CN108210525A - 乳酸杆菌益生菌cgmcc no.12422在制备减肥药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸杆菌益生菌菌株在制备减肥药物中的应用，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12422，保藏日期为2016年5月6日。所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，所述菌株对动物无害，且具有降低动物体重的功效，不仅适宜于降低血脂水平偏高的肥胖动物体重，而且对于血脂水平正常的肥胖动物体重也具有明显的降低体重的功效。所述CGMCC NO.12422菌株高、中剂量干预组的小鼠比起肥胖模型组小鼠体重分别能够减轻21.81％和18.74％。

Description

乳酸杆菌益生菌CGMCC NO.12422在制备减肥药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种益生菌在制备减肥药物中的应用。

背景技术

肥胖是现代社会面临的一个突出的健康问题，这主要是因为随着生活水平的提高，人们营养摄入明显过剩，再加上都市化的生活导致运动量减少，人体内的以脂肪为代表的能量物质消耗不足，从而导致人体脂肪的过量储存，表现为脂肪细胞的增多和细胞体积的增大，即全身脂肪组织块增大，与其它组织失去正常比例的一种状态，常表现为体重增加，超过了相应的身高所确定的标准体重。肥胖者由于身体过重，对骨骼和关节等运动系统，特别是对脊椎和下肢产生超负荷压力，久而久之，积劳成疾，发生关节炎，肌肉劳损或脊神经压迫等症状，造成腰腿肩背酸痛，甚至关节变形。肥胖也是引起高血压、冠心病、糖尿病等重大疾病的主要诱因。肥胖在影响人们健康的同时，也带来了很多社会问题，如正常的社会交际，工作学习等方面，都可能因为肥胖而带来许多烦恼，甚至被歧视等，严重影响着人们的身心健康。

目前市场上有许多减肥产品，但大多数产品都存在一定的依赖性和副作用，影响机体健康。少数一些产品在使用初期会有一定的效果，如果一旦停用就很快出现反弹，因此很难达到减肥降脂的目的。

益生菌(Probiotics)被定义为“一类活的微生物，以合适的数量被摄入后能给机体带来益处”。目前普遍认为可作为益生菌制品的细菌应具备以下条件：(1)对宿主有益；(2)无毒性作用和致病作用；(3)能在消化道内存活；(4)能适应胃酸和胆盐；(5)能在消化道表面定植； (6)能产生有用的脂类和代谢物；(7)在加工和储藏过程中能保持活性； (8)具有良好的感官特性。1963年非洲部落由于大量食用乳酸菌发酵制品而使体内血清胆固醇含量较低的发现引起了科学界对益生菌降低胆固醇功效的关注。乳酸杆菌在体外环境下降低胆固醇的机理主要包括共沉淀机制，菌体吸收和代谢机制，膜镶嵌机制。国内外已经有许多关于乳酸菌降胆固醇作用的文献报道。基于乳酸杆菌对生物体脂代谢的干预机理，本发明旨在从乳酸杆菌中筛选出能够有效降低生物机体体重的益生菌株，进而开发其在制备减肥药物中的应用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种乳酸杆菌益生菌菌株在制备减肥药物中的应用，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12422，保藏日期为2016年5月6日，保藏分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明还提供了另一种乳酸杆菌益生菌菌株在制备减肥药物中的应用，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的CGMCC NO.12422菌株是从只摄食植物的青海野生旱獭粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的乳酸杆菌，实验证明分离得到的乳酸菌对动物无害，中国发明专利申请CN201610757751.7公开的内容显示，该乳酸杆菌益生菌菌株具有调节血脂的功效，能显著降低低密度脂蛋白，总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的调节血脂功效。本发明通过引用，将上述专利文件的公开内容全部并入到本发明的公开内容中。在本发明中，申请人发现CGMCC NO.12422 菌株对于降低动物体重具有明显的功效，不仅适宜于降低血脂水平偏高的肥胖动物体重，而且对于血脂水平正常的肥胖动物体重也具有明显的降低体重的功效。本发明的实施例显示，CGMCC NO.12422菌株高、中剂量干预组的小鼠比起肥胖模型组小鼠体重分别减轻21.81％和18.74％。

