TWI587865B

TWI587865B - 用於治療第二型糖尿病的羅伊氏乳桿菌ｇｍｎｌ－８９組合物及其用途

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Publication number: TWI587865B
Application number: TW103107801A
Authority: TW
Inventors: 黃惠宇; 陳奕興; 謝豐欽
Original assignee: 景岳生物科技股份有限公司
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2017-06-21
Also published as: TW201534312A

Description

用於治療第二型糖尿病的羅伊氏乳桿菌GMNL-89組合物及其用途

本發明係關於乳桿菌分離株之新用途，尤其是治療第二型糖尿病之技術領域。

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一種多病因性的代謝疾病，是由於胰島素分泌或作用產生缺陷而引起廣泛性代謝障礙，所引起的疾病。糖尿病係以持續性慢性高血糖為主要特徵之疾病，且亦會造成體內蛋白質、脂肪、水、電解質等代謝失調。

臨床上將糖尿病主要分成二類：

第一型：胰島素依賴型糖尿病(Insulin-dependent diabetic mellitus,IDDM)，一般發作年齡於30歲以下者居多，因此過去曾稱為「青幼年發病型糖尿病」，事實上任何年齡皆可能發生。第一型糖尿病是一種自身免疫系統對胰臟蘭氏小島(Islet of Langerhans)之β細胞進行攻擊破壞的自體免疫疾病(Autoimmune Disease)。原因與個人的基因遺傳、環境因素中的病毒感染、或毒性物質破壞胰臟的β細胞、及自體免疫形成抗β細胞之抗體、及細胞免疫作用攻擊β細胞有關。最後導致患者的胰臟無法正常分泌胰島素，而極易發生酮酸血症，因此需注射胰島素來治療。

第二型：非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin dependent diabetic mellitus,NIDDM)，大多發生於40歲以後，患者多為體型較肥胖者，過去稱為「成年型糖尿病」，但亦可能發生於年輕人，以家族型發病較為常見，此類型糖尿病在臺灣占糖尿病總人口數的95%以上。此類型糖尿病是由於胰島素分泌缺陷，及胰島素抗阻性(insulin resistance)所引起的；雖有部分患者胰島素的分泌減少，但大多數患者分泌胰島素的能力尚可，因此，大多靠飲食控制及口服降血糖藥物控制血糖，而不需立即注射胰島素治療。此外，患者大多會伴隨胰島素抗阻性(insulin resistance)的症狀。胰島素抗阻性的形成主要是因胰臟蘭氏小島的β細胞過度地分泌胰島素(hyperinsulinamia)，造成骨骼肌、脂肪組織及肝臟等周邊組織對胰島素的敏感性(insulin sensitivity)降低。因而減低了組織對葡萄糖的利用率，而造成高血糖的現象。此類型病程進展緩慢，因此，早期並無典型糖尿病症狀，不易察覺。但常伴隨糖尿病性大血管(如心肌梗塞、腦中風)、小血管(如腎臟、眼網膜及神經病變)等慢性併發症。

此外，在第二型糖尿病病患身上經常伴隨著脂質代謝異常的情況，如血漿中三酸甘油酯(triglyceride,TG)濃度上升、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度下降以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度上升。這一些症狀會導致第二型糖尿病患者心血管疾病的風險。另，根據研究指出，嚴重糖尿病患者的肝臟血脂值清除能力會下降。當肝臟中三酸甘油脂以及低密度脂蛋白膽固醇不斷的累積後，肝細胞便會發生病變形成非酒精性脂肪肝進而嚴重影響肝功能。

目前用於治療糖尿病的方式，除可施予胰島素外，另分為非藥物治療與藥物治療兩種。在非藥物治療方面，主要是藉飲食調控和運動的方式來加以治療。而在藥物治療方面，主要的目的是使不足的胰島素上升、調降進食後的高血糖和改善胰島素抗阻性等。目前用於治療糖尿病的藥物可分為：

(1)磺醯尿素類(Sulfonylurea)：此類藥物主要機轉為促進胰臟胰島素之分泌，特別是加強胰臟β細胞對葡萄糖刺激而釋放胰島素之作用；磺醯尿素類降血糖藥物常用者為佑爾康(glibenclamide，商品名：euglucon)，克吡噻(glipizide，商品名：minidiab)及岱蜜克龍(gliclazide，商品名：diamicron)。然而，此類藥物除了已發現之副作用，諸如皮疹、搔癢外，其施用對象亦有其侷限，如有嚴重之肝、腎功能障礙者、孕婦及哺乳者、對磺醯尿素類藥物出現嚴重過敏者均不宜使用這類降血糖藥物。

