CN112244299A - 一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物及其制备方法 - Google Patents
一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及食品领域,公开了一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物及其制备方法。该益生菌组合物包括以下原料:植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉、葡萄粉、菊粉、赤藓糖醇。本发明的益生菌组合物通过五种益生菌菌株和葡萄粉、菊粉之间的协同作用,能有效降低肝脏重、脏器比、肝脏总胆固醇和甘油三酯水平,具有较好的缓解非酒精性脂肪肝的功能。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域,尤其涉及一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物及其制备方法。
背景技术
近年来,随着人们生活方式、饮食结构的改变,非酒精性脂肪性肝病在全世界的发病率逐年增加,已成为肝脏和代谢疾病病死率的重要危险因素,全球普通人群中平均患病率约 20%,现己成为危害人类健康最常见的肝病。非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史的以肝脏脂肪沉积大于肝脏总重5%的肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征,甘油三酯在肝脏中的积聚是肝脂肪变性的组织学标志,一种良性及静止的病变,但在较短时间内可发展为不可逆的肝损伤,肝纤维化的发生率高达25%,并可进展为肝硬化。非酒精性脂肪肝现已成为西欧、美国、澳大利亚第一大慢性肝病以及肝酶异常的首要病因。在美国,非酒精性脂肪肝的发病率为24%,而在亚洲国家非酒精性脂肪肝的发病率也逐渐增加。在过去的 7-10年,我国发达地区成人脂肪肝患病率大概增加了近一倍,且成人脂肪肝患病率高达15%,其中绝大多数为非酒精性脂肪肝,严重影响着人们的身体健康,给人们的生活带来困扰的同时也给国家经济的发展带来了沉重的负担。
研究发现,非酒精性脂肪肝的发生与胰岛素抵抗和氧化应激密切相关,益生菌具有抗氧化特性,可用于治疗非酒精性脂肪肝病,能够缓解氧化应激造成的肝脏损伤,对肝脏有一定的保护作用。同时,益生菌具有调节肠道菌群,改善肠道通透性,促进脂质代谢,减少体内脂肪堆积。近几年随着益生菌市场的普及,人们对益生菌的作用越来越关注。市面上的益生菌产品的种类大多数以片剂、滴剂、粉剂形式为主。粉剂益生菌又称益生菌冻干粉制剂,通过低温冷冻干燥技术加工而成,这是保护益生菌活性的一大重要保障。在冷冻干燥技术的保护下,益生菌能够保存十年甚至是更长的时间。可以最大程度的保证益生菌菌株的活性并直达肠道。因此,从食疗的角度,从食品用微生物入手,搭配具有广泛群众认可度可增强免疫力的食品原料,开发一款安全、可靠、有效的缓解非酒精性脂肪肝的益生菌组合物,定会具有良好的市场价值。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物及其制备方法。该益生菌组合物通过五种益生菌菌株和葡萄粉、菊粉的复配,能有效降低肝脏重、脏器比、肝脏总胆固醇和甘油三酯水平,具有较好的缓解非酒精性脂肪肝的功能。
本发明的具体技术方案为:
一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物,包括以下原料:植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉、葡萄粉、菊粉、赤藓糖醇;
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得;所述植物乳杆菌命名为1701,已在 2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为 CGMCC No.18728,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum;所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉由德氏乳杆菌乳亚种和/或其突变体制得;所述德氏乳杆菌乳亚种命名为815,已在2017年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.13750,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,微生物分类命名为德氏乳杆菌乳亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis;所述突变体为对所述德氏乳杆菌乳亚种进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述罗伊氏乳杆菌冻干粉由罗伊氏乳杆菌和/或其突变体制得;所述罗伊氏乳杆菌命名为 1723,已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.18729,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,微生物分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri;所述突变体为对所述罗伊氏乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述鼠李糖乳杆菌冻干粉由鼠李糖乳杆菌和/或其突变体制得;所述鼠李糖乳杆菌命名为 1155,已在2016年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.11955,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,微生物分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus;所述突变体为对所述鼠李糖乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉由乳酸乳球菌乳酸亚种和/或其突变体制得;所述乳酸乳球菌乳酸亚种命名为2311,已在2018年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No.15812,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号,微生物分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactissubsp.lactis;所述突变体为对所述乳酸乳球菌乳酸亚种进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
上述植物乳杆菌1701分离自我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样。发明人在前期研究中发现,该菌株具有降低体重、预防和治疗肥胖的功效,在此基础上,发明人对其进行继续挖掘研究,发现活菌株和灭活菌株均具有抗氧化作用,能够缓解非酒精性脂肪肝,同时减少非酒精性脂肪肝引发的肝脏损伤,具体表现如下:
(1)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够有效降低肝脏重量:活菌株服用剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏重降低14.63%;灭活菌株剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏重降低11.68%;