附图说明

图1.HT121干预C57/6N小鼠体重增长曲线图；

图2.HT121干预C57/6N小鼠11周时的各组小鼠体重分布图；

图3.HT121干预显著降低C57/6N小鼠的血糖和糖耐量水平；

图4.HT121干预组小鼠禁食6小时后的血糖水平图；

图5.HT121干预组小鼠禁食6小时，腹腔注射葡萄糖2个小时后的血糖水平图；

图6.高、低剂量干预组与肥胖组的肝脏重量对照图；

图7.高、低剂量干预组与肥胖组的肾周脂肪重量对比图；

图8.高、低剂量干预组与肥胖组的血清瘦素水平对比图；

图9.高、低剂量干预组与肥胖组的血清胆固醇水平对比图；

图10.高、低剂量干预组与肥胖组的血清甘油三酯水平对比图；

图11.高、低剂量干预组与肥胖组的血清高密度脂蛋白水平对比图；

图12.高、低剂量干预组与肥胖组的血清低密度脂蛋白水平对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.乳酸菌的分离、筛选和鉴定

1.乳酸杆菌的分离

1)从保菌管中取出标本100μL，加入到预装900μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，旱獭粪便标本浓度稀释至10^-6倍；

2)取不同稀释度的样品100μL涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；

3)在37℃，0.5％CO₂环境中培养48h；

4)取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在pH＝3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。

2.菌种保藏

本实验室用含25％甘油的MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：

1)将容量为2mL的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；

2)乳酸杆菌在MRS固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入 1.5ml的无菌保菌液；

3)用L棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中；

4)将菌液转移到保菌管中，混匀后-80℃保藏。

3.菌落外观和菌体形态观察

乳酸杆菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧条件下，乳酸杆菌亦可生长，大部分菌种菌落表面较粗糙，菌落颜色多为乳白色。镜下观察乳酸杆菌细胞形态为多形性，多呈细长杆状、较粗杆状、球杆状等，排列呈栅栏状、链状等。

4.细菌总DNA的提取

将单个菌落接种于BHI培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书操作，提取DNA。

5.菌株的生化鉴定方法

本研究采用法国梅里埃公司生产的“BioMerieux”细菌系统生化鉴定卡API50CHL。

结果：根据生化鉴定，获得了一株生化特征为植物乳杆菌的菌株，菌株保藏号为CGMCC NO.12422，发明人还同时获得了一株生化特征为发酵乳杆菌的菌株，菌株保藏编号为CGMCC NO.12421，保藏日期为2016 年5月6日，保藏分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

6.细菌通用引物16S rRNA PCR扩增

细菌16S rRNA鉴定：提取细菌基因组DNA，扩增乳酸杆菌通用引物16S rDNA PCR产物测序，序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。

本实验所用的细菌16S rRNA PCR扩增的引物以及PCR反应的条件如下所述，实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测乳酸杆菌通用引物 16S rRNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定。挑选具有代表性的样本PCR产物测序。测序结果根据BLAST的比对完成对乳酸杆菌的初步鉴定。结果显示CGMCC NO.12421菌株为罗氏乳杆菌(SEQ ID NO:1)，CGMCC NO.12422菌株为植物乳杆菌(SEQ ID NO:2)。

通用引物16S rRNA PCR扩增条件

引物序列：

27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

反应体系(50μl)

扩增条件

针对CGMCC NO.12421菌株的生化反应和16S rRNA序列的鉴定结果不一致，进一步做基因组测序后，对核心(core-pan)基因组做了系统进化树，通过系统进化树可以看出CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株与其他乳酸杆菌的进化关系，确认了16S rRNA序列的鉴定结果，CGMCC NO.12421菌株为罗伊氏乳杆菌，而不是生化特征相似的发酵乳杆菌。

实施例2.CGMCC NO.12422菌株(简称为HT121菌株)的降低体重功能评价

2.1.实验设计

将18-22克体重的66只雌性C57B6/N小鼠于屏障系统下全部喂饲 10％脂肪能量比的非肥胖对照饲料(D12450B 10％kcal％fat)观察5天。 5天后按体重随机分组，20只小鼠继续给予维持饲料作为空白对照组和益生菌干预组。46只小鼠喂60％脂肪能量比的肥胖诱导饲料 (D12492,60％kcal％fat)14天作为肥胖模型组。每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体重1次。对给予肥胖诱导饲料的小鼠按体重增重排序，淘汰体重增重较低的12只肥胖抵抗小鼠。将筛选出的36只肥胖敏感小鼠按体重随机分成3组，分别为肥胖模型组和中、高两个剂量益生菌干预组，继续喂饲9周肥胖诱导饲料。肥胖模型组和两个剂量干预组继续给予肥胖诱导饲料，非肥胖对照组10只和非肥胖益生菌干预组10 只继续给予9周对照饲料。喂饲对照饲料的10只益生菌干预组和喂饲肥胖诱导饲料的24只益生菌干预组分别每天经饮水给予10⁸-10⁹CFU两个剂量的益生菌进行干预，12只肥胖模型组和10只非肥胖对照组给予等量的无菌水。干预9周，每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体重1 次。在给予肥胖诱导饲料和益生菌前后分别留取粪便做菌谱分析。试验结束后，称体重，解剖取肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，并称重，评价乳酸菌对肥胖模型的预防干预效果。收集脂肪和肝脏组织及血清做进行多种指标检测。观察葡萄糖耐受的指标。对照饲料摄入乳酸菌的小鼠表现正常，摄入11周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。