(2)α-葡萄醣苷酶(α-Glucosidase)抑制劑：此類藥物主要作用機轉為抑制胰臟α-澱粉酶(α-amylase)及腸內α-葡萄醣苷酶(α-glucosidase)之活性，進而抑制碳水化合物在腸道之分解及吸收，此類藥物能有效的降低飯後血糖及胰島素濃度，但副作用為腹脹或偶而腹瀉、腹痛及嘔心。

(3)噻唑烷二酮類(Thiazolidinedione)衍生物：此類藥物主要作用為增加細胞核內過氧化小體增生活化受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-gamma)之活性，進而加強了胰島素的作用，使細胞內葡萄糖轉移蛋白GLUT2及GLUT4增加，將葡萄糖運送至細胞內利用。臨床上常用者為曲格列酮(troglitazone，商品名：rezulin)、羅格列酮(rosiglitazone，商品名：avandia)、皮利酮(pioglitazone，商品名：actos)等；不過，值得注意的是曲格列酮(troglitazone)曾引起致命的肝毒性，因此，在英國上市(1997年10月)後二個月就被禁止使用。此外，噻唑烷二酮類(Thiazolidinedione)衍生物也遭美國下令全面回收及禁用。

(4)雙胍類(Biguanides)：雙胍類藥物為胍(guanidine)之衍生物，目前，雙胍類降血糖藥物多以metformin為主。此類藥物本身不會刺激胰島素之分泌，其控制血糖機轉為以下五點：a.抑制食慾，因此優先使用於肥胖之第二型糖尿病人身上，使其進食減少、體重下降而改善胰島素之週邊作用、b.延緩腸道吸收葡萄糖、c.促進葡萄糖在腸道之厭氧性分解作用，進而增加葡萄糖在腸道中之利用，但可能會產生過多之乳酸鹽(lactate)，易造成乳酸中毒、d.加強胰島素在肝臟之作用，因此抑制肝臟之葡萄糖新生作用，減少葡萄糖從肝臟釋出、e.促使貯藏於細胞內的葡萄糖轉移蛋白GLUT4到細胞表面來參與輸送工作，使細胞表面之葡萄糖轉移蛋白量顯著增加。此外，這類降血糖藥物的副作用，如初服可能有腸胃道的不適，如厭食，噁心、嘔吐或腹瀉等，少數人可能出現皮疹，且長期使用後均可能會有失活的現象發生。

益生菌這個字原文為Probiotics，此字中文翻譯還有其他名稱例如原生物素、生菌素、生菌劑或原生保健性菌種。由Food and Agriculture Organization of the UnitedNations(FAO)將益生菌定義為活菌且含有大量足夠的菌數並可以能夠維持宿主健康。益生菌大多為乳酸菌，在腸道繁殖的代謝產生乳酸與醋酸及短鏈脂肪酸，並具有許多生理功能。與代謝症候群相關分別列述於下：一、預防腹瀉與便秘，乳酸與醋酸可阻止外來侵入的病原菌及腐敗菌的增生，可促進腸道蠕動，並幫助維持正常腸道運動，預防腹瀉與便秘。二、調節血糖，研究發現乳酸菌能降低血糖，給予含有益生菌發酵乳的酸奶dahi對高果糖的大鼠，實驗結果發現dahi組8周後血糖、醣化血色素、OGTT、胰島素濃度顯著下降。給予含有益生菌發酵乳對注射STZ所誘發糖尿病顯著降低血糖。三、降低膽固醇及調節血脂，乳酸菌降膽固醇的可能機制有多種方式，一方面是為乳酸菌本身具有的膽鹽水解酵素活性，使膽固醇在代謝過程中產生去結合型態的膽鹽，若乳酸菌體對膽鹽共軛活性的增加，使膽固醇與去結合型膽鹽產生共同沉澱作用，從而有更多的膽固醇量被沉澱下來，達到降低膽固醇的效果。另一方面，乳酸菌細胞膜可鍵結膽固醇，甚至可將吸附的膽固醇進行同化作用，而代謝成細胞所需物質，其中以乳桿菌的降膽固醇的能力較佳。四、調節血壓，在某些發酵乳品中發現含有降血壓物質，這是非活菌型益生物質應用在非腸道相關疾病的最佳例子。L.helveticus在發酵過程中會分解乳蛋白而產生多種胜肽，其中VPP(Val-Pro-Pro)與IPP(Ile-Pro-Pro)可抑制血管收縮素轉換酵素ACE的活性。當高血壓患者飲用該酸乳後，其血壓明顯較飲用前降低。五、乳酸菌能藉SOD或高濃度的錳離子來處理氧自由基，或藉glutathione降低自由基及H₂O₂的毒性。六、益生菌可減少複雜的發炎過程中細胞素的表現，Mattar舉例：益生菌可增強黏蛋白-2(MUC-2)黏液素基因在Caco-2的表現，以減少發炎反應，此外另有細胞實驗發現Lactobacillus Plantarum 10hk2可有顯著降低促發炎因子，interleukin-1β(IL-1β)、interleukin-6(IL-6)及tumor necrosis factor-α(TNF-α)並且增加抗發炎因子IL-10。七、其中人體腸道特定的菌種如乳桿菌和雙叉桿菌，能夠透過攝取益生菌或提供營養物質來調節腸道中共生的菌群。

