CN111254090A - 一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用，本发明的罗伊氏乳杆菌1723菌株分离自我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酥油中。于2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.18729。本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723兼具良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低体脂比，且发酵特性优良，可应用于发酵乳中，也可用于预防和治疗肥胖的药品、保健品或健康食品。

Description

一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用。

背景技术

近年来，随着社会经济的发展和人民生活水平的不断提高，中国居民超重及肥胖患病率呈现快速增长趋势。据报道，2018年中国平均肥胖率达到12％，肥胖总人数高居世界第一，同时肥胖人口特征呈年轻化趋势发展，且未来这个比例可能还会持续上涨。根据中国居民健康与营养调查结果显示，1997-2009年，成人超重肥胖率由25.1％增加至39.6％。2012年，我国18岁及以上成年人群超重率达到30.1％，肥胖率达到11.9％，两者合计为42.0％。此外， 2002-2012年，我国6～17岁儿童超重率上升了5.1％，肥胖率上升4.3％。2013年的调研结果显示，中国成人超重率为32.4％，肥胖率为14.1％，两者合计为46.5％。超重和肥胖已然成为危害中国人民健康的严重公共卫生问题。

肥胖不仅影响患者的生活、行为，还会增加患高血压、心脑血管疾病、糖尿病、脂肪肝、胆石症、胆囊炎、骨关节疾病、癌症等风险，世界卫生组织已将肥胖列为影响人类健康的十大主要威胁之一。目前，预防和治疗肥胖的手段有合理控制饮食以减少能量摄入、运动减肥、药物治疗等。美国FDA批准的减肥药物有5种，其作用原理主要有2类，一类是食欲神经相关抑制剂，如芬特明、安非他酮，另一类是脂肪酶抑制剂，如奥利司他。中国唯一批准的减肥药物就是奥利司他，但其存在一定的副作用，例如胃肠道不适、脂溶性维生素的血浆浓度下降、过敏等。

鉴于药物治疗存在的缺陷，针对肥胖症寻找一种健康有效的干预或治疗途径显得意义重大。乳酸菌通常是指一类能发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)，且代谢产物主要为乳酸的细菌，人类将乳酸菌应用于食品、饲料的发酵与保藏已有几千年。经科学研究证明，一些乳酸菌种属可对宿主产生益生作用，这一类乳酸菌被称为益生菌。世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为：当宿主摄入足够量的该类存活状态的微生物，可以促进宿主健康。近年来，国内外有多项文献报道，一些益生菌菌株对肥胖具有良好的干预或治疗效果，例如Lactobacillus plantarum KLDS1.0344和KLDS1.0386的混菌可有效抑制高脂饮食诱导C57BL/6小鼠肥胖的形成。国外关于益生菌缓解肥胖的研究较多，Tanida M等人发现，Lactobacillus paracasei ST11 (NCC2461)可有效减少高脂饮食诱导肥胖大鼠的体重增加、腹部脂肪的堆积，并发现该菌株是通过影响交感神经以起到调节作用。Stenman L K等人的研究亦显示Bifidobacterium animalis ssp.lactis 420可以有效减少肥胖小鼠的脂肪重量，改善葡萄糖耐受、减少血清中LPS 的水平以及肝脏炎症。此外，有人体研究结果表明，Lactobacillus gasseri SBT2055可显著减少有肥胖趋势人群的体重增加、腰围、臀围以及腹部脂肪的堆积。根据文献调研结果发现，国内针对益生菌干预或者缓解肥胖的研究不多，且大多数研究用的菌株为国外筛选得到的。中国地大物博，乳酸菌资源丰富，大力挖掘我国特有的具有益生功效的乳酸菌显得意义重大。

筛选得到一株能有效干预或缓解肥胖的益生菌，并证明该菌株在动物模型中具有良好的减少体重增加和脂肪堆积的作用，同时将这株菌应用于功能性食品产品中显得十分重要。本发明试图进一步挖掘益生菌的功能，为通过膳食方式缓解宿主肥胖开辟出新的有效解决途径。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌及其应用，本发明的罗伊氏乳杆菌1723兼具良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低体脂比，且发酵特性优良，可应用于发酵乳中，也可用于预防和治疗肥胖的药品、保健品或健康食品。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌命名为1723，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18729，微生物分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri。

上述新菌株是从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酥油中分离得到。

上述新菌株的生物学性质如实施例1所示。

上述新菌株具有良好的耐酸耐胆盐能力和黏附性，可以顺利通过胃肠道，并定殖于肠道中，发挥益生功能。

上述新菌株能够有效降低体重，减少脂肪堆积。服用剂量在1×10⁹CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.82％，脂肪重量降低14.53％，体脂比降低8.34％。

