CN104887716A - 用于治疗第二型糖尿病的罗伊氏乳杆菌gmnl-89组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种乳杆菌用于治疗第二型糖尿病的新用途，其中该乳杆菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC M207154的活菌、死菌或其培养物上清液，及药学上可接受的载剂。并公开了本发明菌株在第二型糖尿病动物模式中，具有抗氧化酵素活性、抗发炎、降血糖、降三酸甘油酯、降总胆固醇、降低密度脂蛋白、提升高密度脂蛋白、提升胰岛素利用率等功效。

Description

用于治疗第二型糖尿病的罗伊氏乳杆菌GMNL-89组合物及其用途

技术领域

本发明涉及乳杆菌分离株的技术领域，特别是涉及用于治疗第二型糖尿病的罗伊氏乳杆菌GMNL-89组合物及其用途。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种多病因性的代谢疾病，是由于胰岛素分泌或作用产生缺陷而引起广泛性代谢障碍，所引起的疾病。糖尿病是以持续性慢性高血糖为主要特征的疾病，且亦会造成体内蛋白质、脂肪、水、电解质等代谢失调。

临床上将糖尿病主要分成二类：

第一型：胰岛素依赖型糖尿病(Insulin-dependent diabetic mellitus,IDDM)，一般发作年龄于30岁以下者居多，因此过去曾称为「青幼年发病型糖尿病」，事实上任何年龄皆可能发生。第一型糖尿病是一种自身免疫系统对胰脏兰氏小岛(Islet of Langerhans)的β细胞进行攻击破坏的自体免疫疾病(AutoimmuneDisease)。原因与个人的基因遗传、环境因素中的病毒感染、或毒性物质破坏胰脏的β细胞、及自体免疫形成抗β细胞的抗体、及细胞免疫作用攻击β细胞有关。最后导致患者的胰脏无法正常分泌胰岛素，而极易发生酮酸血症，因此需注射胰岛素来治疗。

第二型：非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin dependent diabetic mellitus,NIDDM)，大多发生于40岁以后，患者多为体型较肥胖者，过去称为「成年型糖尿病」，但亦可能发生于年轻人，以家族型发病较为常见，此类型糖尿病在台湾占糖尿病总人口数的95%以上。此类型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷，及胰岛素抗阻性(insulin resistance)所引起的；虽有部分患者胰岛素的分泌减少，但大多数患者分泌胰岛素的能力尚可，因此，大多靠饮食控制及口服降血糖药物控制血糖，而不需立即注射胰岛素治疗。此外，患者大多会伴随胰岛素抗阻性(insulin resistance)的症状。胰岛素抗阻性的形成主要是因胰脏兰氏小岛的β细胞过度地分泌胰岛素(hyperinsulinamia)，造成骨骼肌、脂肪组织及肝脏等周边组织对胰岛素的敏感性(insulin sensitivity)降低。因而减低了组织对葡萄糖的利用率，而造成高血糖的现象。此类型病程进展缓慢，因此，早期并无典型糖尿病症状，不易察觉。但常伴随糖尿病性大血管(如心肌梗塞、脑中风)、小血管(如肾脏、眼网膜及神经病变)等慢性并发症。

此外，在第二型糖尿病病患身上经常伴随着脂质代谢异常的情况，如血浆中三酸甘油酯(triglyceride,TG)浓度上升、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度下降以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度上升。这些症状会导致第二型糖尿病患者心血管疾病的风险。另，根据研究指出，严重糖尿病患者的肝脏血脂值清除能力会下降。当肝脏中三酸甘油脂以及低密度脂蛋白胆固醇不断的累积后，肝细胞便会发生病变形成非酒精性脂肪肝进而严重影响肝功能。

目前用于治疗糖尿病的方式，除可施予胰岛素外，另分为非药物治疗与药物治疗两种。在非药物治疗方面，主要是利用饮食调控和运动的方式来加以治疗。而在药物治疗方面，主要的目的是使不足的胰岛素上升、调降进食后的高血糖和改善胰岛素抗阻性等。目前用于治疗糖尿病的药物可分为：

(1)磺酰尿素类(Sulfonylurea)：此类药物主要机转为促进胰脏胰岛素的分泌，特别是加强胰脏β细胞对葡萄糖刺激而释放胰岛素的作用；磺酰尿素类降血糖药物常用者为佑尔康(glibenclamide,商品名：euglucon)，克吡噻(glipizide,商品名：minidiab)及岱蜜克龙(gliclazide,商品名：diamicron)。然而，此类药物除了已发现的副作用，诸如皮疹、搔痒外，其施用对象亦有其局限，如有严重的肝、肾功能障碍者、孕妇及哺乳者、对磺酰尿素类药物出现严重过敏者均不宜使用这类降血糖药物。

