CN110205261A

CN110205261A - 一种母乳来源罗伊氏乳杆菌降脂及调节脂代谢节律的应用

Info

Publication number: CN110205261A
Application number: CN201910389419.3A
Authority: CN
Inventors: 孙进; 李双祁; 齐策
Original assignee: Guangzhou Filler Biotechnology Co ltd; Hunan Feiler Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Filler Biotechnology Co ltd; Hunan Feiler Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110205261B; WO2020228144A1

Abstract

本发明公开了一种母乳来源罗伊氏乳杆菌降脂及调节脂代谢节律的应用，属于微生物技术和食品科学领域。本发明的罗伊氏乳杆菌FN041可预防和/或治疗脂代谢节律紊乱，具体体现在：(1)显著降低高脂影响下的体重增长；(2)显著降低高脂影响下的睾丸周脂肪组织指数异常增加；(3)显著降低高脂影响下的肝脂肪浸润和睾丸脂肪细胞面积异常增加；(4)显著降低高脂影响下的血清中TG、TC、LDL‑C、HDL‑C含量异常增加；(5)显著降低高脂影响下血液中血浆FD4含量以及血清中LPS、LBP、TNF‑α含量异常增加；(6)恢复高脂影响下血清中甘油三酯含量以及肝脏的生物钟基因Clock、Bmal1和Per2表达的节律性。

Description

一种母乳来源罗伊氏乳杆菌降脂及调节脂代谢节律的应用

技术领域

本发明涉及一种母乳来源罗伊氏乳杆菌降脂及调节脂代谢节律的应用，属于微生物技术和食品科学领域。

背景技术

有研究表明，人和哺乳动物肠道中15％以上的细菌的丰度会在白天和黑夜呈周期性起伏的节律性变化，这些节律性变化的细菌主要属于梭菌目、乳杆菌目以及拟杆菌目，约占肠道细菌总数的60％。也有研究表明，人和哺乳动物肠道中细菌的节律性变化会使得肠道上皮细胞在不同时间段暴露于不同数量和不同种类的细菌下，这些节律性变化的细菌会通过肠道上皮细胞传递其代谢产物至肝脏等远端组织，从而使得肝脏等远端组织的基因表达产生节律性变化，进而使得人和哺乳动物的脂代谢发生节律性变化，即脂代谢节律。

脂代谢节律对人和哺乳动物的健康十分重要，脂代谢节律一但紊乱，就会影响人和哺乳动物对食物中脂肪的吸收和储存，导致人和哺乳动物肝脏脂肪的大量合成，引起人和哺乳动物体内血清甘油三酯等的节律性紊乱。血清甘油三酯主要由肝、脂肪组织及小肠合成，其节律性紊乱会加速人和哺乳动物动脉粥样硬化、脂肪肝、脑部血管堵塞和胰岛素抵抗的发生。

然而，当今社会，人群热衷于高脂饮食、高糖饮食等的高能饮食，高脂饮食、高糖饮食等的高能饮食会使得人体肠道菌群构成和菌群定制粘液层产生紊乱，从而使得人体的基因表达产生紊乱，进而使得人体的脂代谢节律产生紊乱，最终增加人体罹患动脉粥样硬化、脂肪肝、脑部血管堵塞和胰岛素抵抗等疾病的概率。

据预测，2020年全球将有2400万人死于动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病，其中，35～45 岁人群的死亡率明显增加，发病年龄提前了10～20年。也有数据表明，仅在中国，就有10％左右的人群饱受脂肪肝的困扰。

目前，人们常通过服用他汀类药物治疗血脂紊乱，但是，此方法具有一定的副作用，在服用剂量较高时有可能导致人体发生以转氨酶升高为特征的肝损害和以肌酸激酶升高为特征的横机纹溶解，因此，急需找到一种新的可治疗脂代谢节律紊乱的药物或方法以避免这些问题。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种新的可辅助预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的食品或药物。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041已于2019年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60546，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5 楼。

所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041是通过先针对分泌型免疫球蛋白A(sIgA) 结合共生菌的生理特征，利用免疫磁珠法从来源于甘肃省甘南藏族自治州临潭县的人乳中富集母乳IgA结合菌群，再根据罗伊氏乳杆菌对万古霉素的抗性和高温可培养特性定向分离得到的。

所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041在MRS琼脂培养基上的菌落为圆形、光滑、白色，直径约1mm。

