CN113209141B - 一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物及其应用。本发明的组合物，按重量份计，包括30‑97份褐藻提取物和3‑70份罗伊氏乳杆菌。本发明的褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合能促进罗伊氏乳杆菌在肠道内的定植，显著提高了定植率。本发明的褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合能显著降低2型糖尿病模型小鼠的空腹血糖与糖化血红蛋白浓度，提高胰岛素分泌量，同时，显著提高肠内双歧杆菌、乳杆菌等有益菌丰度，降低肠球菌、变形菌等条件致病菌丰度，具有良好的应用前景。

Description

一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是可定植于肠道并发挥益生作用的肠道益生菌。研究发现，罗伊氏乳杆菌具有良好的调节代谢能力，口服罗伊氏乳杆菌可以改善动物脂代谢和肠道通透，起到预防肥胖和改善脂多糖内毒素血症的作用。初步的临床实验也表明，罗伊氏乳杆菌安全性良好，适量补充可显著降低超重和肥胖患者的胰岛素分泌和总胆固醇水平，减轻胰岛素抵抗，此外，在炎症性肠病、糖尿病、高血压等疾病中也相继报道了罗伊氏乳杆菌改善疾病症状的作用。罗伊氏乳杆菌与机体肠道生态、代谢、神经等生理状态密切相关，具有良好的肠道益生作用。

借助大规模基因组测序分析，罗伊氏乳杆菌发挥肠道益生作用的机制与其显著调节肠道微生态之间的关联已逐步揭示。多项人体与动物实验研究结果发现，肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱等疾病的发生发展均伴随不同程度的罗伊氏乳杆菌丰度的降低。不仅如此，罗伊氏乳杆菌对肠道上皮细胞良好的黏附作用以及自聚集能力，有利于在肠道菌群中形成优势占位，这也为其参与调节代谢稳态及相关途径基因表达提供基础。但是目前采用罗伊氏乳杆菌或与其他乳酸菌混合直接用来调节肠道时，作用缓慢，且作用效果往往达不到预期效果。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物，在调节肠道微生物以及改善2型糖尿病中有良好的应用。

本发明的第一个目的是提供一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物，按重量份计，包括30-97份褐藻提取物和3-70份罗伊氏乳杆菌。

进一步地，按质量百分数，褐藻提取物中的糖含量不低于50％，其中，分子量小于2000Da的寡糖含量不低于总糖的30％。

进一步地，所述的褐藻提取物采用酶法辅助提取从褐藻中提取得到。

进一步地，所述的酶法辅助提取是以褐藻为原料，经生物酶酶解，然后水提、干燥制备得到褐藻提取物。

进一步地，所述的褐藻为海带、马尾藻或泡叶藻。

进一步地，所述的生物酶为纤维素酶、蛋白酶、褐藻胶裂解酶、岩藻多糖降解酶中的一种或多种。

进一步地，所述的罗伊氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.15021。具体参见申请号：201910688809.0，一株具有益生特性的罗伊氏乳杆菌及其用途。

进一步地，所述的组合物中还包括冻干保护剂。

进一步地，所述的冻干保护剂为海藻糖或脱脂乳粉。

本发明的第二个目的是提供所述的组合物的制备方法，包括如下步骤：

将罗伊氏乳杆菌活化、扩培、离心、洗涤，重悬后得到罗伊氏乳杆菌菌悬液，向菌悬液中加入褐藻提取物，经冷冻干燥后得到所述组合物；或，

将罗伊氏乳杆菌活化、扩培、离心、洗涤，重悬后罗伊氏乳杆菌菌悬液，向菌悬液中加入冻干保护剂，冻干后获得菌粉，将菌粉与褐藻提取物混合，制备得到所述组合物。

进一步地，所述的罗伊氏乳杆菌菌悬液中，活菌浓度大于10⁹CFU/mL。

本发明的第三个目的是提供所述的组合物在制备降血糖药物或肠道菌群调节药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合，使得罗伊氏乳杆菌在含有褐藻提取物的培养基中生长良好。该组合显著提高了罗伊氏乳杆菌产短链脂肪酸的能力，同时显著提升其成膜聚集性。

(2)本发明的褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合能促进罗伊氏乳杆菌在肠道内的定植，显著提高了定植率。

(3)本发明的褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合能显著降低2型糖尿病模型小鼠的空腹血糖与糖化血红蛋白浓度，提高胰岛素分泌量，同时，显著提高肠内双歧杆菌、乳杆菌等有益菌丰度，降低肠球菌、变形菌等条件致病菌丰度，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1：罗伊氏乳杆菌在不同组合培养基中的生长情况。

图2：罗伊氏乳杆菌产短链脂肪酸情况。P<0.05，**P<0.01

图3：罗伊氏乳杆菌生物膜形成能力。*P<0.05，**P<0.01

图4：组合对罗伊氏乳杆菌肠内定植率的影响。**P<0.01

图5：组合对糖尿病小鼠空腹血糖FBG的影响。

图6：组合给药对小鼠糖化血红蛋白的影响。

图7：组合给药对小鼠血清胰岛素水平的影响。

图8：组合给药对小鼠肠道微生物相对丰度的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：褐藻提取物对罗伊氏乳杆菌生长影响