現今一些文獻或專利中指出餵食糖尿病老鼠乳桿菌可有效的預防糖尿病以及降低血糖的濃度。但是目前已發表有關於乳酸菌改善糖尿病的文獻或專利內容中，也僅局限於控制血糖值、體重、血中脂值以及膽固醇濃度。對於其他糖尿病所可能引發之併發症，如體內的發炎反應以及肝臟功能衰退，沒有更進一步的改善功用。本案申請人之前案 US7,901,926指出Lactobacillus reuteri GMNL-89具有抗發炎用途；US8,298,526以第一型糖尿病的造症基礎下，發現Lactobacillus reuteri GMNL-89可有效改善第一型糖尿病的症狀。然而目前對於以第二型糖尿病為造症基礎的模式，益生菌是否能有效改善第二型糖尿病的症狀，則尚未有文獻報導是否有其功效。

本發明之目的即在於提供一種益生菌用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該益生菌包含羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154。

為達成前述發明目的，其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89組合物包含活菌、死菌及其培養物上清液至少一者。

為達成前述發明目的，其中該組合物為醫藥組合物、食品或其組分。其中該醫藥組合物可進一步包含藥學上可接受之載劑。其中該醫藥組合物是呈一可供口服投藥的劑型。其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。

為達成前述發明目的，其中該食品可進一步包含至少一種選自於下列群組中的益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)及酵母菌(yeasts)。其中該食品可進一步包含一可食性材料，該可食性材料包含水、流體乳品、牛奶、濃縮牛奶、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥材或膳食補充品。

為達成前述發明目的，其中該第二型糖尿病併發症包含糖尿病性神經病變、腎疾病、發炎反應、心血管或膽固醇過高併發症、眼疾或肝臟疾病。

為達成前述發明目的，所述醫藥組合物包含每日劑量10⁷至10⁹個羅伊氏乳桿菌GMNL-89活菌、死菌及其培養物上清液至少一者。

為達成前述發明目的，所述食品包含10⁷至10⁹個羅伊氏乳桿菌GMNL-89活菌、死菌及其培養物上清液至少一者。

本發明之另一目的，係在於提供一種如前述的組合物用於製備抑制高血糖值、高糖化血紅素比例、高總膽固醇濃度、高肝臟三酸甘油脂質濃度、高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高HOMA指標(Homeostasis model assessment index)、高腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1 β，IL-1β)或高細胞激素(interleukin-6，IL-6)之組合物的用途。

本發明之另一目的，係在於提供一種如前述的組合物用於製備提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麩胱甘肽過氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)之組合物的用途。

本發明之另一目的，係在於提供一種抑制高血糖值、高糖化血紅素比例、高總膽固醇濃度、高肝臟三酸甘油脂質濃度、高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高HOMA指標(Homeostasis model assessment index)、高腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1 β，IL-1β)或高細胞激素(interleukin-6，IL-6)之組合物的方法，包含施予一羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154。

本發明之另一目的，係在於提供一種提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麩胱甘肽過氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)之組合物的用途方法，包含施予一羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154。

本發明之另一目的，係在於提供一種用於抑制高血糖值、高糖化血紅素比例、高總膽固醇濃度、高肝臟三酸甘油脂質濃度、高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高HOMA指標(Homeostasis model assessment index)、高腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、高人白介素1β(Interleukin-1 β，IL-1β)或高細胞激素(interleukin-6，IL-6)的組合物，包含羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154。

本發明之另一目的，係在於提供一種用於提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、超氧歧化酶活性(Superoxide dismutase，SOD)或麩胱甘肽過氧化酶活性(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的組合物，包含一羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為CCTCC M 207154。

