CN114107088A - 一种罗伊氏乳杆菌lrsy523及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌LRSY523及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LRSY523分离自小鼠盲肠，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22953。保藏日期：2021年07月26日。菌株的16S rDNA序列提交至Genbank数据库，序列登录号为：MW530426.2。研究结果证明，罗伊氏乳杆菌LRSY523对人结肠癌细胞Caco‑2和HT‑29黏附能力强，并且可以有效保护肠道屏障功能、改善高脂饮食小鼠的肥胖和胰岛素抵抗效应。因此，本发明所述的罗伊氏乳杆菌可在制备改善肠道健康、缓解肥胖的微生物制剂和/或功能性食品中应用。

Description

一种罗伊氏乳杆菌LRSY523及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种高黏附性能的罗伊氏乳杆菌LRSY523及其应用。

背景技术

近年来，随着我国经济水平的不断发展，居民饮食结构中高脂饮食比重日益增加，肠道问题及肥胖人群占比逐年增加。研究发现，高脂饮食的摄入会导致肠道菌群失调和肠道屏障功能紊乱，引发肠屏障受损及代谢异常，进而引发肥胖。所以，肠道健康问题与肥胖之间的联系愈发紧密。目前以益生菌为代表的新型膳食添加剂被证明其能在肠道中通过影响肠道菌群和肠道屏障发挥益生作用。上述新型膳食添加剂的可行性促使继续寻找应用更广泛、潜力更巨大，同时又具有改善肠道健康、缓解肥胖的益生菌膳食添加剂。

罗伊氏乳杆菌是一种在哺乳动物肠道内常见的乳杆菌，由于罗伊氏乳杆菌的益生能力和对胃肠道环境较好的耐受能力，2003年，其被卫生部批准可作为保健食品益生菌种并纳入《可用于保健食品的益生菌菌种名单》。研究显示：罗伊氏乳杆菌具有调节肠道菌群、增强免疫力、保护肠道黏膜、改善肠道功能、促进消化、抗肿瘤及抗氧化等功效，而乳杆菌在肠道的黏附定植是其发挥益生功能的前提因素。因此，挖掘高黏附能力的益生菌株对于开发新型的益生菌制剂和/或绿色安全的功能性食品尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高黏附性能的罗伊氏乳杆菌及其在改善肠道健康、缓解肥胖中的应用。

本发明提供的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，所述菌株分离于口服谷糠蛋白提取物的小鼠盲肠内容物，提取该菌株的16S rDNA，测序比对分析结果为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌LRSY523。其16S rDNA序列提交至Genbank数据库，序列登录号为：MW530426.2，GI:2035167899。该罗伊氏乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22953，保藏日期：2021年07月26日。

所述罗伊氏乳杆菌LRSY523菌株在MRS固体培养基上的菌落形态突起，边缘光滑、形状不规则、乳白色、不透明至半透明、直径为1-3mm。

本发明提供的一种罗伊氏乳杆菌菌剂的制备方法，将权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LRSY523菌株在MRS培养基中，于37℃条件下驯化和扩大培养，培养至活菌数高于1×10⁹CFU/mL，菌液分装后置于4℃待用。

通过体外菌胞共培养实验表明，罗伊氏乳杆菌LRSY523可以高效黏附于人结肠癌细胞Caco-2和HT-29上，显示罗伊氏乳杆菌LRSY523能够定植在肠道上皮细胞发挥益生作用。

经高脂饮食诱导构建小鼠肥胖和肠道屏障渗漏模型，培养罗伊氏乳杆菌LRSY523，使之菌液中活菌数达到为10⁹-10¹⁰CFU/mL，每日灌胃给予小鼠，实验结果表明：罗伊氏乳杆菌LRSY523能够显著增加高脂饮食小鼠肠道紧密连接蛋白的表达改善肠道屏障功能；并缓解其胰岛素抵抗及肥胖效应。该罗伊氏乳杆菌LRSY523有潜力开发为改善肠道健康、缓解肥胖的功能性食品和/或益生菌制剂。