(2)α-葡萄醣苷酶(α-Glucosidase)抑制剂：此类药物主要作用机转为抑制胰脏α-淀粉酶(α-amylase)及肠内α-葡萄醣苷酶(α-glucosidase)的活性，进而抑制碳水化合物在肠道的分解及吸收，此类药物能有效的降低饭后血糖及胰岛素浓度，但副作用为腹胀或偶而腹泻、腹痛及呕心。

(3)噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione)衍生物：此类药物主要作用为增加细胞核内过氧化小体增生活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-gamma)的活性，进而加强了胰岛素的作用，使细胞内葡萄糖转移蛋白GLUT2及GLUT4增加，将葡萄糖运送至细胞内利用。临床上常用者为曲格列酮(troglitazone,商品名：rezulin)、罗格列酮(rosiglitazone,商品名：avandia)、皮利酮(pioglitazone,商品名：actos)等；不过，值得注意的是曲格列酮(troglitazone)曾引起致命的肝毒性，因此，在英国上市(1997年10月)后二个月就被禁止使用。此外，噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione)衍生物也遭美国下令全面回收及禁用。

(4)双胍类(Biguanides)：双胍类药物为胍(guanidine)的衍生物，目前，双胍类降血糖药物多以metformin为主。此类药物本身不会刺激胰岛素的分泌，其控制血糖机转为以下五点：a.抑制食欲，因此优先使用于肥胖的第二型糖尿病人身上，使其进食减少、体重下降而改善胰岛素的外围作用、b.延缓肠道吸收葡萄糖、c.促进葡萄糖在肠道的厌氧性分解作用，进而增加葡萄糖在肠道中的利用，但可能会产生过多的乳酸盐(lactate)，易造成乳酸中毒、d.加强胰岛素在肝脏的作用，因此抑制肝脏的葡萄糖新生作用，减少葡萄糖从肝脏释出、e.促使贮藏于细胞内的葡萄糖转移蛋白GLUT4到细胞表面来参与输送工作，使细胞表面的葡萄糖转移蛋白量显著增加。此外，这类降血糖药物的副作用，如初服可能有肠胃道的不适，如厌食，恶心、呕吐或腹泻等，少数人可能出现皮疹，且长期使用后均可能会有失活的现象发生。

益生菌这个字原文为Probiotics，此字中文翻译还有其它名称例如原生物素、生菌素、生菌剂或原生保健性菌种。由Food and Agriculture Organization of theUnitedNations(FAO)将益生菌定义为活菌且含有大量足够的菌数并可以能够维持宿主健康。益生菌大多为乳酸菌，在肠道繁殖的代谢产生乳酸与醋酸及短链脂肪酸，并具有许多生理功能。与代谢症候群相关分别列述于下：一、预防腹泻与便秘，乳酸与醋酸可阻止外来侵入的病原菌及腐败菌的增生，可促进肠道蠕动，并帮助维持正常肠道运动，预防腹泻与便秘。二、调节血糖，研究发现乳酸菌能降低血糖，给予含有益生菌发酵乳的酸奶dahi对高果糖的大鼠，实验结果发现dahi组8周后血糖、醣化血色素、OGTT、胰岛素浓度显著下降。给予含有益生菌发酵乳对注射STZ所诱发糖尿病显著降低血糖。三、降低胆固醇及调节血脂，乳酸菌降胆固醇的可能机制有多种方式，一方面是为乳酸菌本身具有的胆盐水解酵素活性，使胆固醇在代谢过程中产生去结合型态的胆盐，若乳酸菌体对胆盐共轭活性的增加，使胆固醇与去结合型胆盐产生共同沉淀作用，从而有更多的胆固醇量被沉淀下来，达到降低胆固醇的效果。另一方面，乳酸菌细胞膜可键结胆固醇，甚至可将吸附的胆固醇进行同化作用，而代谢成细胞所需物质，其中以乳杆菌的降胆固醇的能力较佳。四、调节血压，在某些发酵乳品中发现含有降血压物质，这是非活菌型益生物质应用在非肠道相关疾病的最佳例子。L.helveticus在发酵过程中会分解乳蛋白而产生多种胜肽，其中VPP(Val-Pro-Pro)与IPP(Ile-Pro-Pro)可抑制血管收缩素转换酵素ACE的活性。当高血压患者饮用该酸乳后，其血压明显较饮用前降低。五、乳酸菌能利用SOD或高浓度的锰离子来处理氧自由基，或利用glutathione降低自由基及H2O2的毒性。六、益生菌可减少复杂的发炎过程中细胞素的表现，Mattar举例：益生菌可增强黏蛋白-2(MUC-2)黏液素基因在Caco-2的表现，以减少发炎反应，此外另有细胞实验发现Lactobacillus Plantarum10hk2可有显著降低促发炎因子，interleukin-1β(IL-1β)、interleukin-6(IL-6)及tumor necrosis factor-α(TNF-α)并且增加抗发炎因子IL-10。七、其中人体肠道特定的菌种如乳杆菌和双叉杆菌，能够透过摄取益生菌或提供营养物质来调节肠道中共生的菌群。