本階段研究將利用鏈佐黴素(STZ，10mg/kg)及菸鹼醯胺(Nicotinamide，30mg/kg)做為第二型糖尿病的造症模式，配合高果糖高脂飲食所誘導出高血糖肥胖大鼠之動物模式來探討飲食中補充GMNL-89活菌、GMNL-89熱殺死菌、GMNL-89活菌培養基上清液對胰島素抗性、血糖穩定及體重的影響。1.探討飲食中補充GMNL-89活菌、GMNL-89熱殺死菌、GMNL-89活菌培養基上清液對本實驗動物模式抗氧化酵素活性及發炎指數的影響。2.探討飲食中補充GMNL-89活菌、GMNL-89熱殺死菌、GMNL-89活菌培養基上清液對本實驗動物模式胰島素抗性及血糖的影響。3.探討飲食中補充GMNL-89活菌、GMNL-89熱殺死菌、GMNL-89活菌培養基上清液對本實驗動物模式下血液中LDL、TG、TC、HDL的影響。4.探討飲食中補充GMNL-89活菌、GMNL-89熱殺死菌、GMNL-89活菌培養基上清液對本實驗動物模式能量代謝影響並探討其可能機制。

圖1為餵食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高劑量和上清液低以及高劑量10週，各組大鼠飼養期間內空腹血糖記錄值。*表示和糖尿病組別相比，有顯著差異且P<0.05。

圖2為餵食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高劑量和上清液低以及高劑量10週，各組大鼠飼養期間內空腹胰島素記錄值。*表示和糖尿病組別相比，有顯著差異且P<0.05。

圖3為餵食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高劑量和上清液低以及高劑量6週後，對第二型糖尿病大鼠△AUC數據分析。

圖4為餵食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高劑量和上清液低以及高劑量8週後，對第二型糖尿病大鼠葡萄糖耐受性的影響。A：各組大鼠OGTT數據分析；B：各組大鼠0-180分鐘胰島素的變化數據分析。*表示和糖尿病組別相比，有顯著差異且P<0.05。

圖5為餵食GMNL-89乳酸菌死菌、活菌低以及高劑量和上清液低以及高劑量8週後，對第二型糖尿病大鼠△AUC數據分析。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本發明係益生菌用於製備治療第二型糖尿病的益生菌組合物的用途，其中該益生菌包含羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154之活菌、死菌及其培養物上清液至少一者，及藥學上可接受之載劑。另，本發明亦關於藉由該組合物或該乳桿菌用以治療第二型糖尿病之新穎用途。

其中該乳桿菌分離株亦包含其繼代培養之後代，或突變株，但仍具有與本發明所述之菌種特性、基因體(genomic)、或用途(用於治療第二型糖尿病)相同者。

本文所述組合物係可包含，但不限於：食品、飲品、健康食品、動物飲水添加物、動物飼料添加物、動物用及人類用醫療組合物、食品添加物、飲料添加物等適用本發明之應用形式。

術語“治療”、“治療中”及其類術語係指延緩、改善、減少或逆轉目前正折磨著患者之該病症或該病症相關之任何症狀的方法以及預防該病症或其任何正出現之症狀的方法。

術語"藥學上可接受"意謂物質或組合物必須與調配物之其他成份相容，且對患者無害。

術語“糖尿病相關併發症”，係包含但不限於：糖尿病性神經病變(包含但不限於膀胱無力、腹脹、便祕、瀉肚、陽萎、對冷熱感覺差)、腎疾病(包含但不限於絲球體性腎炎、腎小球硬化症、腎病徵候群、高血壓性腎硬化、腎疾病末期、尿毒症)、發炎反應、心血管或膽固醇過高併發症(包含但不限於腦中風、心肌梗塞、冠狀動脈栓塞、心絞痛、心衰竭、心律不穩、末梢血液循環不良、足部感染等)、眼疾(視網膜病變、白內障、青光眼、弱視(視力衰弱))、肝臟疾病(包含但不限於肝臟纖維化、脂肪肝、非酒精性脂肪肝、及肝硬化)。

本發明的組合物係可利用熟習此技藝者所詳知的技術，將上述的乳桿菌分離株，與一藥學上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)，製備成一適用本發明組合物之劑形。其中該劑形包含但不限於：溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(slurry)以及其他類似或適用本發明之劑形。

其中該藥學上可接受之載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

上述組合物中，亦可視需要適宜地添加一或多種以上製劑領域內通常使用之溶解補助劑、緩衝劑、保存劑、着色劑、香料、風味劑等。

另一較佳實施例中，本發明所提供之前述組合物，可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水(water)、流體乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，諸如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jellys)；糖果(candies)；嬰兒食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；中草藥材(Chinese herbals)；膳食補充品(dietary supplements)等。