2.2.实验结果

2.2.1.HT121菌株能显著抑制肥胖小鼠的体重增加

C576B/N小鼠肥胖诱导饲料喂养2周后开始益生菌干预，持续干预 11周。中、高剂量干预组每日分别摄入含有HT121的10⁸和10⁹活菌液。图1显示11周干预实验期间的小鼠体重变化趋势，高、低剂量组都能显著减少小鼠的体重。干预的第7和8周，高剂量组的干预效果比低剂量组显著；干预的第11周，高、低剂量组之间小鼠的体重没有明显的差异 (P>0.05)。

图2显示HT121干预C57/6N小鼠11周时的各组小鼠体重。图2中， 1为非肥胖组，2为非肥胖干预组，3为肥胖组，4为肥胖低剂量干预组， 5为肥胖高剂量干预组。干预第11周时，肥胖模型组和高、低剂量益生菌干预组小鼠的体重分别为44.98±2.52g；35.17±3.09g和36.55±3.50g。高、低剂量干预组的小鼠比起肥胖模型组小鼠体重显著减轻(P<0.01)。高、低剂量干预组的小鼠比起肥胖模型组小鼠体重分别减轻21.81％和 18.74％该结果表明益生菌干预能显著减低肥胖小鼠的体重增加。

2.2.2.HT121菌株能显著降低肥胖小鼠的糖耐量和血糖水平

鼠禁食6小时，每只小鼠给予腹腔注射1.5g/kg葡萄糖，观察益生菌干预对糖耐量的影响。图3显示小第15分钟和30分钟肥胖高剂量干预组和肥胖组之间没有显著差异(P>0.05)，第60分钟和120分钟肥胖高剂量干预组血糖水平显著低于肥胖组(P<0.01)。图4中，1为非肥胖组， 2为肥胖组，3为肥胖高剂量干预组。图4表明注射1.5g/kg葡萄糖2个小时后肥胖高剂量干预组小鼠的血糖水平比起肥胖组下降35.69％(P< 0.05)。该结果表明益生菌干预对肥胖小鼠的血糖有下调作用，但肥胖高剂量干预组仍高于非肥胖组(P<0.05)，说明HT121有干预效果，但仍不如正常小鼠的糖耐受水平。

图5中，1为非肥胖组，2为肥胖组，3为肥胖高剂量干预组。图5 表明禁食6小时注射葡萄糖前，非肥胖和肥胖高剂量干预组小鼠的血糖水平没有显著差异，均显著低于肥胖组，HT121肥胖高剂量干预组小鼠的血糖水平比肥胖组下降13.14％(P<0.05)。说明HT121干预能显著降低肥胖小鼠的空腹血糖水平，其空腹血糖水平接近正常小鼠。

2.2.3.HT121菌株干预能显著降低肥胖小鼠的肝脏重量

图6中，1为非肥胖组，2为非肥胖干预组，3为肥胖组，4为肥胖低剂量干预组，5为肥胖高剂量干预组。图6显示，高、低剂量的HT121 干预均能显著降低肥胖小鼠的肝脏重量(P<0.05)。高剂量干预组小鼠的肝脏重量比肥胖组下降32.64％。HT121对降低小鼠肝脏重量和降低小鼠体重趋势是一致的。高、低剂量组之间相比较，没有显著差异(P> 0.05)。说明益生菌只要超过一定的剂量对肥胖小鼠都有干预作用。

2.2.4.HT121菌株干预能显著降低肥胖小鼠的内脏脂肪重量

图7中，1为非肥胖组，2为非肥胖干预组，3为肥胖组，4为肥胖低剂量干预组，5为肥胖高剂量干预组。图7显示，高、低剂量的HT121 干预都能显著降低肥胖模型小鼠的肾周脂肪的重量(P<0.05)。高剂量干预组小鼠肾周脂肪重量比肥胖模型组下降50.08％。但是高、低剂量的 HT121干预组小鼠附睾脂肪重量和肥胖模型组未见显著差异。