现今一些文献或专利中指出喂食糖尿病老鼠乳杆菌可有效的预防糖尿病以及降低血糖的浓度。但是目前已发表有关于乳酸菌改善糖尿病的文献或专利内容中，也仅局限于控制血糖值、体重、血中脂值以及胆固醇浓度。对于其它糖尿病所可能引发的并发症，如体内的发炎反应以及肝脏功能衰退，没有更进一步的改善功用。本案申请人的前案US7,901,926指出Lactobacillus reuteriGMNL-89具有抗发炎用途；US8,298,526以第一型糖尿病的造症基础下，发现Lactobacillus reuteri GMNL-89可有效改善第一型糖尿病的症状。然而目前对于以第二型糖尿病为造症基础的模式，益生菌是否能有效改善第二型糖尿病的症状，则尚未有文献报导是否有其功效。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其中该益生菌包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteriGMNL-89)的保藏编号为BCRC910340与CCTCC NO:M207154。

为达成前述发明目的，其中该罗伊氏乳杆菌GMNL-89组合物包含活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

为达成前述发明目的，其中该组合物为医药组合物、食品或其组分。其中该医药组合物可进一步包含药学上可接受的载剂。其中该医药组合物是呈可供口服投药的剂型。其中该剂型是选自于下列所构成的群组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊。

为达成前述发明目的，其中该食品可进一步包含至少一种选自于下列群组中的益生菌：乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)、双叉杆菌属物种(Bifidobacteriumsp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)及酵母菌(yeasts)。其中该食品可进一步包含可食性材料，该可食性材料包含水、流体乳品、牛奶、浓缩牛奶、酸奶、酸乳、冷冻优格、乳杆菌发酵饮料、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆奶、发酵豆奶、蔬果汁、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿食品、健康食品、动物饲料、中草药材或膳食补充品。

为达成前述发明目的，其中该第二型糖尿病并发症包含糖尿病性神经病变、肾疾病、发炎反应、心血管或胆固醇过高并发症、眼疾或肝脏疾病。

为达成前述发明目的，所述医药组合物包含每日剂量10⁷至10⁹个罗伊氏乳杆菌GMNL-89活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

为达成前述发明目的，所述食品包含10⁷至10⁹个罗伊氏乳杆菌GMNL-89活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

本发明的另一目的，是在于提供一种如前述的组合物用于制备抑制高血糖值、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高HOMA指标(Homeostasis modelassessment index)、高肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)或高细胞激素(interleukin-6，IL-6)的组合物的用途。

本发明的另一目的，是在于提供一种如前述的组合物用于制备提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麸胱甘肽过氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的组合物的用途。

本发明的另一目的，是在于提供一种抑制高血糖值、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)、高HOMA指标(Homeostasis model assessment index)、高肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)或高细胞激素(interleukin-6，IL-6)的组合物的方法，包含施予罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC NO:M207154。

本发明的另一目的，是在于提供一种提升高密度脂蛋白(high densitylipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麸胱甘肽过氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的组合物的用途方法，包含施予罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC NO:M207154。

本发明的另一目的，是在于提供一种用于抑制高血糖值、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)、高HOMA指标(Homeostasis model assessment index)、高肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)或高细胞激素(interleukin-6，IL-6)的组合物，包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC NO:M207154。

本发明的另一目的，是在于提供一种用于提升高密度脂蛋白(high densitylipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麸胱甘肽过氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的组合物，包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC NO:M207154。

本阶段研究将利用链佐霉素(STZ，10mg/kg)及烟碱酰胺(Nicotinamide，30mg/kg)做为第二型糖尿病的造症模式，配合高果糖高脂饮食所诱导出高血糖肥胖大鼠的动物模式来探讨饮食中补充GMNL-89活菌、GMNL-89热杀死菌、GMNL-89活菌培养基上清液对胰岛素抗性、血糖稳定及体重的影响。

1.探讨饮食中补充GMNL-89活菌、GMNL-89热杀死菌、GMNL-89活菌培养基上清液对本实验动物模式抗氧化酵素活性及发炎指数的影响。

2.探讨饮食中补充GMNL-89活菌、GMNL-89热杀死菌、GMNL-89活菌培养基上清液对本实验动物模式胰岛素抗性及血糖的影响。

3.探讨饮食中补充GMNL-89活菌、GMNL-89热杀死菌、GMNL-89活菌培养基上清液对本实验动物模式下血液中LDL、TG、TC、HDL的影响。

4.探讨饮食中补充GMNL-89活菌、GMNL-89热杀死菌、GMNL-89活菌培养基上清液对本实验动物模式能量代谢影响并探讨其可能机制。

本发明所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)，其保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：武汉大学），保藏日期为2007年11月19日，保藏编号为：CCTCC NO:M207154；还保藏于新竹食品工工业展研究所生物资源保存及研究中心，保藏日期为2006年11月14日、保藏编号为BCRC910340。