此外，本發明所發現之新穎菌種，亦可與其他習知菌種一併被包含於一組成物中。

其中該組合物，可進一步包含至少一種選自於下列群組中的習知益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)、酵母菌(yeasts)。

其中該習知乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)包含但不限於：乳酸乳桿菌(lactobacillus lactis)、嗜酸乳桿菌(lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌(lactobacillus helveticus)、雙岐乳桿菌(lactobacillus bifidus)、乳酪乳桿菌(lactobacillus casei)、副乳酪乳桿菌副乳酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、或其組合。

其中該習知鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)包含但不限於：乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris)、或其組合。

其中該習知雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)包含但不限於：短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve)、乳酸雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis)、長型雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)、雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum)、或其組合。

其中該習知酵母菌(yeasts)包含但不限於：啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae)、乳酒假絲酵母菌(Candida kefyr)、弗羅稜酵母菌(Saccharomyces florentinus)、或其組合。

另，本發明亦提供前述乳桿菌用於製備治療第二型糖尿病之組合物的方法或用途。

本發明所提供之組合物及其用於治療第二型糖尿病之方法，其投藥路徑，可視需求適宜調整，並未特別限定，較佳者為經口投予適用劑形。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實驗材料與方法

A 試驗動物分組，飼養與照料：

用自樂斯科公司購得九週齡雄性SD大鼠(180±20克)，隨機分成七組。組數與隻數部分(共50隻)分別列於如下：

1.一般對照組(normal group)：n=5

2.糖尿病組(diabetes group)：n=5

3.糖尿病+死菌組：n=8

4.糖尿病+低劑量活菌組：n=8

5.糖尿病+高劑量活菌組：n=8

6.糖尿病+低劑量活菌培養基上清液組：n=8

7.糖尿病+高劑量活菌培養基上清液組：n=8

B 餵食劑量之計算：

(1)攝取受試樣品與誘發高血糖同時進行

(2)各實驗組別：活菌組、死菌組、活菌上清液組等，從入庫一週後，每日以管餵方式，分別投予不同濃度之乳酸菌產品至犧牲時停止。死菌的製備是以121℃的高壓滅菌府滅菌15分鐘後，將菌液凍乾成菌粉。活菌上清液製備是將菌液離心4000rpm/20分鐘後，取上清液通過0.22μm孔徑的濾膜央殘存之乳酸菌過濾。使用蛋白質濃度檢測試劑套組偵測上清液中的蛋白質濃度後，在將上清液調整成含蛋白質濃度為100μg/ml以及20μg/ml。

(3)當大鼠達到目標血糖值後即進行所需之檢測(Flow chart有加註目標血糖值為200mg/dL)

(4)正常組及糖尿病組則以同體積不含乳酸菌之溶劑取代。

各組餵食劑量如下：

1.一般對照組：

2.糖尿病組：

3.糖尿病+死菌組：每日以管餵方式1.6*10⁸CFU(0.04g)GMNL-89死菌/天

4.糖尿病+低劑量活菌組：每日以管餵方式1.6*10⁷CFU(0.004g)GMNL-89活菌/天

5.糖尿病+高劑量活菌組：每日以管餵方式1.6*10⁸CFU(0.04g)GMNL-89活菌/天

6.糖尿病+低劑量活菌培養基上清液組：劑量20μg總蛋白(total protein)/mL，每天總餵食量為1mL/隻

7.糖尿病+高劑量活菌培養基上清液組：劑量100μg總蛋白(total protein)/mL，每天總餵食量為1mL/隻

C 飼料配置與投予方法：

每日每隻大鼠分別給予飼料30公克，飼料配方詳述如下：

D 動物第二型糖尿病造症模式：

分別分為一般對照組及誘發糖尿病組別，誘發糖尿病組別飼養期間分別給予高糖高脂飲食及實驗期間隔日給予腹腔注射低劑量之鏈佐黴素(STZ，10mg/kg)及菸鹼醯胺(Nicotinamide，30mg/kg)。在整個實驗進行期間，每兩天給予低劑量之鏈佐黴素(STZ，10mg/kg)及菸鹼醯胺(Nicotinamide，30mg/kg)。當實驗期間大鼠血糖值180mg/dL則視為造症成功。

E 口服葡萄糖耐受試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)

以口服(1g/kg)方式給予實驗動物葡萄糖，然後分別在給糖前及給糖後的30、60、90、120和180分鐘採取血液樣品，以Rat Glucose Assay Kit測定血糖值。