附图说明

图1罗伊氏乳杆菌LRSY523菌落形态照片和菌株16S rDNA核酸电泳扫描图；

图2罗伊氏乳杆菌LRSY523革兰氏染色显微照片图；

图3LRSY523处理后高脂饮食小鼠体重变化曲线图

图4LRSY523处理后高脂饮食小鼠胰岛素抵抗指数统计柱状图；

图5FITC-葡聚糖检测LRSY523处理后小鼠肠道通透性的统计柱状图；

图6LRSY523处理后小鼠血清炎症因子水平的统计柱状图；

图7qPCR检测LRSY523处理后肠道紧密连接蛋白表达的统计柱状图；

图8罗伊氏乳杆菌LRSY523在Caco-2和HT-29细胞黏附水平的统计柱状图；

图1～8中，“*”、“**”表示显著性差异，误差以Mean±SEM形式展现。

具体实施方式

实施例1：罗伊氏乳杆菌LRSY523的分离、鉴定以及制备

1、材料准备

在厌氧条件下，取新鲜小鼠盲肠，分离内容物；

通用引物27F/1492R序列如下：

Forward AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Reverse GGTTACCTTGTTACGACTT

MRS肉汤培养基(加1.5％琼脂为固体培养基)

2、乳杆菌的分离筛选

(1)稀释涂布

称取100mg小鼠粪便，在厌氧箱中于1mL PBS中悬浮，震荡30min，使样品充分分散，纱布过滤去除残渣，10^-4-10^-6梯度涂布于MRS固体培养基上，37℃培养48h(如图1所示)；

(2)取步骤(1)中的平板，观察挑取单菌落，在MRS固体培养基上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h，重新得到单菌落；

(3)取步骤(2)中划线平板上单菌落接种至MRS液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm培养14h，得到菌液。

3、乳杆菌的分子生物学鉴定

取步骤(3)中1mL菌液用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清后无菌水重悬，再次弃上清6000g离心3min，重复3次，弃去上清得菌体。菌体使用QIAamp DNA Stool MiniKit(Qiagen)试剂盒提取细菌基因组DNA，并使用通用引物27F/1492R对16S rDNA进行PCR扩增。PCR条件：第一步：94℃，5min第二步：94℃，30s；第三步：55℃，30s；第四步：72℃，2min，第五步：72℃，10min，第二到四步进行30个循环。PCR产物经核酸电泳分析确认后，送华大基因测序(如图1所示)；将测序返回的27F和1492R序列拼接后上传到NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行种属确认；比对结果发现菌株为罗伊氏乳杆菌株，命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri strain SY523(LRSY523)。

4、革兰氏染色

挑取菌液，涂片，进行革兰氏染色，对菌株的染色情况和形态进行观察(如图2所示)。

5、菌株活化和保藏

将该罗伊氏乳杆菌在MRS液体培养基中活化，使用斜面保藏法在4℃进行保存，冷链运输至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22953。

6.菌液的制备

将罗伊氏乳杆菌LRSY523菌株接种至MRS液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm培养14h，得到初步菌液。通过1100rpm/min离心，调整初步菌液中乳杆菌密度为1×10⁹CFU/mL，分装后4℃保存。

实施例2：检测罗伊氏乳杆菌LRSY523在Caco-2和HT-29细胞黏附水平

采用活菌计数法检测罗伊氏乳杆菌LRSY523对Caco-2和HT-29细胞的黏附能力。

1、在24孔板中每孔1×10⁵加入Caco-2或HT-29细胞培养；

2、待细胞生长至融合，在厌氧条件下与乳杆菌共培养4h(MOI＝100感染复数：每个细胞感染细菌的单位数)；

3、共培养后，去除培养基，用PBS缓慢洗涤细胞两次；

4、加入200μL的无菌水，溶解细胞10min，再加入800μL MRS培养基使细胞均质化；

5、将上述悬液梯度稀释(10^-1-10^-8)，在乳杆菌MRS平板上均匀涂布；

6、在厌氧条件下培养，黏附在细胞表面的乳杆菌在平板上形成单克隆，统计菌落数，计算黏附的乳杆菌活菌数，除以加入总乳杆菌活菌数，得到黏附率，以此衡量乳杆菌在细胞表面的黏附程度。

结果表明：罗伊氏乳杆菌LRSY523在Caco-2和HT-29细胞上都有较强的黏附能力(如图3所示)。

实施例3：罗伊氏乳杆菌LRSY523预防高脂饮食小鼠肥胖和胰岛素抵抗

1、动物来源：雄性SPF级C57BL/6小鼠，5周龄；

2、饲养条件和饲料：温度为23±2℃，相对湿度为50-55％，室内灯光模拟昼夜，12小时明暗循环。除正常对照组外均为高脂饲料喂养，正常对照组为普通维持饲料喂养，持续喂养8周。LRSY523治疗组采用灌胃方法，给小鼠每日灌胃的菌液中LRSY523活菌数为1×10⁹CFU/mL，每只小鼠灌胃200μL，对照和模型组灌胃同等体积MRS培养基，直到实验结束。