本发明所述用于治疗第二型糖尿病的罗伊氏乳杆菌GMNL-89组合物及其用途具有以下优点和有益效果：本发明菌株在第二型糖尿病动物模式中，具有抗氧化酵素活性、抗发炎、降血糖、降三酸甘油酯、降总胆固醇、降低密度脂蛋白、提升高密度脂蛋白、提升胰岛素利用率等功效。

附图说明

图1为喂食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高剂量和上清液低以及高剂量10周，各组大鼠饲养期间内空腹血糖记录值。*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05；

图2为喂食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高剂量和上清液低以及高剂量10周，各组大鼠饲养期间内空腹胰岛素记录值。*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05；

图3为喂食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高剂量和上清液低以及高剂量6周后，对第二型糖尿病大鼠ΔAUC数据分析；

图4为喂食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高剂量和上清液低以及高剂量8周后，对第二型糖尿病大鼠葡萄糖耐受性的影响。A：各组大鼠OGTT数据分析；B：各组大鼠0-180分钟胰岛素的变化数据分析。*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05；

图5为喂食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高剂量和上清液低以及高剂量8周后，对第二型糖尿病大鼠ΔAUC数据分析。

具体实施方式

本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。

本发明是益生菌用于制备治疗第二型糖尿病的益生菌组合物的用途，其中该益生菌包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为BCRC910340与CCTCC M207154的活菌、死菌及其培养物上清液至少一者，及药学上可接受的载剂。另，本发明亦关于利用该组合物或该乳杆菌用以治疗第二型糖尿病的新颖用途。

其中该乳杆菌分离株亦包含其继代培养的后代，或突变株，但仍具有与本发明所述的菌种特性、基因体(genomic)、或用途(用于治疗第二型糖尿病)相同者。

本文所述组合物是可包含，但不限于：食品、饮品、健康食品、动物饮水添加物、动物饲料添加物、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物等适用本发明的应用形式。

术语“治疗”、“治疗中”及其类术语是指延缓、改善、减少或逆转目前正折磨着患者的该病症或该病症相关的任何症状的方法以及预防该病症或其任何正出现的症状的方法。

术语"药学上可接受"是指物质或组合物必须与调配物的其它成份兼容，且对患者无害。

术语“糖尿病相关并发症”，是包含但不限于：糖尿病性神经病变(包含但不限于膀胱无力、腹胀、便秘、泻肚、阳萎、对冷热感觉差)、肾疾病(包含但不限于丝球体性肾炎、肾小球硬化症、肾病征候群、高血压性肾硬化、肾疾病末期、尿毒症)、发炎反应、心血管或胆固醇过高并发症(包含但不限于脑中风、心肌梗塞、冠状动脉栓塞、心绞痛、心衰竭、心律不稳、末梢血液循环不良、足部感染等)、眼疾(视网膜病变、白内障、青光眼、弱视(视力衰弱))、肝脏疾病(包含但不限于肝脏纤维化、脂肪肝、非酒精性脂肪肝、及肝硬化)。

本发明的组合物是可利用本领域技术人员所详知的技术，将上述的乳杆菌分离株，与药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable vehicle)，制备成适用本发明组合物的剂型。其中该剂型包含但不限于：溶液(solution)、乳剂(emulsion)、悬浮液(suspension)、粉末(powder)、锭剂(tablet)、丸剂(pill)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、口嚼胶(chewing gum)、胶囊(slurry)以及其它类似或适用本发明的剂型。

其中该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、表面活性剂(surfactant)，及其它类似或适用本发明的载剂。

上述组合物中，亦可视需要适宜地添加一或多种以上制剂领域内通常使用的溶解补助剂、缓冲剂、保存剂、着色剂、香料、风味剂等。

另一较佳实施例中，本发明所提供的前述组合物，可进一步添加可食性材料，以制备为一种食品产品或保健产品。其中该可食性材料包含，但不限于：水(water)、流体乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、浓缩牛奶(concentratedmilk)；发酵乳品(fermented milk)，诸如酸奶(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷冻优格(frozen yogurt)、乳杆菌发酵饮料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；奶酪(cream cheeses)；干酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；发酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruitjuices)；果汁(juices)；运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jellys)；糖果(candies)；婴儿食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；动物饲料(animal feeds)；中草药材(Chinese herbals)；膳食补充品(dietary supplements)等。