F 血液生化值分析：

抽取靜脈血，抽血所得之血液立即以離心機，於3000rpm(1630xg)離心20分鐘，離心後取上層血漿液做以下生化分析：

1.糖化血色素(HbA1c)：

加入sample 100μL，37℃下放置2小時。每孔加入detection reagent A 100μL(臨用前配製)，37℃下放置1小時；再加detection reagent B 100μL(臨用前配製)，37℃下放置1小時；之後加入Substrate Solution 90μL，37℃避光顯色，反應15-30分鐘。最後加入Stop Solution 50μL終止反應，利用分光光度計在450nm波長下測定其吸光值，最後帶入標準曲線公式換算出大鼠血液中HbA1c含量。

2.葡萄糖(Glucose)之測定

抽血後所獲得的血漿，取20μL與葡萄糖以Rat Glucose Assay Kit測定血糖值。試液3mL，在37℃作用5分鐘，利用分光光度計在500nm波長下測定其吸光值，換算出血漿中葡萄糖含量。

3.胰島素之測定

取血液樣品0.5mL，使用Rat Insulin Assay Kit測其吸光值，再依標準曲線對照濃度即為血液樣品的濃度。

4.三酸甘油酯(TG)之測定

抽血後所獲得的血漿，取10μL與三酸甘油酯Enzymatic kits試液1mL，在37℃作用5分鐘，利用分光光度計在546nm波長下測定其吸光值，換算出血漿中三酸甘油酯含量，其換算公式如下：Plasma Triglyceride=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es：血液樣品的吸光值

Estd：標準試劑吸光值

Blank：未加樣品的kits吸光值

200：標準試劑濃度200mg/dL

5.總膽固醇(TC)之測定

抽血後所獲得的血漿，取10μL與膽固醇Enzymatic kits試液1mL，在37℃作用5分鐘，利用分光光度計在500nm波長下測定其吸光值，換算出血漿中三酸甘油酯含量，其換算公式如下：TC=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es：血液樣品的吸光值

Estd：標準試劑吸光值

Blank：未加樣品的kits吸光值

200：標準試劑濃度200mg/dL

6.高密度脂蛋白(HDL)之測定

抽血後所獲得的血漿，取10μL與高密度脂蛋白Enzymatic kits試液1mL，在37℃作用5分鐘，利用分光光度計在500nm波長下測定其吸光值，換算出血漿中高密度脂蛋白含量，其換算公式如下：HDL=(Es-Blank)/(Estd-Blank)×200

Es：血液樣品的吸光值

Estd：標準試劑吸光值

Blank：未加樣品的kits吸光值

200：標準試劑濃度200mg/dL

7.低密度脂蛋白(LDL)之測定

抽血後所獲得的血漿，取50μL與低密度脂蛋白Enzymatic kits試液1mL，在37℃作用5分鐘，利用分光光度計在500nm波長下測定其吸光值，換算出血漿中低密度脂蛋白含量，其換算公式如下：LDL-C=TC-(Asample×1265)

G.細胞激素分泌實驗

在餵食實驗物質連續八週後，採集大鼠血清，以酵素連結免疫分析法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA)測得細胞激素分泌量，比較各劑量組與對照組有無差異性存在。加入100μL稀釋過的抓取抗體(Capture antibody)至96孔盤中，並放置4℃冰箱中靜置隔夜。隔日吸出上清液，利用清洗溶液(Wash solution)清洗四次，清洗後加入200μL阻斷液(Blocking solution)至每個孔，在室溫下靜置2小時後，吸出上清液，利用清洗溶液清洗四次。每孔加入稀釋後之標準液或待測血清樣品100μL，在室溫下作用2小時，吸出上清液，利用清洗溶液清洗四次，加入稀釋好的100μL HRP偵測抗體(detection antibody)，於室溫下靜置30分鐘，吸出上清液，利用清洗溶液清洗五次，加入100μL酵素呈色溶液(Enzyme substrate solution)，避光放置室溫30分鐘後加入100μL終止溶液(Stop solution)，利用波長450nm測其吸光值。

H.超氧歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)之測定

依1975年Beutler所提出的方法，此酵素測定原理是利用黃嘌呤(xanthine)受黃嘌呤氧化酶(XOD)的催化下產生尿酸(uric acid)及超氧陰離子(superoxide radical)再與4-iodophenyl-3-(-4-nitrophenol)-5-phenyl tetrazolium(I.N.T)反應，形成紅色的甲臢(formazan dye)。而酵素之活性則藉由超氧歧化酶在此反應中所能清除超氧陰離子的多寡來評估。於37℃下；在試管中分別加入0.05mL血漿及1.70mL混合物質(mixed substrate)(0.05mmol/L,0.025mmol/L I.N.T)0.25mL黃嘌呤氧化酶(80U/L)混合均勻；在505nm下，測3分鐘之吸光值變化，並與標準品對照。

