CN114344344A - 罗伊氏乳杆菌在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能中的应用及含有罗伊氏乳杆菌的复合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了罗伊氏乳杆菌在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能中的应用及含有罗伊氏乳杆菌的复合物，属于微生物领域。为了提供一种具有缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能的罗伊氏乳杆与是乳酸菌胞外多糖复合强化功效的组合。本发明的步骤为：制备含有10⁸‑10¹⁰cfu/mL罗伊氏乳杆菌J1的产品，对小鼠进行灌胃，可降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体脂率、甘油三酯以及肝脏脂肪，制备乳酸菌胞外多糖，将罗伊氏乳杆菌J1与胞外多糖复合起到强效的作用。

Description

罗伊氏乳杆菌在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能中的应用及 含有罗伊氏乳杆菌的复合物

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能中的应用及含有罗伊氏乳杆菌的复合物。

背景技术

肥胖已经成为21世纪全球健康关注的焦点，随着人们生活水平的提高、高脂高糖食物的饮食结构、久坐不动的生活方式，导致全球肥胖的发病率呈逐年上升趋势。在世界成年人口中，肥胖症的患病率约为13％。肥胖的主要特征是由能量摄入和消耗不平衡导致的脂肪过度堆积，往往与高血糖，甘油三酯水平升高，高甘油三酯血症，低密度脂蛋白(血脂异常)和高血压等多种慢性并发症有关。

胖与其并发症与肠道菌群有关，而益生菌可以影响人体代谢功能。长期高脂饮食能引起机体脂代谢紊乱，非酒精性脂肪肝，低度炎症，氧化应激，肠道微生态紊乱等现象，益生菌或许是通过改善这些途径来抑制肥胖的。乳杆菌作为食品安全微生物，其改善人体代谢越来越受到关注，而罗伊氏乳杆菌菌粉在机体内缓解肥胖的具体作用还有待研究。

发明内容

本发明的目的是为了提供罗伊氏乳杆菌在治疗高脂饮食诱导小鼠肥胖中的应用。

本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌J1在制备治疗高脂饮食诱导小鼠肥胖药物中的应用。

进一步地限定，所述药物含有药学上可接受的辅料。

进一步地限定，所述治疗高脂饮食诱导小鼠肥胖为降低体脂率高、降低肝脏指数、降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白含量。

本发明提供了一种伊氏乳杆J1在制备在制备治疗糖尿病药物中的应用。

进一步地限定，所述治疗糖尿病为提高高脂饮食诱导的肥胖小鼠的口服葡萄糖耐量和降低胰岛素抵抗指数。

本发明提供了一种含有罗伊氏乳杆菌J1的组合物，所述所述组合物为微生物制剂，所述微生物制剂含有罗伊氏乳杆菌J1的湿细胞或者冻干细胞。

进一步地限定，所述组合物由罗伊氏乳杆菌和胞外多糖组成。

进一步地限定，所述胞外多糖的制备方法如下：37℃培养条件下，副干酪乳杆菌JY062菌株在MRS肉汤培养基中培养24h，在容量为1.0L的三角瓶子中进行分批发酵，接种物的初始密度为1.5×109CFU/mL，接种物浓度为5.0％，胞外多糖按照水提醇沉法进行提取，采用三氯乙酸去除蛋白的方法进行纯化，将去除蛋白的胞外多糖重悬于去离子水中，透析72h，分子截流量为：12000-14000da，然后将上清液冻干，获得胞外多糖。

进一步地限定，所述胞外多糖的浓度为0.5mg/mL。

进一步地限定，所述组合物为功能性食品或保健品。

进一步地限定，所述组合物为发酵食品，所述发酵食品为罗伊氏乳杆菌J1发酵获得的，包括固态食品、液态食品和半固态食品。

进一步地限定，所述罗伊氏乳杆菌J1的含量为10⁸-10¹⁰cfu/mL。

有益效果：本发明提供了一中安全有效的罗伊氏乳杆菌J1菌粉在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖的应用，可降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体脂率、甘油三酯以及肝脏脂肪等。