此外，本发明所发现的新颖菌种，亦可与其它熟知菌种一并被包含于组成物中。

其中该组合物，可进一步包含至少一种选自于下列群组中的熟知益生菌：乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、双叉杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)、酵母菌(yeasts)。

其中该熟知乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)包含但不限于：乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、双岐乳杆菌(lactobacillus bifidus)、奶酪乳杆菌(lactobacillus casei)、副奶酪乳杆菌副奶酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、或其组合。

其中该熟知链球菌属物种(Streptococcus sp.)包含但不限于：乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、奶酪链球菌(Streptococcus cremoris)、或其组合。

其中该熟知双叉杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)包含但不限于：短型双叉杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双叉杆菌(Bifidobacterium lactis)、长型双叉杆菌(Bifidobacterium longum)、双叉型双叉杆菌(Bifidobacterium bifidum)、或其组合。

其中该熟知酵母菌(yeasts)包含但不限于：啤酒酵母菌(Saccharomycescereviseae)、乳酒假丝酵母菌(Candida kefyr)、弗罗棱酵母菌(Saccharomycesflorentinus)、或其组合。

另，本发明亦提供前述乳杆菌用于制备治疗第二型糖尿病的组合物的方法或用途。

本发明所提供的组合物及其用于治疗第二型糖尿病的方法，其投药路径，可视需求适宜调整，并未特别限定，较佳者为经口投予适用剂型。

本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用的药物、生物材料皆市售易于取得，下列仅为示例可取得的管道。

本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。

实验材料与方法

A试验动物分组，饲养与照料：

用自乐斯科公司购得九周龄雄性SD大鼠(180±20克)，随机分成七组。组数与只数部分(共50只)分别列于如下：

1.一般对照组(normal group)：n=5

2.糖尿病组(diabetes group)：n=5

3.糖尿病+死菌组：n=8

4.糖尿病+低剂量活菌组：n=8

5.糖尿病+高剂量活菌组：n=8

6.糖尿病+低剂量活菌培养基上清液组：n=8

7.糖尿病+高剂量活菌培养基上清液组：n=8

B喂食剂量的计算：

(1)摄取受试样品与诱发高血糖同时进行；

(2)各实验组别：活菌组、死菌组、活菌上清液组等，从入库一周后，每日以管喂方式，分别投予不同浓度的乳酸菌产品至死亡时停止。死菌的制备是以121℃的高压灭菌府灭菌15分钟后，将菌液冻干成菌粉。活菌上清液制备是将菌液离心4000rpm/20分钟后，取上清液通过0.22μm孔径的滤膜央残存的乳酸菌过滤。使用蛋白质浓度检测试剂套组侦测上清液中的蛋白质浓度后，在将上清液调整成含蛋白质浓度为100μg/ml以及20μg/ml。

(3)当大鼠达到目标血糖值后即进行所需的检测(Flow chart有加注目标血糖值为200mg/dL)

(4)正常组及糖尿病组则以同体积不含乳酸菌的溶剂取代。

各组喂食剂量如下：

1.一般对照组：

2.糖尿病组：

3.糖尿病+死菌组：每日以管喂方式1.6*10⁸CFU(0.04g)GMNL-89死菌/天

4.糖尿病+低剂量活菌组：每日以管喂方式

1.6*10⁷CFU(0.004g)GMNL-89活菌/天

5.糖尿病+高剂量活菌组：每日以管喂方式1.6*10⁸CFU(0.04g)GMNL-89活菌/天

6.糖尿病+低剂量活菌培养基上清液组：

剂量20μg总蛋白(total protein)/mL，每天总喂食量为1mL/只

7.糖尿病+高剂量活菌培养基上清液组：

剂量100μg总蛋白(total protein)/mL，每天总喂食量为1mL/只

C饲料配置与投予方法

每日每只大鼠分别给予饲料30公克，饲料配方详述如下：表1、饮食配方，购自Harlan公司

表1饮食配方

D动物第二型糖尿病造症模式

分别分为一般对照组及诱发糖尿病组别，诱发糖尿病组别饲养期间分别给予高糖高脂饮食及实验期间隔日给予腹腔注射低剂量的链佐霉素(STZ，10mg/kg)及烟碱酰胺(Nicotinamide，30mg/kg)。在整个实验进行期间，每两天给予低剂量的链佐霉素(STZ，10mg/kg)及烟碱酰胺(Nicotinamide，30mg/kg)。当实验期间大鼠血糖值≥180mg/dL则视为造症成功。

E口服葡萄糖耐受试验(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)

以口服(1g/kg)方式给予实验动物葡萄糖，然后分别在给糖前及给糖后的30、60、90、120和180分钟采取血液样品，以Rat Glucose Assay Kit测定血糖值。