I.丙二醛(MDA，Malondialdehyde)之測定

丙二醛含量分析採用Yagi於1984年所提出的方法，並參考Prasad等人於1992年所改良的方法，綜合如下：脂質過氧化的產物丙二醛，其在酸性環境下可與二分子的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合成一紅色物質硫代巴比妥酸反應物質(thiobarbituric acid reactive substances TBARS)，利用螢光光度計在激發光(excitation)515nm及發散光(emission)553nm之下可測得丙二醛的濃度。而三羥甲基丙烷(1,1,3,3-tetra-methoxy-propane，TMP)在酸中會水解產生丙二醛，故以TMP做為標準品，計算組織中丙二醛含量，作為脂質過氧化指標。將1mL血漿加入1mL 10% 三氯乙酸(TCA)震盪均勻，以1500xg離心10分鐘，取1mL上層液或各濃度標準溶液，加入1mL TBA溶液及0.1mL二丁基羥基甲苯(BHT)溶液震盪均勻，置於95℃水浴60分鐘，冷卻後再加入2mL丁醇(butanol)震盪均勻，以1500xg離心十分鐘。取上清液，以螢光光度計測定激發光515nm及發散光553nm吸光值。

J.麩胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)之測定

依Paglia等人於1967年所提出，並且Lawrence等人於1976年所修飾的實驗方法分析GSH-Px的活性。其原理是在試管中的氫過氧化異丙苯(cumene hydroperoxide)存在下，GSH-Px會催化穀胱甘肽(glutathione，GSH)氧化成氧化谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，而GSSG會由谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)再還原成GSH，且會消耗掉NADPH，所以在波長340nm下，測NADPH之消耗量，由吸光度的減少，及可求得GSH-Px之活性。於37℃下；在試管中分別加入0.05mL血漿及0.10mL氫過氧化異丙苯混合均勻，在340nm下，測其吸光值變化。

實施例一

動物造症模式之確證

各組別大鼠於飼養期第7週前其空腹血糖值在第二型糖尿病造症老鼠組別間並無差異。但從第八週開始，糖尿病組、餵食高/低劑量活菌組別及高劑量上清液組別其血糖開始上升，然而在餵食死菌，高/低劑量活菌組別及高劑量上清液組別組別其空腹血糖上升趨勢呈現較緩和現象。餵食上清液低劑量組別於八週飼養期間發現對本實驗利用STZ+菸鹼醯胺誘導第二型糖尿病之動物模式具有最佳之保護效果，本實驗結果於動物飼養十週後亦呈現相同的趨勢。空腹胰島素值則從第四週開始，糖尿病組的胰島素值便開始上升並呈現胰島素代償現象，這表示第四週開始，糖尿病組別的老鼠已經有胰島素利用不良的情況發生。然而有餵食各種乳酸菌成分老鼠之空腹胰島素值仍然沒有上升，此現象表示有餵食各種乳酸菌成份的老鼠，其胰島素之分泌與醣類之利用情形仍然處在正常的範圍之內。由圖1及圖2的結果得知本動物模式已於飼養六週後動物即出現胰島素抗性及於八週後出現高血糖之現象，但有添加各種乳酸菌成分於飲食中的組別則呈現較緩和之血糖上升現象。空腹血糖值(圖1)、胰島素值(圖2)無論是死菌組、低活菌組、高活菌組、低上清液組、高上清液組，相較於糖尿病組皆具有顯著差異。

實施例二

每日飲食攝取紀錄

飼養老鼠期間分別紀錄了老鼠的飲食攝取量，並取其平均值。因為老鼠攝取量的差異可能會導致對體重之影響，並影響實驗結果，因此由表二結果可以觀察出各組老鼠的飲食攝取量分別與糖尿病組別相比，並沒無統計上差異發生。因此我們可以推測老鼠之熱量攝取應是差異不大且不會影響實驗結果。

實施例三

體重及肝腎重量

除了每日的飲食攝取紀錄，我們也記錄了其每周的體重變化，由表三中可看到結果可以觀察出各組老鼠的飲食攝取量與糖尿病組別相比，並無統計上的差異。在第十周時，犧牲老鼠試驗並取其肝臟和腎臟並測其重量，結果發現各組老鼠的飲食攝取量分別與糖尿病組別相比，並無統計上顯著差異發生(表四)。