附图说明

图1为罗伊氏乳杆菌菌粉对体重增量的影响。

图2为罗伊氏乳杆菌菌粉对体脂率的影响。

图3为罗伊氏乳杆菌菌粉对血脂水平的影响，其中，A是TC含量，B是TG含量，C是LDL-C含量，D是HDL-C含量；横坐标是组别，纵坐标是含量。

图4为罗伊氏乳杆菌菌粉对口服葡萄糖耐量和胰岛素抵抗指数的影响；其中，A是OGTT含量，B是HOMA-IR含量；横坐标是组别，纵坐标是含量。

图5为罗伊氏乳杆菌菌粉对血清中炎症因子的影响，其中，A是IL-6含量，B是TNF-α含量，C是IL-10含量；横坐标是组别，纵坐标是含量。

图6为罗伊氏乳杆菌菌粉对肝脏中脂肪因子的影响，其中，A是PPARγmRNA表达水平，B是FANS mRNA表达水平，C是FAT mRNA表达水平，D是SCD-1mRNA表达水平；横坐标是组别，纵坐标是表达水平。

图7为罗伊氏乳杆菌菌粉和混合物对胆固醇的脱除率。

具体实施例

罗伊氏乳杆菌J1记载在张紫薇.罗伊氏乳杆菌J1益生特性初步评价及基因组学研究[D].东北农业大学中。

副干酪乳杆菌TD062记载在[1]Zhang Y,Dai X,H Jin,et al.The effect ofoptimized carbon source on the synthesis and composition ofexopolysaccharides produced by Lactobacillus paracasei-ScienceDirect[J].Journal of Dairy Science,2021,104(4):4023-4032.

实施例1.

一种罗伊氏乳杆菌J1菌菌粉的制备：

(1)菌种活化：试验菌株以5％的接种量接种于MRS液体培养基，37℃厌氧条件下培养18h后，取菌液在MRS琼脂培养基采用三区划线的形式划线并37℃厌氧培养48h后，挑取单个菌落至MRS液体培养基继续培养18h。将最终活化的菌液与80％(v/v)无菌甘油以3:1的比例混合均匀，-80℃保藏备用。

(2)制备生物制剂：10⁸-10¹⁰cfu/mL。

实施例2.

制备含有罗伊氏乳杆菌J1菌菌粉的复合物：

1.乳酸菌胞外多糖的制备

37℃培养条件下，副干酪乳杆菌TD062菌株在MRS肉汤培养基中培养24h，在容量为1.0L的三角瓶子中进行分批发酵，接种物的初始密度约为1.5×10⁹CFU/mL，接种物浓度为5.0％，胞外多糖按照水提醇沉法进行提取，采用三氯乙酸去除蛋白的方法进行纯化，将去除蛋白的胞外多糖重悬于去离子水中，透析72h(分子截流量为：12000-14000da)。将上清液冻干，获得胞外多糖样品。

2.胞外多糖和罗伊氏乳杆菌J1混合，胞外多糖的浓度为0.5mg/mL，罗伊氏乳杆菌J110¹⁰cfu/mL。

利用以下实验验证实验效果：

一、材料与方法

1、实验材料

选用60只雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄为7周左右，体重为20±2g，鼠房的温度为22±2℃，湿度为55±5％，12h昼夜交替，小鼠自由采食饮水和饲料。基础饲料购自沈阳茂华生物科技有限公司，高脂饲料购自北京科奥协力饲料有限公司，配方：8％正常饮食，20％猪油，10％大豆油，10％蔗糖，10％麦芽糖糊精，10％蛋黄粉，1.8％胆固醇，0.2％胆盐。