F血液生化值分析：

抽取静脉血，抽血所得的血液立即以离心机，于3000rpm(1630xg)离心20分钟，离心后取上层血浆液做以下生化分析：

1.糖化血色素(HbA1c)：

加入sample100μL，37℃下放置2小时。每孔加入detection reagent A100μL(临用前配制)，37℃下放置1小时；再加detection reagent B100μL(临用前配制)，37℃下放置1小时；之后加入Substrate Solution90μL，37℃避光显色，反应15-30分钟。最后加入Stop Solution50μL终止反应，利用分光光度计在450nm波长下测定其吸光值，最后带入标准曲线公式换算出大鼠血液中HbA1c含量。

2.葡萄糖(Glucose)的测定

抽血后所获得的血浆，取20μL与葡萄糖以Rat Glucose Assay Kit测定血糖值。试液3mL，在37℃作用5分钟，利用分光光度计在500nm波长下测定其吸光值，换算出血浆中葡萄糖含量。

3.胰岛素的测定

取血液样品0.5mL，使用Rat Insulin Assay Kit测其吸光值，再依标准曲线对照浓度即为血液样品的浓度。

4.三酸甘油酯(TG)的测定

抽血后所获得的血浆，取10μL与三酸甘油酯Enzymatic kits试液1mL，在37℃作用5分钟，利用分光光度计在546nm波长下测定其吸光值，换算出血浆中三酸甘油酯含量，其换算公式如下：

Plasma Triglyceride=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es:血液样品的吸光值

Estd:标准试剂吸光值

Blank:未加样品的kits吸光值

200:标准试剂浓度200mg/dL

5.总胆固醇(TC)的测定

抽血后所获得的血浆，取10μL与胆固醇Enzymatic kits试液1mL，在37℃作用5分钟，利用分光光度计在500nm波长下测定其吸光值，换算出血浆中三酸甘油酯含量，其换算公式如下：

Plasma胆固醇=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es:血液样品的吸光值

Estd:标准试剂吸光值

Blank:未加样品的kits吸光值

200:标准试剂浓度200mg/dL

6.高密度脂蛋白(HDL)的测定

抽血后所获得的血浆，取10μL与高密度脂蛋白Enzymatic kits试液1mL，在37℃作用5分钟，利用分光光度计在500nm波长下测定其吸光值，换算出血浆中高密度脂蛋白含量，其换算公式如下：

Plasma高密度脂蛋白=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es:血液样品的吸光值

Estd:标准试剂吸光值

Blank:未加样品的kits吸光值

200:标准试剂浓度200mg/dL

7.低密度脂蛋白(LDL)的测定

抽血后所获得的血浆，取50μL与低密度脂蛋白Enzymatic kits试液1mL，在37℃作用5分钟，利用分光光度计在500nm波长下测定其吸光值，换算出血浆中低密度脂蛋白含量，其换算公式如下：

LDL-C=TC-(Asample×1265)

G.细胞激素分泌实验

在喂食实验物质连续八周后，采集大鼠血清，以酵素连结免疫分析法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA)测得细胞激素分泌量，比较各剂量组与对照组有无差异性存在。加入100μL稀释过的抓取抗体(Capture antibody)至96孔盘中，并放置4℃冰箱中静置隔夜。隔日吸出上清液，利用清洗溶液(Washsolution)清洗四次，清洗后加入200μL阻断液(Blocking solution)至每个孔，在室温下静置2小时后，吸出上清液，利用清洗溶液清洗四次。每孔加入稀释后的标准液或待测血清样品100μL，在室温下作用2小时，吸出上清液，利用清洗溶液清洗四次，加入稀释好的100μL HRP侦测抗体(detection antibody)，于室温下静置30分钟，吸出上清液，利用清洗溶液清洗五次，加入100μL酵素呈色溶液(Enzyme substrate solution)，避光放置室温30分钟后加入100μL终止溶液(Stopsolution)，利用波长450nm测其吸光值。

H.超氧歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的测定

依1975年Beutler所提出的方法，此酵素测定原理是利用黄嘌呤(xanthine)受黄嘌呤氧化酶(XOD)的催化下产生尿酸(uric acid)及超氧阴离子(superoxideradical)再与4-iodophenyl-3-(-4-nitrophenol)-5-phenyl tetrazolium(I.N.T)反应，形成红色的甲臜(formazan dye)。而酵素的活性则通过超氧歧化酶在此反应中所能清除超氧阴离子的多寡来评估。于37℃下；在试管中分别加入0.05mL血浆及1.70mL混合物质(mixed substrate)(0.05mmol/L,0.025mmol/L I.N.T)0.25mL黄嘌呤氧化酶(80U/L)混合均匀；在505nm下，测3分钟的吸光值变化，并与标准品对照。

