq平台(Illumina)上使用2 × 300 bp配对末端方案进行测序。使用Usearch11合并获得的配对末端读数并保留长度≥400 pb的读数进行以下分析。将所有质量过滤序列映射到无嵌合体的ASV，并使用具有默认设置的USEARCH11创建ASV丰度表。以RDP训练集（v18版）的16S rRNA数据库为参考数据库。基于ASVs丰度表，用Usearch计算Chao1和Shannon多样性的指数（α多样性）通过单因素方差分析(ANOVA)确定干预效应，并通过Tukey检验显著性差异检验事后分析各组间差异。动物双歧杆菌乳亚种BA67干预对α多样性和差异菌群的检测结果分别如表6所示。
表6
由表6可知，与正常组相比，MC组微生物群落的α多样性显著下降，包括微生物丰富度下降（以Chao1指数表示），以及微生物多样性下降（以Shannon指数表示）。由BA67组与MC组对比可知，动物双歧杆菌乳亚种BA67增加了微生物群落的α多样性。与MC组相比，动物双歧杆菌乳亚种BA67显著增加Bifidobacterim（双歧杆菌属）、Lactobacillus（乳杆菌属）和Akkermansia（阿克曼菌属）的相对丰度。
实施例6
本实施例提供一种调节肠道菌群及增强免疫力的冻干菌剂，其制备方法如下：
将动物双歧杆菌乳亚种BA67接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，得到动物双歧杆菌乳亚种BA67菌体；将菌体用质量浓度为10%的脱脂奶粉重悬至浓度为1×1010 CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1 h后冻干，得到所述调节肠道菌群及增强免疫力的冻干菌剂。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种BA67及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (7)
1.一种调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，其特征在于，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂中的菌株由动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. LactisBA67菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株组成；
所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67菌株的保藏编号为CGMCC No.24112，保藏日期为2021年12月15日；
所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。
2.根据权利要求1所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BA67菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的质量比为(1-3):(1-3)。
3.根据权利要求1所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，其特征在于，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂还包括保护剂。
4.根据权利要求3所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂奶粉。
5.根据权利要求1所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂，其特征在于，所述调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂还包括益生元，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、抗性糊精、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的调节肠道菌群及增强免疫力的菌剂在制备调节肠道菌群及增强免疫力的产品中的应用，所述产品包括食品、保健品或药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述调节肠道菌群及增强免疫力的产品中，菌株的总活菌数不低于1×108 CFU/mL或1×108 CFU/g。
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