所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041具有以下特性：

(1)在pH为3.5的环境中停留2h后的存活率高于90％；

(2)在浓度分别为3g/kg和4g/kg胆汁溶液中停留4h后的存活率分别高于82％和68％；

(3)可耐受45℃高温。

本发明还提供了上述一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041在制备预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品中的应用。所述脂代谢节律是指由人和哺乳动物肠道中细菌丰度的节律性变化引起的人和哺乳动物远端组织基因表达的节律性变化所造成的人和哺乳动物脂代谢的节律性变化；所述细菌丰度是指人和哺乳动物肠道中某一种细菌的数量占人和哺乳动物肠道中细菌总数量的百分比；所述远端组织包含肝脏；所述肝脏表达的基因包含生物钟基因Clock、Bmal1和Per2。所述脂代谢节律紊乱是指由人和哺乳动物肠道中细菌丰度节律性变化的紊乱造成的人和哺乳动物脂代谢节律性变化的紊乱。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)FN041、药物载体和/或药用辅料。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品，所述产品含有上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041。

本发明还提供了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041冻存剂，所述冻存剂中，上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的活菌数为不低于1×10¹⁰CFU/mL。

本发明的一种实施方式中，所述冻存剂的制备方法为先将处于稳定期的上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041菌体用pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液清洗1～2次，然后将清洗后的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041菌体加入保护剂中，得到罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)FN041冻存剂；所述保护剂含有1g/L的半胱氨酸盐酸盐以及200g/L 的甘油。

[技术效果]

1、本发明筛选出了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041，此罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)FN041可预防和/或治疗脂代谢节律紊乱，具体体现在：

(1)灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可使高脂饲料饲喂小鼠的体重以及体重增长率较未灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的高脂饲料饲喂小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的体重增长；

(2)灌胃罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可使高脂饲料饲喂小鼠的睾丸周脂肪组织指数较未灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的高脂饲料饲喂小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的睾丸周脂肪组织指数异常增加；

(3)灌胃罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可使高脂饲料饲喂小鼠的肝脂肪浸润和睾丸脂肪细胞面积较未灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的高脂饲料饲喂小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的肝脂肪浸润和睾丸脂肪细胞面积异常增加；

(4)灌胃罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可使高脂饲料饲喂小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 的含量较未灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的高脂饲料饲喂小鼠显著降低，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 含量异常增加；

(5)灌胃罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可使高脂饲料饲喂小鼠血液中血浆FD4的含量以及血清中内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α) 的含量较未灌胃此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041的高脂饲料饲喂小鼠显著降低，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著改善小鼠肠上皮屏障通透性，抑制了高脂饲料饲喂引起的FD4进入血液导致的小鼠血液中血浆FD4含量异常增加，并且，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041发挥了保护小鼠粘膜屏障的作用，抑制了高脂饲料饲喂引起的肠道细菌进入血液导致的小鼠血清中内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP) 含量异常增加，另外，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)FN041处理可显著抑制高脂影响下的血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量异常增加；

(6)小鼠血清中甘油三酯的含量以及小鼠肝脏的生物钟基因Clock、Bmal1和Per2的表达存在明显的节律性，但是，在高脂影响下，小鼠血清中甘油三酯的含量以及小鼠肝脏的生物钟基因Clock、Bmal1和Per2的表达会丧失节律性，而罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) FN041处理可恢复此节律性。

2、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)是人肠粘膜表面含量丰富的抗体分子，其可以与肠道共生的如乳杆菌等的有益菌结合形成复合体促进有益菌在人体内发挥有益作用，此有益作用主要体现在：

第一，由于sIgA主要富集在肠道粘膜表面的粘液层，有益菌与之结合可促进其在粘液层定植；

第二，形成复合体可促进有益菌锚定于肠道上皮细胞顶端表面，促进上皮细胞紧密连接蛋白磷酸化，维持细胞与细胞的相互作用，从而增强粘膜屏障，并诱导抗炎趋化因子产生，保持粘膜的非炎环境；

第三，大多数乳杆菌可被树突或巨噬细胞识别而调节免疫反应，这些可识别乳杆菌的树突或巨噬细胞主要存在于粘膜屏障下层，包括固有层和派尔集合淋巴结(PP)，其中，PP的肠腔表面存在的sIgA受体可帮助转运sIgA结合的有益菌进入PP，这些进入PP的有益菌可和PP中的树突细胞亚群作用促进T细胞产生IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子；