2、动物分组

将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分成5组(n＝8只/组)：正常组(ND)、高脂组(HFD)、低剂量组(HFD+10⁸L.reuteri J1)、中剂量组(HFD+10⁹L.reuteri J1)、高剂量组(HFD+10¹⁰L.reuteri J1)。小鼠购买后，采用基础饲料饲养适应环境一周，自由饮水。从第二周开始，正常组喂养基础饲料，其余组喂养高脂饲料。正常组及高脂组小鼠灌胃0.2mL无菌PBS溶液，其余组分别灌胃0.2mL浓度为10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL、10¹⁰CFU/mL的菌粉灌胃液，连续灌胃6周。每周监测小鼠的体重。

3、样本制备

第11周末小鼠禁食12h后，采用摘除眼球法取小鼠全血，室温放置2～4h，然后离心取血清，并分装于200μL离心管中，-20℃保存备用。小鼠经乙醚麻醉，断颈处死，随后对小鼠进行体表消毒后解剖小鼠，迅速取出肝脏，附睾脂肪，腹腔内脂肪并称重，称重后，在液氮中迅速冷冻，转移到-80℃冰箱长期保存。

4、体脂率的测定

体脂率(％)＝(脂肪重量/小鼠体重)×100

5、肝脏指数的测定

肝脏指数＝(肝脏重量/小鼠体重)×100

6、血脂的测定

采取眼球取血的方式获取全血，室温静置2h，4℃3000r/min离心10min，吸取上层血清，检测每组小鼠血清TC、TG、HDL-C浓度，具体操作严格按照南京建成试剂盒要求。

7、口服糖耐量、胰岛素抵抗指数测定

小鼠空腹12h后，对小鼠尾椎进行取血测量其空腹血糖(FBG)。

8周末隔夜禁食12h，给予40％的葡萄糖溶液，按照5ml/kg体积灌胃，灌胃标准为葡萄糖2g/kg。分别于空腹及糖负荷15min，30min，60min，90min，120min测定血糖值。

按照上海鑫乐胰岛素酶联免疫分析试剂盒，检测小鼠血清中胰岛素(FIN)的含量。

胰岛素抵抗指数＝(FIN(mIU/L))*FBG((mmol/L))/22.5

8、血清IL-6、IL-10、TNF-α测定

按照上海鑫乐IL-6、IL-10、TNF-α酶联免疫分析试剂盒，检测小鼠血清中胰岛素(IL-6、IL-10、TNF-α的含量。

9、肝脏组织中相关基因表达

(1)肝脏组织总RNA的提取

将从液氮中取出的肝脏组织迅速放入研钵中，加入少量液氮并迅速研磨，待肝脏组织变软，再加入少量液氮，继续研磨，重复三次，然后将研磨好的粉末放入1.5mL RNAfree离心管中。按照Simply P总RNA提取试剂盒说明书提取小鼠肝脏组织总RNA，注意全程避光操作，超净台采用氯仿擦拭，所用器具都要采用DEPC水处理，提取后的总RNA采用RNAfree离心管收集并在-80℃条件下保存。

(2)RNA纯度和完整度的检测

取2μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，以此检测总RNA的完整性。配置琼脂糖终浓度为1％的1×TAE溶液，Gel Red作为荧光染料，150V电压下电泳10min，利用凝胶成像仪在紫外灯下观察28S、18S、5S处条带，并拍照记录。取1μL RNA样品进行OD 260、OD280的检测，以此测定RNA样品的纯度和浓度，当OD 260/280值在1.8-2.1范围内时，认为所提取的RNA质量较好，可用于后续试验。

(3)反转录体系

按照PrimeScript^TM RT试剂盒说明书适当调整样品RNA浓度，并进行反转录反应获得cDNA。反转录反应中所涉及的反应体系配制如表2-6所示。具体反应条件为：反转录反应37℃，15min；反转录酶失活反应85℃，5s。反应产物冻存于-20℃用于后续试验。

(4)Real-time RT-PCR检测结肠相关基因mRNA表达量

按照TB

Premix Ex Taq^TM II试剂盒说明书对反转录获得的cDNA进行Real-time RT-PCR反应，检测罗伊氏乳杆菌J1对小鼠肝脏组织中相关基因的表达情况。利用Primer 5.0软件对脂肪相关因子(PPARγ、C/EBPα，FAS和FABP4)特异性引物进行设计(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成。