I.丙二醛(MDA，Malondialdehyde)的测定

丙二醛含量分析采用Yagi于1984年所提出的方法，并参考Prasad等人于1992年所改良的方法，综合如下：脂质过氧化的产物丙二醛，其在酸性环境下可与二分子的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)缩合成一红色物质硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substances TBARS)，利用荧光光度计在激发光(excitation)515nm及发散光(emission)553nm之下可测得丙二醛的浓度。而三羟甲基丙烷(1,1,3,3-tetra-methoxy-propane，TMP)在酸中会水解产生丙二醛，故以TMP做为标准品，计算组织中丙二醛含量，作为脂质过氧化指标。将1mL血浆加入1mL10%三氯乙酸(TCA)震荡均匀，以1500xg离心10分钟，取1mL上层液或各浓度标准溶液，加入1mL TBA溶液及0.1mL二丁基羟基甲苯(BHT)溶液震荡均匀，置于95℃水浴60分钟，冷却后再加入2mL丁醇(butanol)震荡均匀，以1500xg离心十分钟。取上清液，以荧光光度计测定激发光515nm及发散光553nm吸光值。

J.麸胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的测定

依Paglia等人于1967年所提出，并且Lawrence等人于1976年所修饰的实验方法分析GSH-Px的活性。其原理是在试管中的氢过氧化异丙苯(cumenehydroperoxide)存在下，GSH-Px会催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)氧化成氧化谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，而GSSG会由谷胱甘肽还原酶(Glutathionereductase，GR)再还原成GSH，且会消耗掉NADPH，所以在波长340nm下，测NADPH的消耗量，由吸光度的减少，及可求得GSH-Px的活性。于37℃下；在试管中分别加入0.05mL血浆及0.10mL氢过氧化异丙苯混合均匀，在340nm下，测其吸光值变化。

实施例1

动物造症模式的确证

各组别大鼠于饲养期第7周前其空腹血糖值在第二型糖尿病造症老鼠组别间并无差异。但从第八周开始，糖尿病组、喂食高/低剂量活菌组别及高剂量上清液组别其血糖开始上升，然而在喂食死菌，高/低剂量活菌组别及高剂量上清液组别组别其空腹血糖上升趋势呈现较缓和现象。喂食上清液低剂量组别于八周饲养期间发现对本实验利用STZ+烟碱酰胺诱导第二型糖尿病的动物模式具有最佳的保护效果，本实验结果于动物饲养十周后亦呈现相同的趋势。空腹胰岛素值则从第四周开始，糖尿病组的胰岛素值便开始上升并呈现胰岛素代偿现象，这表示第四周开始，糖尿病组别的老鼠已经有胰岛素利用不良的情况发生。然而有喂食各种乳酸菌成分老鼠的空腹胰岛素值仍然没有上升，此现象表示有喂食各种乳酸菌成份的老鼠，其胰岛素的分泌与醣类的利用情形仍然处在正常的范围之内。由图1及图2的结果得知本动物模式已于饲养六周后动物即出现胰岛素抗性及于八周后出现高血糖的现象，但有添加各种乳酸菌成分于饮食中的组别则呈现较缓和的血糖上升现象。空腹血糖值(图1)、胰岛素值(图2)无论是死菌组、低活菌组、高活菌组、低上清液组、高上清液组，相较于糖尿病组皆具有显著差异。

实施例2

每日饮食摄取纪录

饲养老鼠期间分别纪录了老鼠的饮食摄取量，并取其平均值。因为老鼠摄取量的差异可能会导致对体重之影响，并影响实验结果，因此由表2结果可以观察出各组老鼠的饮食摄取量分别与糖尿病组别相比，并没无统计上差异发生。因此我们可以推测老鼠的热量摄取应是差异不大且不会影响实验结果。

表2、各组别老鼠饲养期间平均摄食量(g)

实施例3

体重及肝肾重量

除了每日的饮食摄取纪录，我们也记录了其每周的体重变化，由表3中可看到结果可以观察出各组老鼠的饮食摄取量与糖尿病组别相比，并无统计上的差异。在第十周时，牺牲老鼠试验并取其肝脏和肾脏并测其重量，结果发现各组老鼠的饮食摄取量分别与糖尿病组别相比，并无统计上显著差异发生(表4)。

表3、各组别老鼠饲养期间体重变化(g)

表4、各组别老鼠肝脏、肾脏器官重量(g)