第四，有益菌被sIgA结合包裹后可屏蔽细菌表面抗原，阻止其诱导过强炎性反应，

而本发明筛选得到的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可与分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)相结合，因此，本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041可以更近的距离调节近粘液层上皮细胞的生理活动，或在粘液局部释放较高浓度代谢物以调节代谢节律。

3、本发明筛选得到的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041来源于人乳，因此，本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038对人体不会产生任何伤害。

4、本发明筛选得到的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041在pH为3.5的环境中停留2h后的存活率高于90％，在浓度分别为3g/kg、和4g/kg胆汁溶液中停留4h后的存活率分别高于82％和68％，可耐受45℃高温，具有良好的生理特性。

生物材料保藏

一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041，分类学命名为Lactobacillus reuteri，已于2019年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60546，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：富集母乳IgA结合菌群并选择性分离罗伊氏乳杆菌的流程图。

图2：罗伊氏乳杆菌FN041对高脂饲料喂养小鼠增重和脂肪积累的影响；其中，A：体重变化，B：体增重率，C：器官指数，D：睾周脂肪和肝脏组织HE染色；数据为平均值± 标准差(n＝5)；*p<0.05，**p<0.01，与CON对比；^#p<0.05，^##p<0.01，与HFD组比较；采用单因素方差分析进行比较，随后进行Tukey多重比较；CON：对照组，HFD：高脂饲料饲喂对照组，HFD+R：罗伊氏乳杆菌FN041处理的高脂饲料饲喂组。

图3：罗伊氏乳杆菌FN041对高脂饲料喂养小鼠血脂节律性变化的影响；其中，数据为平均值±标准差(n＝5)；*p<0.05，**p<0.01，与CON对比；^##p<0.01，与HFD组比较；采用单因素方差分析进行比较，随后进行Tukey多重比较；CON，对照组；HFD，高脂饲料饲喂对照组；HFD+R，罗伊氏乳杆菌FN041处理的高脂饲料饲喂组；TG：血清中甘油三酯含量，TC：血清总胆固醇含量，LDL-C：血清低密度脂蛋白胆固醇含量，HDL-C：血清高密度脂蛋白胆固醇含量。

图4：罗伊氏乳杆菌FN041对高脂饲料喂养小鼠粘膜屏障的影响；其中，数据为平均值± 标准差(n＝5)；*p<0.05，**p<0.01，与CON对比；^#p<0.05，^##p<0.01，与HFD组比较；采用单因素方差分析进行比较，随后进行Tukey多重比较；CON：对照组，HFD：高脂饲料饲喂对照组，HFD+R：罗伊氏乳杆菌FN041处理的高脂饲料饲喂组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS琼脂培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄·7H₂O 0.25g/L、吐温-801g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1000g/L。

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄·7H₂O 0.25g/L、吐温-801g/L、蒸馏水1000g/L。

实施例1：母乳样品采集

具体步骤如下：

选择体检和体征调查证明健康的哺乳母亲，在收到样品采集知情同意书的情况下开始采集母乳；用吸奶器采集母乳前洗净双手，使用尺寸合适的吸乳护罩，将乳头放置于吸乳护罩中心部位，保持密闭性，选择适合压力(170～60mmHg)；母乳保存于存乳袋，在冰上于2h 内运送到分析场所。

实施例2：母乳菌群的收集和罗伊氏乳杆菌分析

具体步骤如下：

将母乳于8000～12000rpm离心15min(4℃)，去除液体，收集离心管底部的固型物；取部分固型物提取DNA，用罗伊氏乳杆菌特异性PCR分析罗伊氏乳杆菌的存在情况。

实施例3：IgA结合菌富集

具体步骤如下：

如图1，将母乳离心获得的固形物悬浮于蛋白胨缓冲液，加入牛血清白蛋白封闭非特异性结合(终浓度分别为10％、0.05～0.5％)，加入生物素标记的兔抗人IgA血清，孵育15～30min，再加入链霉亲和素修饰磁珠(添加量为0.1-1.0mg/mL)，用磁铁吸附菌体，用蛋白胨缓冲液洗两次，即得IgA结合菌群。