上述新菌株能够降低肝脏重量。服用剂量在1×10⁹CFU/d具有显著效果，肝脏重量降低10.30％，脏器比降低3.72％。

上述新菌株及其组合物能够显著降低血清总胆固醇水平。

第二方面，本发明提供了一种具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌的突变体，所述突变体为对前述罗伊氏乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

第三方面，本发明提供了一种含有前述罗伊氏乳杆菌或突变体的菌体培养物。

进一步地，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

第四方面，所述罗伊氏乳杆菌或突变体或菌体培养物在食品、药品或保健品制备中的应用。

第五方面，本发明提供了一种组合物，含有所述罗伊氏乳杆菌和/或所述突变体和/或所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。

进一步地，所述赋形剂和/或稀释剂为食品、药品或保健品。

进一步地，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬。

进一步地，所述药品和保健品为胶囊、粉剂或片剂。

所述组合物为口服形式并用于减肥或控制体重。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

(1)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723可有效降低大鼠体重。服用剂量在1×10⁹CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.82％。

(2)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723主要通过减少体内脂肪堆积降低体重。在肥胖大鼠模型试验中，服用剂量在1×10⁹CFU/d具有显著效果，脂肪重量较模型组降低14.53％，体脂比较模型组降低8.34％。

(3)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723能够显著降低肝脏重量。在肥胖大鼠模型试验中，服用剂量在1×10⁹CFU/d具有显著效果，肝脏重量降低10.30％，脏器比降低3.72％。

(4)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723能够显著降低血清总胆固醇。

(5)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723具备良好的耐酸耐胆盐特性。在pH 2.5环境下孵育4h存活率为99.69％，在pH 2.0环境下孵育4h存活率可达72.70％，在0.3％胆盐浓度下孵育8h存活率为95.34％。

(6)本发明所提供的罗伊氏乳杆菌1723具备良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达5.66±0.34，是对照商业菌株的2倍以上。

附图说明

图1为本发明菌株的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。

图2为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左侧两图为对照商业菌株的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723(图中标示为罗伊氏乳杆菌WHH1723) 的黏附实验镜检结果图。

图3为Wistar大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。

图4为Wistar大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。

图5为Wistar大鼠肝脏重、脏器比、脂肪重和体脂比的变化。A图为肝脏重，B图为脏器比，C图为脂肪重，D图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。

图6为Wistar大鼠血脂四项的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯，C图为高密度脂蛋白，D图为低密度脂蛋白。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。

图7为罗伊氏乳杆菌1723发酵乳破乳前状态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

本发明所提供的菌株经鉴定属于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，命名为1723，于2019 年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏,中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物保藏编号为CGMCC NO.18729。

本发明所提供的菌株罗伊氏乳杆菌1723是从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酥油中分离得到。

本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723的生物学性质如下：

形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色菌落，不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状(或球状)，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。

培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。

生理特征：使用API 50CHL系统。表1中列出了本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723的API 50CHL测试的结果。

表1 API 50结果

生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

实施例2

本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723、商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS) 经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.0和2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、 8h后菌数的变化。菌株存活率计算公式：

菌株存活率(％)＝N1/N0*100％。

N1为菌株孵育后活菌数，N0为菌株初始活菌数。

结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在pH 2.0环境下，孵育2h存活率为89.63％，孵育4h存活率为72.70％，而对照商业菌株在1h以后就检测不到活菌数。在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为99.69％，在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为95.34％，与具有优秀耐受特性的商业菌株相似。

表2耐受性结果

-：未检测到。

实施例3

建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×10⁶细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养2d。

本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723、商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×10⁸ CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO₂培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，结果如表3和图2所示，罗伊氏乳杆菌1723的单细胞黏附数达5.66±0.34，显著优于对照商业菌株(2.58±0.36， 1.46±0.25)。

表3粘附性结果

菌株编号	黏附率(菌数/细胞数)
		LGG	2.58±0.36
LcS	1.46±0.25
		罗伊氏乳杆菌1723	5.66±0.34<sup>**</sup>

与商业菌相比，**：p＜0.01。

实施例4

本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用Wistar大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发Wistar大鼠肥胖症。同时灌胃罗伊氏乳杆菌1723菌株，活菌数1×10⁹CFU/mL，其间每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测Wistar大鼠体重和脂肪含量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功效。

将健康的SPF级雄性Wistar大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为3 组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料，饲料组成如表4和表5。分组如下：

对照组：基础饲料喂养；

模型组：高脂饲料喂养造模；

实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×10⁹CFU/d；

饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，其配伍及主要营养成分如表5所示。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，组成如表5所示，总能：4334kcal/kg。

表4基础饲料组成

原料名称	配方比(％)	原料名称	配方比(％)
				角粉	6	维生素和矿物质	4.4
小麦	13	谷朊粉	2
				玉米	41.6	石粉	1
麸皮	17	色拉油	2
				豆粕	13