褐藻提取物的制备：取海带10g(干重)，加入1L去离子水后打浆破碎，按照酶底比5000U/g加入褐藻胶裂解酶酶液，室温下搅拌酶解8h，之后沸水浴使酶灭活，水提液采用超滤除酶后进行冻干，所得的即为褐藻提取物。

在超净工作台中，蘸取保存管中的菌液，平板划线后在厌氧工作站中37℃静置过夜培养。挑取平板上的单菌落接种与液体培养基中活化24h，再按5.0％的接种量进行发酵培养。

以10％的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种到浓度为500μg/mL的不同添加物的培养基中(添加物为褐藻提取物、甘露寡糖)，37℃静置培养。分别在0、12、24、36、48、60h时间点取样，在波长600nm处测定OD值。24h以内，罗伊氏乳杆菌在添加褐藻提取物以及甘露寡糖的培养基中均可以快速生长，并在24h达到最大。

实施例2：褐藻提取物促进罗伊氏乳杆菌菌产短链脂肪酸

将罗伊氏乳杆菌在不同添加物培养基中的发酵液样品12000r/min离心5min，上清液用0.22μm滤膜过滤，采用HPLC检测短链脂肪酸，色谱柱：Waters XBridge C18 5μm，流动相：30％乙腈、70％水(0.05％磷酸)，柱温：35℃，流速：0.5mL/min，进样体积：20μL。

罗伊氏乳杆菌在无添加物的培养基中几乎不产短链脂肪酸，总酸含量低于10mg/mL；添加褐藻提取物与甘露寡糖后，短链脂肪酸产量显著提高，主要集中于乙酸、丁酸、丙酸和戊酸，尤其是丁酸、戊酸与异戊酸。其中，丁酸是发挥益生作用最为重要的短链脂肪酸种类，是结肠粘膜上皮细胞的主要能量来源，与结肠健康与菌群稳态密切相关。褐藻提取物对罗伊氏乳杆菌产丁酸与戊酸能力的促进作用更为显著。

实施例3：褐藻提取物促进罗伊氏乳杆菌菌形成生物膜

将罗伊氏乳杆菌配制成菌浓1.0×10⁷cfu/mL的菌悬液，置于96孔板离培养24h后弃取培养基，加入0.2mL 1％结晶紫作用30min，用蒸馏水漂洗后加入0.2mL 95％的乙醇，所得有色溶液在波长590nm测量OD，以罗伊氏乳杆菌在不含低聚糖的培养基的OD_590nm作为对照。细菌形成生物膜能力判定方法为，OD≤Dc，无生物膜形成能力；Dc<OD≤2Dc，弱生物膜形成能力；Dc<OD≤4Dc，中等生物膜形成能力；OD>4Dc，强生物膜形成能力。

对染色结果进行比较，罗伊氏乳杆菌在无添加物的培养基中能形成少量生物膜，成膜能力较弱。褐藻提取物与甘露寡糖均可显著提高罗伊氏乳杆菌的成膜能力，OD_590nm显著升高(P<0.05)，其中，在添加褐藻提取物的培养基中，罗伊氏乳杆菌生物膜形成效果最强(P<0.01)。

实施例4：褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌组合促进罗伊氏乳杆菌肠内定植

(1)小鼠实验分组。购买15只3周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应饲养一周后，随机分为三组，每组5只。正常组给药PBS缓冲液，另外两组分别灌胃给药罗伊氏乳杆菌菌液(2×10¹⁰CFU/mL)，以及褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌组合(5g/kg/day褐藻提取物+2×10¹⁰CFU/mL LAC)，持续给药3周后取小鼠粪便检测。

(2)荧光定量PCR分析罗伊氏乳杆菌肠内定植。将小鼠粪便样品按照QIAamp DNAStool Mini Kit试剂盒的实验操作进行总DNA提取。采用荧光定量PCR分析肠内定植罗伊氏乳杆菌数量，与灌胃菌液浓度相比计算罗伊氏乳杆菌定植率。罗伊氏乳杆菌菌液直接灌胃，其肠道定植率约57％，当以组合形式给药后，罗伊氏乳杆菌的肠道定植率提高了近15％，显著促进了罗伊氏乳杆菌的肠道定植效果。

实施例5：褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌组合在2型糖尿病小鼠模型中的应用

(1)采用高脂饲料联合链脲佐菌素诱导建立2型糖尿病小鼠模型。购买30只3周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应饲养一周后，随机取出6只作为正常组(NC)小鼠，其余24只用于造模。待造模的小鼠先用高脂饲料喂养28天，然后持续7天注射链脲佐菌素，注射的剂量为30mg/kg/day，注射体积设置为10mL/kg。之后每隔7天测定小鼠的空腹血糖。持续观察，空腹血糖≥11.1mmoL/L时且稳定时代表模型成功。之后给药本发明的两种组合干预持续5周。每周测定小鼠饮水、摄食和体重。