实施例4：罗伊氏乳杆菌的分离

具体步骤如下：

1、筛选

将实施例3获得的菌群在无菌条件下用PBS缓冲溶液(pH 6.8)梯度稀释，吸取合适的稀释度溶液(每mL含有100个左右细菌)100微升涂布于含有万古霉素(50μg/mL)的MRS琼脂培养基平板，平板倒置放入厌氧培养箱，37℃培养36～72h，观察并记录菌落形态；挑取MRS琼脂培养基平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取MRS 琼脂培养基平板上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落；挑取MRS琼脂培养基平板上的纯菌落接种于5mLMRS液体培养基中，37℃培养18h；取1mL 菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，菌泥重悬于30％甘油溶液中置于-80℃中保藏，得到菌株。

2、鉴定

对分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送至华大基因测序有限公司进行测序，将测序得到的结果在ezbiocloud中进行核酸序列比对，其中，有一株菌的核苷酸序列与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)JCM 1112的相似性达到99.72％，判定此菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041(FN041的16SrDNA序列如 SEQ ID NO.1所示)。

3、培养

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041接入MRS琼脂培养基平板上37℃培养 36～72h后，观察其菌落，发现其菌落为圆形、光滑、白色，直径约1mm。

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041置于pH为3.5的生理盐水中停留2h，发现其在pH为3.5的环境中停留2h后的存活率高于90％。

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041分别置于浓度为3g/kg、和4g/kg胆汁溶液中停留4h，发现其在浓度分别为3g/kg、和4g/kg胆汁溶液中停留4h后的存活率分别高于 82％和68％。

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041接入MRS液体培养基中，分别于35、40、 45、50℃培养36～72h后，观察其生长曲线，发现其可耐受45℃高温，于35～45℃的温度范围内均能良好生长。

实施例5：罗伊氏乳杆菌FN041在预防和/或治疗高能饮食引起的代谢节律紊乱方面的应用

具体步骤如下：

1)动物实验分组

将3周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，随机分笼预饲养一周结束后开始正式实验，小鼠随机分成正常膳食组(CON组，20只)，饲喂低脂膳食(12％能量来源于脂肪)；高脂日粮组(HFD 组，80只)，饲喂高脂日粮(45％能量来源于脂肪)；高脂日粮和正常膳食的配方见表1。

小鼠的饲养温度为24±3℃，湿度60±10％，动物房每日12h开灯光，12h黑暗；每周称重，记录小鼠每周的体重、采食量和摄水量；灌胃实验在正式饲养7周后开始，将高脂日粮组小鼠随机分2组(每组20只)，每日分别灌胃磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.3)(HFD组) 和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041菌悬液(HFD+R组)；其中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041菌悬液的浓度为8.0×10⁸CFU/mL，灌胃体积为200μL/只，灌胃时间为下午16:00。

表1动物饲料配方

注：(a)混合矿物质配方(1kg)：FeSO₄·H₂O(256g)，GuSO₄·H₂O(27.9g)，MnSO₄·H₂O(243.8g)，ZnSO₄·H₂O(137g)，Na₂SeO₃(0.5g)，KI(0.7g)。

实验最后一天，将每组小鼠分为四批(5只每批)，其中三批小鼠分别在2:00、8:00和 20:00处死，另外一批小鼠在10:00灌胃荧光素FITC-dextran(FD4)，灌胃量为0.6mg/g体重，灌胃4h后(14:00)处死，取外周血，用fluorescent microplate reader(激发光485nm，发射光535nm)检测血浆FD4；所有动物处死后测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量以及内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP)和血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量，并使用Acrophase软件进行血脂生理节律的余弦拟合以对血脂生理节律进行分析；

其中，血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量通过购自南京建成的试剂盒进行检测；

内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP)、血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量通过购自厦门慧嘉的酶联免疫试剂盒进行检测；

血脂生理节律变化通过如下方法分析：

采用Trizol法提取小鼠肝脏中生物钟基因Clock、Bmal1以及Per2的RNA，用NanoDrop 测定其纯度(OD260/280)和浓度，调节RNA浓度至1000ng/μL左右，即OD_260/280在1.8～2.0 范围内；反转录过程分两步，第一步体系混匀后85℃，5min，冰浴上迅速冷却，随后加入第二步体系混匀后，37℃水浴1h，95℃，3min，获得cDNA；以反转录后的cDNA作为荧光定量PCR的模板，获得RNA，基因引物序列为：