实施例4

血清生化值分析

在表5结果中，我们可以看到各喂食乳酸菌组别与糖尿病鼠相比其血清生化值总胆固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)和糖化血色素(HbA1c)皆有显著降低。再以不同组别来看，其TC的变化为死菌>活菌低剂量>活菌高剂量组>上清液高剂量组>上清液低剂量组。而三酸甘油酯也有相同的趋势变化，因此可证明，喂食乳酸菌对于将低三酸甘油酯和总胆固醇具有功效性，并且在不同的浓度下有不同的差异性。而对于血糖的控制则有不同的影响，在糖化血色素中其变化为死菌>活菌低剂量>上清液低剂量组>活菌高剂量组>上清液高剂量组。虽然乳酸菌皆可降低血中的总胆固醇、三酸甘油酯和HbA1，但其各组乳酸菌的影响有不同的变化。再进一步观察可发现，上清液高剂量组虽然在三酸甘油酯、总胆固醇和糖化血色素中的影响较小，但却是对各血清生化值皆有显著性降低的功效。HOMA指标(Homeostasis model assessment)是一个评估胰岛素阻抗的指标，其值越高则代表胰岛素利用率越差。从第7周HOMA指标可以看到上清液低剂量组的HOMA指标最低，且其结果以活菌高剂量组及上清液高剂量组最佳。

表5、各组大鼠饲养八周后血清生化值

1.HOMA-IR=禁食血浆胰岛素值(mmol/L)x禁食血浆葡萄糖浓度(ug/L)/22.5

2.*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05。

实施例5

口服葡萄糖耐受试验（Oral Glucose Tolerance Test，OGTT）及血糖变化曲线下面积(ΔAUC)

在饲养第8周后执行一次口服葡萄糖耐受性试验。在第8周的OGTT结果则可以看出上清液低剂量组>上清液高剂量组以及活菌高剂量组>活菌低剂量组>死菌(图4)，胰岛素值(图4B)无论是死菌组、低活菌组、高活菌组、低上清液组、高上清液组，相较于糖尿病组皆具有显著差异。而在ΔAUC方面也有相同的结果发现(图3及图5)。

实施例6

细胞发炎激素的分泌

在第10周死亡之后，取其血液并评估细胞发炎激素的分泌状况，由表6中可以观察出喂食乳酸菌之后的各组老鼠，其发炎指标有明显的降低。尤其以上清液低剂量组最为明显，因此可推估喂食乳酸菌有助于降低发炎反应的发生。

表6、各组别老鼠的抗氧化酵素活性

*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05。

实施例7

抗氧化酵素活性

在第10周死亡之后，取其血液并评估抗氧化酵素活性状况，由表7的结果可以看出喂食各种乳酸菌成分对老鼠的抗氧化酵素活性有不同的影响，就以喂食不同乳酸菌组别和糖尿病的老鼠相比，其SOD及GPx抗氧化酵素的活性显著的增加，而TBARs则显著的减少。而在给予各种乳酸菌之后，其体内的氧化压力可能因SOD及GPx抗氧化酵素的活性显著的增加而下降。

表7、各组别老鼠的发炎激素的分泌

*表示和糖尿病组别相比，有显著差异且P<0.05。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述益生菌包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的保藏编号为CCTCC NO:M207154。

2.如权利要求1所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌GMNL-89组合物包含活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

3.如权利要求1所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述组合物为医药组合物、食品或其组分。

4.如权利要求3所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述医药组合物还包含药学上可接受的载剂。

5.如权利要求3所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述医药组合物是供口服投药的剂型。

6.如权利要求5所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述剂型是选自于下列所构成的群组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊。

7.如权利要求3所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述食品还包含至少一种选自于下列群组中的益生菌：乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)、双叉杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)及酵母菌(yeasts)。

8.如权利要求3所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述食品还包含可食性材料，所述可食性材料包含水、流体乳品、牛奶、浓缩牛奶、酸奶、酸乳、冷冻优格、乳杆菌发酵饮料、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆奶、发酵豆奶、蔬果汁、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿食品、健康食品、动物饲料、中草药材或膳食补充品。

9.如权利要求1所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述第二型糖尿病并发症包含糖尿病性神经病变、肾疾病、发炎反应、心血管或胆固醇过高并发症、眼疾或肝脏疾病。

10.如权利要求3-6任一项所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述医药组合物包含每日剂量10⁷至10⁹个罗伊氏乳杆菌GMNL-89活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

11.如权利要求7或8所述的益生菌用于制备治疗第二型糖尿病症状及其并发症的组合物的用途，其特征在于，所述食品包含10⁷至10⁹个罗伊氏乳杆菌GMNL-89活菌、死菌及其培养物上清液至少一种。

12.一种益生菌用于制备抑制高血糖值、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高HOMA指标(Homeostasis model assessment index)、高肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factorα，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)或高细胞激素(interleukin-6，IL-6)的组合物的用途，包含权利要求1-11中任一项的组合物。

13.一种益生菌用于制备提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麸胱甘肽过氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的组合物的用途，包含权利要求1-11中任一项的组合物。