表5高脂饲料组成

原料名称	配方比(％)	原料名称	配方比(％)
				基础维持鼠饲料	54.7	维生素和矿物质	2
蔗糖	15	磷酸氢钙	2
				猪油	15	胆固醇	1
酪蛋白	10	胆酸钠	0.3

表6基础饲料(NCD)和高脂饲料(HFD)基本营养和能量组成

试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用ELISA 试剂盒检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，并称重，计算脏器比和体脂比比。

实验结果如图所示，从图3中发现，实验组的摄食量(图3A)和能量摄入量(图3B)同模型组之间无显著差异，说明罗伊氏乳杆菌1723并不是通过减少摄食量和能量摄入以达到降低体重的目标。

图4的结果显示，高脂饮食造模2周后，模型组的体重开始显著高于对照组(p＜0.05)，且第3周至第10周，模型组的体重均显著高于对照组(p＜0.01)，说明大鼠肥胖模型建立成功。实验组在第7周之前，其体重低于模型组，但未达到显著性差异(p＞0.05)，从第7周至第10周，实验组的体重值显著低于模型组(p＜0.05)(图4A)。整个实验期间，模型组大鼠的体重增长268.92g，但经罗伊氏乳杆菌1723菌株干预后，其体重增长246.13g，比模型组减少8.47％的体重增量(图4B)。说明罗伊氏乳杆菌1723服用浓度在1×10⁹CFU/d能够显著降低体重、控制体重增加，具有减肥功能。

图5的结果表明，对照组各项指标均显著低于模型组(p＜0.01)，说明造模成功。另外，同模型组相比，实验组的肝脏重量显著低于模型组(p＜0.05)(图6A)，肝脏脏器比虽低于模型组，但未达到显著差异(p＞0.05)(图6B)。同时，1723菌株干预组大鼠的脂肪重量显著低于模型组(p＜0.01)(图6C)，且体脂比亦显著低于模型组(p＜0.05)(图6D)，说明罗伊氏乳杆菌1723菌株服用浓度在1×10⁹CFU/d具有良好的肝脏保护、减少脂肪堆积的作用。

从图6的结果中发现，与模型组相比，实验组大鼠的血清中总胆固醇含量显著下降(p＜0.01)(图5A)，与对照组水平相当。此外，实验组和对照组的血清中甘油三脂(图5B)、高密度脂蛋白(图5C)、低密度脂蛋白(图5D)的含量相当，均略低于模型组，但未达到显著性差异(p＞0.05)。说明罗伊氏乳杆菌1723菌株服用浓度在1×10⁹CFU/d能够显著降低血脂水平。

总之，罗伊氏乳杆菌1723菌株服用浓度在1×10⁹CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低体脂比，是一株具有减肥功能的新菌株。

应用实施例实施例1罗伊氏乳杆菌1723冻干菌粉的制作

本发明菌株罗伊氏乳杆菌1723以1％的接种量接种于10ml液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养16h(一代种子液)，以此传至两代。二代种子1％的接种量接种于10L含有液体MRS培养基的发酵罐中，37℃培养16h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1×10¹¹CFU/g，可用于含有罗伊氏乳杆菌1723的具有减肥功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。

实施例2罗伊氏乳杆菌1723发酵乳的制作

准确称取脱脂乳粉100g，45-50℃纯净水900g，50℃温水溶解，剪切20min，50℃水化30min，均质，115℃杀菌10min，降温后，按1％接种量接入应用实施例1中的罗伊氏乳杆菌1723发酵剂，接种量为1×10⁷CFU/mL，37℃发酵8h。结果见表7和图7，罗伊氏乳杆菌1723发酵乳凝乳状态较紧实，有少量乳清洗出，破乳后初始为豆腐花状态，增加搅拌后逐渐顺滑细腻，拉丝长度1-2cm，活菌数3.6×10⁸CFU/mL，感官和风味良好，口感细腻丝滑，该发酵乳即为具有减肥功能的发酵乳。

表7罗伊氏乳杆菌1723发酵乳特性

pH	酸度(°T)	黏度(cp)	活菌数(CFU/mL)
				4.68	98.0	5868	3.6×10<sup>8</sup>

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一株具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌命名为1723，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18729，微生物分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri。

2.一种具有减肥功能的罗伊氏乳杆菌的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述罗伊氏乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。

3.一种含有如权利要求1所述罗伊氏乳杆菌或含有如权利要求2所述突变体的菌体培养物。

4.如权利要求3所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。

5.如权利要求1所述罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述突变体或权利要求3所述菌体培养物在食品、药品或保健品制备中的应用。

6.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述罗伊氏乳杆菌和/或权利要求2所述突变体和/或权利要求3所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述赋形剂和/或稀释剂为食品、药品或保健品。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬。

9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述药品和保健品为胶囊、粉剂或片剂。

10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物为口服形式并用于减肥或控制体重。

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