實施例四

血清生化值分析

在表五結果中，我們可以看到各餵食乳酸菌組別與糖尿病鼠相比其血清生化值總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)和糖化血色素(HbA1c)皆有顯著降低。再以不同組別來看，其TC的變化為死菌>活菌低劑量>活菌高劑量組>上清液高劑量組>上清液低劑量組。而三酸甘油酯也有相同的趨勢變化，因此可證明，餵食乳酸菌對於將低三酸甘油酯和總膽固醇具有功效性，並且在不同的濃度下有不同的差異性。而對於血糖的控制則有不同的影響，在糖化血色素中其變化為死菌>活菌低劑量>上清液低劑量組>活菌高劑量組>上清液高劑量組。雖然乳酸菌皆可降低血中的總膽固醇、三酸甘油酯和HbA1，但其各組乳酸菌的影響有不同的變化。再進一步觀察可發現，上清液高劑量組雖然在三酸甘油酯、總膽固醇和糖化血色素中的影響較小，但卻是對各血清生化值皆有顯著性降低的功效。HOMA指標 (Homeostasis model assessment)是一個評估胰島素阻抗的指標，其值越高則代表胰島素利用率越差。從第7週HOMA指標可以看到上清液低劑量組的HOMA指標最低，且其結果以活菌高劑量組及上清液高劑量組最佳。

1.HOMA-IR=禁食血漿胰島素值(mmol/L)x禁食血漿葡萄糖濃度(ug/L)/22.5 2.*表示和糖尿病組別相比，有顯著差異且P<0.05。

實施例五

口服葡萄糖耐受試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)及血糖變化曲線下面積(△AUC)

在飼養第8週後執行一次口服葡萄糖耐受性試驗。在第8週的OGTT結果則可以看出上清液低劑量組>上清液高劑量組以及活菌高劑量組>活菌低劑量組>死菌(圖4)，胰島素值(圖4B)無論是死菌組、低活菌組、高活菌組、低上清液組、高上清液組，相較於糖尿病組皆具有顯著差異。而在△AUC方面也有相同的結果發現(圖3及圖5)。

實施例六

細胞發炎激素之分泌

在第10周犧牲之後，取其血液並評估細胞發炎激素之分泌狀況，由表六中可以觀察出餵食乳酸菌之後的各組老鼠，其發炎指標有明顯的降低。尤其以上清液低劑量組最為明顯，因此可推估餵食乳酸菌有助於降低發炎反應的發生。

實施例七

抗氧化酵素活性

在第10周犧牲之後，取其血液並評估抗氧化酵素活性狀況，由表七的結果可以看出餵食各種乳酸菌成分對老鼠的抗氧化酵素活性有不同的影響，就以餵食不同乳酸菌組別和糖尿病的老鼠相比，其SOD及GPx抗氧化酵素的活性顯著的增加，而TBARs則顯著的減少。而在給予各種乳酸菌之後，其體內的氧化壓力可能因SOD及GPx抗氧化酵素的活性顯著的增加而下降。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2006年11月14日、寄存編號為BCRC 910340。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2007年11月19日、寄存編號為CCTCC M 207154。

Claims

一種益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該益生菌係羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)之寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154；該培養上清液係將羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)細菌培養液以離心及0.22μm孔徑之濾膜過濾，分離細菌以及上清液；該第二型糖尿病症狀係第二型糖尿病所引起之高總膽固醇、高三酸甘油脂、高低密度脂蛋白、高介白素1 β(IL-1 β)、高腫瘤壞死因子α(TNF-α)；該第二型糖尿病併發症包括糖尿病性神經病變、腎疾病、發炎反應、心血管或膽固醇過高併發症、眼疾或肝臟疾病。
如申請專利範圍第1項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該組合物為醫藥組合物、食品或其組合。
如申請專利範圍第2項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該醫藥組合物可進一步包含藥學上可接受之載劑。
如申請專利範圍第2項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該醫藥組合物是呈一可供口服投藥的劑型。
如申請專利範圍第4項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。
如申請專利範圍第2項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該食品可進一步包含至少一種選自於下列群組中的益生菌：乳桿菌屬物種(lactobacillus sp.)、雙叉桿菌屬物種(Bifidobacterium sp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)及酵母菌(yeasts)。
如申請專利範圍第2項所述之益生菌培養上清液用於製備治療第二型糖尿病症狀及其併發症之組合物的用途，其中該食品可進一步包含一可食性材料，該可食性材料包含水、流體乳品、優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳桿菌發酵飲料、奶粉、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、甜點、糖果、嬰兒食品、健康食品、動物飼料、中草藥材或膳食補充品。