表1实验分组与给药

(2)空腹血糖(FBG)的检测：进入给药评价的阶段后，每周监测小鼠的FBG；早上8:00各组小鼠更换垫料并开始禁食，且自由饮水；下午16:00通过剪尾取血的方式检测各小鼠FBG，并记录分析。NC、MC、P、C1、C2组的FGB值分别为4.88±0.3、22.8±2.2、18.3±4.0、17.8±3.4、16.4±2.8，相对于MC组，C1组和C2组的FGB值显著下降(P<0.05，P<0.01)，组合后降糖效果优于阳性药物二甲双胍。

(3)全血中糖化血红蛋白(HbA1c)的检测：血浆糖化血红蛋白的检测采用试剂盒检测分析，结果以每10g血红蛋白的吸光值表示。MC组小鼠的HbA1c含量显著高于NC组(P<0.001)，给药本发明的组合后，相对于MC组，C1组和C2组的HbA1c显著下降(P<0.05)，说明组合给药后对于治疗T2DM的作用更好。

(4)血清胰岛素的检测：采用小鼠INS ELISA检测试剂盒定量胰岛素含量。NC组小鼠胰岛素水平为19.7±3.7mU/L，MC组小鼠的胰岛素水平为12.4±1.0mU/L，与NC组相比，MC组胰岛素水平显著性降低(P<0.01)。给药本发明的组合后，P和C1组的胰岛素水平分别为：14.7±3.8mU/l、16.3±6.1mU/l，比MC组略高但无显著性差异；C2组的胰岛素水平为17.2±1.9mU/l，相对于MC组显著性增加(P<0.01)。由此可见，糖尿病小鼠的胰岛素分泌水平明显下降，给药本发明的组合后，其水平有升高的趋势，组合C2效果优于组合C1，同时组合给药后治疗效果均优于二甲双胍给药。

实施例6：褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌组合对2型糖尿病小鼠肠道微生物的影响

将小鼠粪便样品按照QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒的实验操作进行总DNA提取，然后将DNA样品保存于-20℃待用。通过16S rRNA扩增子测序来分析微生物群落，使用以下V3-V4区通用引物进行聚合酶链反应合成带有Barcode的特异性引物：338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)-806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。

结果表明，MC组双歧杆菌和乳杆菌的相对丰度分别为0.17％±0.0003和0.06％±0.0001,给药本发明的组合后，C1组双歧杆菌和乳杆菌的相对丰度分别为2.28％±0.0046和0.14％±0.0003，C2组双歧杆菌和乳杆菌的相对丰度分别为2.43％±0.0003和0.15％±0.0003，组合给药组相对丰度均显著高于MC组(P<0.01，P<0.05)。双歧杆菌和乳杆菌对人体健康具有重要作用，包括改善生物屏障、抗肿瘤、增强免疫、改善胃肠道功能、抗衰老等多种生理功能。同时，给药本发明的组合后，相对于MC组，显著降低条件致病菌肠球菌和变形杆菌的相对丰度(P<0.01，P<0.01)。表明组合能够增加有益菌(双歧杆菌和乳杆菌)的相对丰度，减少肠道条件致病菌的水平，效果均优于阳性药物二甲双胍给药。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种基于褐藻提取物与罗伊氏乳杆菌的组合物，其特征在于，按重量份计，活性成分由30-97份褐藻提取物和3-70份罗伊氏乳杆菌组成；

按质量百分数，褐藻提取物中的糖含量不低于50%，其中，分子量小于2000 Da的寡糖含量不低于总糖的30%；

所述的罗伊氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No. 15021。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的褐藻提取物采用酶法辅助提取从褐藻中提取得到。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的酶法辅助提取是以褐藻为原料，经生物酶酶解，然后水提、干燥制备得到褐藻提取物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的生物酶为纤维素酶、蛋白酶、褐藻胶裂解酶、岩藻多糖降解酶中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还包括冻干保护剂。

6.权利要求1~5任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将罗伊氏乳杆菌活化、扩培、离心、洗涤，重悬后得到罗伊氏乳杆菌菌悬液，向菌悬液中加入褐藻提取物，经冷冻干燥后得到所述组合物；或，

将罗伊氏乳杆菌活化、扩培、离心、洗涤，重悬后得到罗伊氏乳杆菌菌悬液，向菌悬液中加入冻干保护剂，冻干后获得菌粉，将菌粉与褐藻提取物混合，制备得到所述组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的罗伊氏乳杆菌菌悬液中，活菌浓度大于10⁹ CFU/mL。

8.权利要求1~5任一项所述的组合物在制备降血糖药物或肠道菌群调节药物中的应用。

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