3、实验动物分组(见表1)：

表1实验分组

4、实验进行每周对小鼠进行称重并记录，绘制折线图，发现LRSY523治疗后，高脂饮食小鼠体重显著下降(如图4所示)。血糖检测前24h断饲料并停止给药，只供应水，然后尾静脉取血。使用One-Touch血糖仪检测血糖；将血液置于无菌干燥管，室温静置半小时，打开离心机，3500rpm室温离心10分钟，收集上层微黄色液体得到血清，利用ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)检测小鼠血清胰岛素；胰岛素抵抗指数用空腹血糖和空腹胰岛素的积比22.5计算，发现LRSY523治疗后，高脂饮食小鼠胰岛素抵抗指数明显降低(如图5所示)。

实施例4：罗伊氏乳杆菌LRSY523缓解高脂饮食引起的小鼠肠道屏障渗漏

在体内评估肠道屏障通透性水平利用口服荧光素FITC-dextran(MW:4000Da)来测定。实验取血：口服FITC后4h，麻醉并固定小鼠，用镊子快速摘取眼球，并使血液从眼眶内流入无菌EP管中，于室温(37℃)静置半小时以上，打开离心机，3500rpm室温离心10min，收集上层微黄色液体即为血清；使用多功能酶标仪检测肠道通透性，选择激发波长为493nm，吸收波长为518nm，检测血清荧光强度；血清炎症因子检测使用ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)检测各组小鼠血清中炎症因子TNFα和IL-1β的水平。

结果表明：与对照组相比，高脂饮食小鼠肠道通透性显著增加，血清中炎症因子TNFα和IL-1β表达的水平明显上升，即肠道屏障被破坏且血液循环有炎症发生。LRSY523治疗后，高脂饮食小鼠肠道通透性显著恢复，血清中炎症因子表达的水平明显降低(如图6和7所示)。

实施例5：qPCR检测罗伊氏乳杆菌LRSY523治疗后肠道紧密连接蛋白表达

小鼠肠组织总RNA的提取：麻醉处死小鼠后，切取适量结肠组织10mm左右，将切好的组织用PBS清洗三遍，浸泡入1mL的Trizol中，匀浆后分装于进口EP管中(不立即提RNA的保存于-80℃)；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置5min，于4℃ 13,000rpm下离心15min，至分层(无色水相、酚-氯仿相、浅红色相)吸取上清存放在灭菌的EP管中；加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀，在室温环境下，静置10min；于4℃ 13,000rpm下离心10min，见白色沉淀；小心倒掉上清，沿管壁缓慢加入1mL 75％的乙醇(可轻轻上下颠倒)；于4℃13,000rpm下离心15min，丢弃上清，并用枪头吸干净；吹干沉淀，直至变为透明；加入适量DEPC水，溶解沉淀，在57℃金属浴助溶10min；

RNA浓度检测：使用Nanodrop 2000测定RNA浓度。

RNA模板反转录：将上述方法提取的总RNA，用HiScriptⅡReverse Transcriptase反转录试剂盒，进行反转录，反应条件为:37℃ 15min,85℃ 5s，反应结束后，cDNA存放于-20℃长期保存。

实时定量PCR：设计并合成小鼠源的紧密连接蛋白的引物，使用ChamQ SYBR qPCRMaster Mix试剂盒进行实时定量PCR。

结果表明：与对照组相比，高脂饮食小鼠紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin以及ZO-1表达均显著降低，罗伊氏乳杆菌LRSY523治疗可以明显增加高脂饮食小鼠肠道中紧密连接蛋白的表达水平(如图8所示)。

Claims (5)

1.一种罗伊氏乳杆菌LRSY523，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.22953。

2.一种罗伊氏乳杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LRSY523菌株在MRS培养基中，于37℃条件下驯化和扩大培养，培养至活菌数大于1×10⁹CFU/mL，菌液分装后置于4℃待用。

3.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LRSY523在制备改善肠道健康、缓解肥胖的功能性食品中的应用。

4.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌LRSY523在制备改善肠道健康、缓解肥胖的微生物制剂中的应用。

5.如权利要求2所述方法制备的罗伊氏乳杆菌菌剂在制备改善肠道健康、缓解肥胖的功能性食品中的应用。

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