肝脏的生物钟基因Clock(NCBI Gene ID:12753)的引物：

核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的F：AGCACACACACTTCCTCTCTGACAT；

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的R：ATCAAGGGACTGAACACTCAAGACC；

肝脏的生物钟基因Bmal1(brain andmuscleARNT-like-1)(NCBI Gene ID:11865)的引物：

核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的F：AGTCAGATTGAAAAGAGGCGTCG；

核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的R：AGAAATGTTGGCTTGTAGTTTGCTT；

肝脏的生物钟基因Per2(Period2)(NCBI Gene ID:18627)的引物：

核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的F：TTCTCTGCTGTTCTTGTATCCTTTT；

核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的R：GCTTTCTGCTGGGAGCTAATG；

荧光定量PCR的扩增条件为：95℃，5min；95℃，20s，62℃，30s，72℃，20s；72℃，2min；以β-actin作为内参，采用2^-△△Ct法对数据进行分析，数学模型为：Y＝M+Acos(ωt+θ)；其中，M是中值，A是节律振幅，ω是节律角频率，θ是峰值相位，通常情况下P<0.05则证明节律存在。

2)实验结果

如图2A所示，HFD组小鼠的体重相对CON组小鼠显著增加(P<0.01)，涨幅约14％；HFD+R组小鼠的体重增长幅度相对HFD组小鼠显著下降，降幅约7％；如图2B所示，HFD 组小鼠的体重增长率相对CON组小鼠显著增加，涨幅约56％；HFD+R组小鼠的体重增长率相对HFD组小鼠显著下降(P<0.05)，降幅约21％，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的体重增长。

如图2C所示，HFD组小鼠的睾丸周脂肪组织指数相对CON组小鼠显著增加(P<0.01)，涨幅约100％；HFD+R组小鼠的睾丸周脂肪组织指数相对HFD组小鼠显著下降，降幅约30％，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的睾丸周脂肪组织指数异常增加。

如图2D所示，HFD+R组小鼠的肝脂肪浸润和睾丸脂肪细胞面积相对HFD组小鼠显著下降(P<0.05)，降幅分别约10％和28％，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041 处理可显著降低高脂影响下的肝脂肪浸润和睾丸脂肪细胞面积异常增加。

如图3A所示，HFD组小鼠血清中甘油三酯的含量相对CON组小鼠在8:00(P＜0.05)、14:00(P＜0.01)、20:00时(P＜0.05)时明显升高；HFD+R组小鼠血清中甘油三酯的含量相对HFD组小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的血清中甘油三酯(TG)含量异常增加。

如图3B所示，HFD组小鼠血清中总胆固醇的含量相对CON组小鼠在8:00和14:00时显著升高(P＜0.05)；HFD+R组小鼠血清中总胆固醇的含量相对CON组小鼠无明显升高，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的血清中总胆固醇(TC)含量异常增加。

如图3C所示，除14:00外，HFD组小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量相对CON组小鼠均显著升高；HFD+R组小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量相对HFD组小鼠显著下降，尤其是在8:00和2:00时(P＜0.01)，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041 处理可显著降低高脂影响下的血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量异常增加。

如图3D所示，HFD组小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量相对CON组小鼠显著下降； HFD+R组小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量相对HFD组小鼠显著升高，尤其是在14:00 时(P＜0.05)，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著降低高脂影响下的血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量异常增加。

如图4A所示，HFD组小鼠血液中血浆FD4的含量相对CON组小鼠显著上升；HFD+R 组小鼠血液中血浆FD4的含量相对HFD组小鼠显著下降，几乎与CON组小鼠持平，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著改善小鼠肠上皮屏障通透性，抑制了高脂饲料饲喂引起的FD4进入血液导致的小鼠血液中血浆FD4含量异常增加。

如图4B、4C所示，HFD组小鼠血清中内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP)的含量相对CON组小鼠显著上升；HFD+R组小鼠血清中内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP) 含量相对HFD组小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041发挥了保护小鼠粘膜屏障的作用，抑制了高脂饲料饲喂引起的肠道细菌进入血液导致的小鼠血清中内毒素(LPS)、内毒素结合蛋白(LBP)含量异常增加。

如图4D所示，HFD组小鼠血清中血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量相对CON组小鼠显著上升；HFD+R组小鼠血清中血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量相对HFD组小鼠显著下降，可见，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可显著抑制高脂影响下的血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量异常增加。