表1引物信息

10、罗伊氏乳杆菌与乳酸菌胞外多糖复合降胆固醇作用

罗伊氏乳杆菌J1活化两代后工作液2％接种MRS-CHOL-THIO培养基37℃培养24h，4℃5000rpm离心10min取1mL上清液于干净试管加入95％的乙醇4mL，质量分数为33％的氢氧化钾溶液3mL，60℃水浴15min迅速冷却至室温加入正己烷7mL，加入蒸馏水4mL振荡，分层取3mL上层正己烷层，60℃氮吹加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液5mL，缓慢加入3mL浓硫酸摇匀，静置于波长550nm处测定吸光值，对照组为罗伊氏乳杆菌J1与胞外多糖混合组。

11、数据处理及统计学分析

所有试验数据均使用SPSS软件进行单因素方差分析，使用GraphPad Prism 8.02进行绘图分析。试验结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，P<0.05代表差异显著。

二、实验结果

1、罗伊氏乳杆菌菌粉对体重增量的影响

体重增量作为高脂饮食是否诱导小鼠肥胖最直观的指标，如图1所示，在第8周末，高脂组小鼠体重增量显著高于正常组，P＜0.05，通过灌胃罗伊氏乳杆菌菌粉J1，小鼠的体重增量得到较好的抑制。

2、罗伊氏乳杆菌菌粉对体脂率的影响

体脂率体现了动物体内脂肪占总体重中所占的比例，反映了脂肪的积累程度。从图2可以看出，高脂饮食诱导的小鼠体脂率相较于正常组显著提高，P＜0.05，经过罗伊氏乳杆菌菌粉干预后，小鼠体脂率显著降低，P＜0.05，且中剂量组和高剂量组下降更为明显。

3、罗伊氏乳杆菌菌粉对肝脏指数的影响

如表2所示，由于长期的高脂饮食，高脂组小鼠的肝脏指数显著增高，P＜0.05，而罗伊氏乳杆菌菌粉组的肝脏指数得到有效改善，P＜0.05。

表2罗伊氏乳杆菌菌粉对肝脏指数的影响

注：不同字母代表差异显著，P＜0.05，显著性差异表示方式在后续说明中继续沿用

4、罗伊氏乳杆菌菌粉对血脂的影响

对各组小鼠血脂水平的分析统计结果如下，如图3所示，与正常组相比，高脂饮食使小鼠TG、TC和LDL-C含量显著升高，HDL-C含量显著下降，P＜0.05，罗伊氏乳杆菌菌粉可以显著改善由高脂饮食引起的血脂升高。

5、罗伊氏乳杆菌菌粉对口服糖耐量、胰岛素抵抗指数的影响

由图4可以看出，正常组小鼠的血糖浓度在灌胃30min后达到最大值，且在120min内回复最初水平，与正常组相比，高脂组小鼠的葡萄糖耐量受损。在灌胃罗伊氏乳杆菌菌粉后，小鼠的葡萄糖耐量得到显著改善，P＜0.05。

6、罗伊氏乳杆菌菌粉对血清IL-6、IL-10、TNF-α的影响

IL-6和TNF-α作为机体内重要的促炎因子，有图5可以看出，经过灌胃罗伊氏乳杆菌菌粉，小鼠血清中IL-6和TNF-α含量显著下降，P＜0.05，且高剂量组较为明显。IL-10是一种抗炎细胞因子，可以通过负反馈调节抑制促炎因子和趋化因子的产生，发挥下调炎症反应的作用。通过灌胃罗伊氏乳杆菌菌粉，可显著显著升高抗炎因子IL-10的含量，P＜0.05。