2.2.5.HT121菌株干预能显著降低高脂诱导肥胖小鼠的血清瘦素水平

图8中，1为非肥胖组，2为非肥胖干预组，3为肥胖组，4为肥胖低剂量干预组，5为肥胖高剂量干预组。图8显示，肥胖小鼠的体重与血清瘦素(LEP)呈现显著的负相关，高剂量的HT121干预能显著升高小鼠的血清瘦素水平(P<0.05)，提示益生菌降低体重可能与益生菌引起的瘦素升高有关。

2.2.6.肥胖模型小鼠与正常体重组的血脂水平对比

在图9-12中，1为非肥胖组，2为非肥胖干预组，3为肥胖组，4为肥胖低剂量干预组，5为肥胖高剂量干预组。图9显示高能量饲料诱导的肥胖模型小鼠的血清总胆固醇与非肥胖对照组无显著差异，HT121干预对肥胖模型小鼠的正常血脂水平无显著影响。图10显示高能量饲料诱导的肥胖模型小鼠的血清甘油三酯与非肥胖对照组无显著差异，HT121干预对肥胖小鼠的正常甘油三酯水平无显著影响。图11显示高能量饲料诱导的肥胖模型小鼠的血清高密度脂蛋白与非肥胖对照组无显著差异， HT121干预对肥胖小鼠的正常血清高密度脂蛋白水平无显著影响。图12 显示高能量饲料诱导的肥胖模型小鼠的血清低密度脂蛋白与非肥胖对照组无显著差异，HT121干预对肥胖小鼠的正常血清低密度脂蛋白水平无显著影响。

总之，高能量饲料诱导的肥胖模型小鼠的血脂与非肥胖对照小鼠的血脂水平无显著差异，HT121菌株干预对肥胖与非肥胖小鼠的正常血脂水平无显著意义的影响。

HT121作为降脂药物使用时，其对高血脂模型小鼠的血脂有降低作用。在本发明中，应用于实验的肥胖模型小鼠的血脂并无显著升高，当将HT121作为减肥药物使用时，其对肥胖小鼠模型动物的正常未升高的血脂亦无影响，但是，对血脂正常的肥胖小鼠体重有显著降低作用。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 乳酸杆菌益生菌CGMCC NO.12422在制备减肥药物中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1480

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 1

agcggcggtg tgctatacat gcaagtcgta cgcactggcc caactgattg atggtgcttg 60

cacctgattg acgatggatc accagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc 120

tgccccggag cgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa caacaaaagc 180

cacatggctt ttgtttgaaa gatggctttg gctatcactc tgggatggac ctgcggtgca 240

ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac 300

tgatcggcca caatggaact gagacacggt ccatactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atgggcgcaa gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420

gctcgtaaag ctctgttgtt ggagaagaac gtgcgtgaga gtaactgttc amgcagtgac 480

ggtatccaac cagaaagtca cggctaayta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttgct taggtctgat 600

gtgaaagcct tcggcttaac cgaagaagtg catcggaaac cgggcgactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780

aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggarggttt 840

ccgcccttca gtgccggagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900

gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcttgc gctaacctta raraataagg 1020

cgttcccttc ggggacgcaa tgacaggtgg tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttac tagttgccag cattaagttg 1140

ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac gtcagatcat 1200

catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acggtacaac gagtcgcaag 1260

ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc gttctcagtt cggactgtag gctgcaactc 1320

gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1380

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt gtaacgccca aagtcggtgg 1440

cctaaccttt atggagggag ccgcctaagc gacagggtct 1480

<210> 2

<211> 1463

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 2

gggcgagtgc tatacatgca gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga 60

tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 120

gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 180

cttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 240

ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 300

tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360

gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 420

tgttgttaaa gaagamcatw tykgagagta actgttcagg tatkgacggt atttamccag 480

aaagccacgg ctaactacgt sccascagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540

ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 600

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ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720

gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 780

ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840

ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa 900

ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa 960

gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaarag attaracgtt cccttcsggg 1020

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cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag 1140

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cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag 1260

ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1320

ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380

caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg 1440

aaccagccgc taagcggaca gat 1463

Claims (2)

1.一种乳酸杆菌益生菌菌株在制备减肥药物中的应用，所述菌株的保藏号为CGMCCNO.12422，保藏日期为2016年5月6日。

2.一种乳酸杆菌益生菌菌株在制备减肥药物中的应用，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。