由表2-3可知，小鼠血清中甘油三酯的含量以及小鼠肝脏的生物钟基因Clock、Bmal1和 Per2的表达存在明显的节律性，但是，在高脂影响下，小鼠血清中甘油三酯的含量以及小鼠肝脏的生物钟基因Clock、Bmal1和Per2的表达会丧失节律性，而罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)FN041处理可恢复此节律性。

表2罗伊氏乳杆菌FN041对高脂饲料喂养小鼠血脂昼夜节律变化的影响

注：CON：对照组，HFD：高脂饲料饲喂对照组，HFD+R：罗伊氏乳杆菌FN041处理的高脂饲料饲喂组。

表3罗伊氏乳杆菌FN041对高脂日粮小鼠肝脏生物钟基因昼夜节律表达的影响

	拟合优度	振幅(mmol/L)	峰值相位(hr)	相变(hr)
					Clock
CON	0.043	0.559	9	-
					HFD	0.088	0.155	-	-
HFD+R	0.042	0.280	3	-6
					Bmal1
CON	0.049	0.569	9	-
					HFD	0.059	0.290	-	-
HFD+R	0.046	0.303	9	0
					Per2
CON	0.040	4.915	21	-
					HFD	0.076	3.838	-	-
HFD+R	0.008	5.215	21	0

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 湖南菲勒生物技术有限公司

孙进

广州菲勒生物科技有限公司

<120> 一种母乳来源罗伊氏乳杆菌降脂及调节脂代谢节律的应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）

<400> 1

acatgcaagt cgtacgcact ggcccaactg attgatggtg cttgcacctg attgacgatg 60

gatcaccagt gagtggcgga cgggtgagta acacgtaggt aacctgcccc ggagcggggg 120

ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataacaacaa aagccacatg gcttttgttt 180

gaaagatggc tttggctatc actctgggat ggacctgcgg tgcattagct agttggtaag 240

gtaacggctt accaaggcga tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg gccacaatgg 300

aactgagaca cggtccatac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatgggc 360

gcaagcctga tggagcaaca ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaagctctgt 420

tgttggagaa gaacgtgcgt gagagtaact gttcacgcag tgacggtatc caaccagaaa 480

gtcacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 540

tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tgcttaggtc tgatgtgaaa gccttcggct 600

taaccgaaga agtgcatcgg aaaccgggcg acttgagtgc agaagaggac agtggaactc 660

catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc 720

tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg 780

gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctag gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg 840

gagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 900

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa 960

ccttaccagg tcttgacatc ttgcgctaac cttagagata aggcgttccc ttcggggacg 1020

caatgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080

gcaacgagcg caacccttgt tactagttgc cagcattaag ttgggcactc tagtgagact 1140

gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcagat catcatgccc cttatgacct 1200

gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aacgagtcgc aaactcgcga gagtaagcta 1260

atctcttaaa gccgttctca gttcggactg taggctgcaa ctcgcctaca cgaagtcgga 1320

atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380

cgcccgtcac accatgggag tttgtaacgc ccaaagtcgg tggcctaacc tttatggagg 1440

gagcc 1445

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcacacaca cttcctctct gacat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcaagggac tgaacactca agacc 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtcagattg aaaagaggcg tcg 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agaaatgttg gcttgtagtt tgctt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttctctgctg ttcttgtatc ctttt 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctttctgct gggagctaat g 21

Claims

1.一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)已于2019年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60546，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在制备预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品中的应用。

3.如权利要求2所述的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在制备预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

4.如权利要求2或3所述的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在制备预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。

5.如权利要求4所述的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在制备预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品中的应用，其特征在于，所述药品含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、药物载体和/或药用辅料。

6.一种用于预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品，其特征在于，所述产品含有如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

7.如权利要求6所述的一种用于预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品，其特征在于，所述产品中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

8.如权利要求6或7所述的一种用于预防和/或治疗脂代谢节律紊乱的产品，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。

9.一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)冻存剂，其特征在于，所述冻存剂中，权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的活菌数为不低于1×10¹⁰CFU/mL。

10.如权利要求9所述的一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)冻存剂，其特征在于，所述冻存剂的制备方法为先将处于稳定期的权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌体用pH为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液清洗1～2次，然后将清洗后的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌体加入保护剂中，得到罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)冻存剂；所述保护剂含有1g/L的半胱氨酸盐酸盐以及200g/L的甘油。