7、罗伊氏乳杆菌菌粉对肝脏中相关基因的影响

结果如图6所示，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是脂肪形成的主要激活因子。脂肪酸合酶(FAS))参与了成熟脂肪细胞的形成。脂肪酸转位酶(FAT)在细胞内长链脂肪酸的摄取和氧化中起重要作用。激素敏感性脂肪酶(HSL)是脂肪酸动员、整体能量平衡和脂肪酸水解的关键酶，硬脂酰辅酶a去饱和酶1(硬脂酰辅酶a desaturase-1,SCD-1)是脂肪酸合成的主要酶。因此，脂肪生成基因是脂肪酸合成、积累和脂肪细胞分化的关键调控因子。由图4可以看出，与正常组相比，高脂组PPARγ、FAS、HSL、SCD-1的mRNA表达量显著上调，P＜0.05而罗伊氏乳杆菌菌粉组显著改善其表达水平，P＜0.05，其中高剂量组效果最为显著。

8、结果如图7所述，罗伊氏乳杆菌及罗伊氏乳杆菌J1 10¹⁰cfu/mL与胞外多糖0.5mg/mL混合组均有一定的降胆固醇能力，但对胆固醇的脱除率不相同。脱除率越大说明体外降胆固醇能力越强，说明缓解肥胖的作用越强，其中，罗伊氏乳杆菌J1的胆固醇脱除率为50.4％，罗伊氏乳杆菌与胞外多糖混合组的胆固醇脱除率为68.9％，与罗伊氏乳杆菌J1单菌组相比，胆固醇的脱除率显著提高，说明罗伊氏乳杆菌与胞外多糖混合组的组合可以起到强化功效作用的效果。

上述实验结果表明，罗伊氏乳杆菌菌粉可以通过抑制肝脏中脂肪合成基因的表达，进而减少脂肪堆积，从而缓解高脂饮食诱导的小鼠肥胖，且罗伊氏乳杆菌与胞外多糖复合的组合可以起到强化功能的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 罗伊氏乳杆菌在缓解高脂饮食诱导小鼠肥胖功能中的应用及含有罗伊氏乳杆

菌的复合物

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctacctcatg aagatcctga cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cacagcttct ctttgatgtc ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccaagaatac caaagtgcga tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcacaagcat gaactccata gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aacattcaat cccgggagaa ta 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aacattcaat cccgggagaa ta 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcactttctt ttccggtact tt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gcactttctt ttccggtact tt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctcacagtta ccatctcacc tc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ctcacagtta ccatctcacc tc 22

Claims (10)

1.罗伊氏乳杆菌J1在制备治疗高脂饮食诱导小鼠肥胖制备和治疗糖尿病药物中药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗高脂饮食诱导小鼠肥胖为降低体脂率高、降低肝脏指数、降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白含量。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗糖尿病为提高高脂饮食诱导的肥胖小鼠的口服葡萄糖耐量和降低胰岛素抵抗指数。

5.一种含有罗伊氏乳杆菌J1的组合物，其特征在于，所述所述组合物为微生物制剂，所述微生物制剂含有罗伊氏乳杆菌J1的湿细胞或者冻干细胞。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物由罗伊氏乳杆菌和胞外多糖组成。

7.根据权利要求6所述的的组合物，其特征在于，所述胞外多糖的制备方法如下：37℃培养条件下，副干酪乳杆菌JY062菌株在MRS肉汤培养基中培养24h，在容量为1.0L的三角瓶子中进行分批发酵，接种物的初始密度为1.5×10⁹CFU/mL，接种物浓度为5.0％，胞外多糖按照水提醇沉法进行提取，采用三氯乙酸去除蛋白的方法进行纯化，将去除蛋白的胞外多糖重悬于去离子水中，透析72h，分子截流量为：12000-14000Da，然后将上清液冻干，获得胞外多糖。

8.根据权利要求6所述的的组合物，其特征在于，所述胞外多糖的浓度为0.5mg/mL。

9.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物为功能性食品或保健品。

10.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌J1的含量为10⁸-10¹⁰cfu/mL。

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