(2)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够有效降低脏器比:活菌株服用剂量在 1×109CFU/d时,能使脏器比降低9.04%;灭活菌株剂量在1×109CFU/d时,能使脏器比降低6.38%;
(3)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够有效降低肝脏甘油三酯水平:活菌株服用剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏甘油三酯水平降低24.50%;灭活菌株剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏甘油三酯水平降低13.63%;
(3)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够有效降低肝脏总胆固醇水平:活菌株服用剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏总胆固醇水平降低12.12%;灭活菌株剂量在1×109CFU/d时,能使肝脏总胆固醇水平降低28.79%;
(4)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够有效减轻肝脏组织细胞的脂肪变性,减少脂肪空泡,且空泡更小;
(5)植物乳杆菌1701活菌株和灭活菌株均能够显著改善大鼠肝脏组织炎症状态,减轻肝脏损伤:活菌株和灭活菌株服用剂量在1×109CFU/d时,均能显著降低肝脏中促炎因子IL-1β、 IL-6、NO的水平;
(6)植物乳杆菌1701具有较强的抗氧化能力:清除DPPH能力是对照商业菌株的2.10倍,清除羟自由基能力是对照商业菌株的1.85倍。
综上所述,植物乳杆菌1701具有较好的缓解非酒精性脂肪肝的功能,且由于灭活菌株也具有缓解非酒精性脂肪肝活性,因而能使产品中具有更好的稳定性和更好的保质期。
本发明将植物乳杆菌1701与其他4株益生菌以及葡萄粉、菊粉、赤藓糖醇复配。其他4株益生菌也具有缓解非酒精性脂肪肝的作用。葡萄中富含白藜芦醇,白藜芦醇有抗氧化、抗炎、缓解非酒精性脂肪肝等作用,其主要通过促进抗氧化因子SP1/ZNF32的表达改善非酒精性脂肪肝。菊粉是一种公认的膳食纤维,可以刺激肠道益生菌的生长,改变肠道菌群的结构,并可被菌群代谢产生短链脂肪酸,特别是丁酸,能促进胰岛素分泌,提高机体能量消耗,抑制脂肪堆积,同时可以调节脂质代谢,降低棕榈酸、油酸等脂肪酸含量,影响糖酵解、脂肪酸氧化等代谢,进而降低血脂,显著减少内脏脂肪堆积,缓解非酒精性脂肪肝。
研究发现,5株益生菌之间存在协同作用,复配后的组合物缓解非酒精性脂肪肝的效果明显优于单一菌株。其原因可能在于,通过改变肠道菌群,5株不同的益生菌之间能相互促进彼此在肠道中的定植和生长,从而更有效地缓解非酒精性脂肪肝。
此外,葡萄粉中的白藜芦醇和菊粉不仅自身具有缓解非酒精性脂肪肝的作用,还能改变肠道菌群,促进益生菌的定植和生长,提高其缓解非酒精性脂肪肝的功能。
赤藓糖醇吸湿性极低,是糖醇及蔗糖等甜味剂中最小的,在温度20℃、相对湿度90%的环境中,放置5天,其吸湿增重仅2%。而益生菌对水分含量、水分活度异常敏感,组合物水分含量、水分活度越低,越有利于组合物中益生菌的活性稳定。本发明采用赤藓糖醇作为甜味剂,由于其极低的吸湿性,能使组合物保持较低的水分含量和水分活度,从而维持益生菌的活性稳定。
维生素C是维持生物正常生长发育必需的一类微量营养物质,天然存在于新鲜蔬菜、水果中,有清爽愉悦的酸味,是非常良好的食品酸味来源,在改善口味的同时,可以补充人体所需的营养。
作为优选,按重量份包括植物乳杆菌冻干粉1-15份、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉1-15 份、罗伊氏乳杆菌冻干粉1-15份、鼠李糖乳杆菌冻干粉1-15份、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉1-15份、葡萄粉5-15份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-50份。
作为优选,按重量份还包括以下原料:维生素C 0.05-0.3份。
作为优选,所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
作为优选,所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g。
作为优选,所述罗伊氏乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g。
作为优选,所述鼠李糖乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
作为优选,所述乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g。
一种制备上述益生菌组合物的方法,包括以下步骤:
(1)称取各原料备用;
(2)将除植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀,得到混合小料,待用;
(3)将除植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉混合均匀,得到总混合半成品;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品进行包装,即得益生菌组合物。
步骤(4)中,将除益生菌冻干粉外的原料通过沸腾制粒技术进行制粒,可显著改善组合物的口感。若采用条包灌装机进行包装,则沸腾制粒还可显著改善组合物的灌装性能。
作为优选,步骤(2)中,若各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%,则加入赤藓糖醇,使重量之和达到总配方用料量的2%,再进行混合。
作为优选,步骤(4)中,沸腾制粒过程中采用粘合剂。
作为优选,所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种。
作为优选,步骤(3)中,混合转速为15-35rpm,优选30rpm;混合时间为10-20min,优选15min。
作为优选,步骤(4)中,沸腾制粒时,进风温度85-95℃,排风变频50-80%,物料温度50-60℃,雾化压力2.5-3.5bar,喷浆供浆泵转速50-80rpm。
作为优选,步骤(4)中,过筛时,筛网选择15-40目标准筛。
作为优选,步骤(5)中,混合转速为15-35rpm,优选30rpm,混合时间为10-20min,优选15min。
作为优选,步骤(6)中,采用条包灌装机进行包装。
作为优选,步骤(6)中,包装时,充入氮气,残氧量为3-10%。
作为优选,步骤(6)中,包装所用包材,采用铝塑包材。
作为优选,步骤(1)~(6)全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行,优选为在十万级GMP车间中进行,温度为18-26℃,湿度为25-40%。
作为优选,步骤(6)中,所述益生菌组合物的水分含量为2-5%,水分活度为0.1-0.4aW。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)本发明的组合物将5种益生菌、葡萄粉、菊粉进行复配,有利于益生菌在肠道中的定植和生长,能提高其缓解非酒精性脂肪肝的能力;
(2)本发明的组合物配方中的赤藓糖醇可在混合、包装等过程中维持组合物的低水分、低水分活度,有利于益生菌的活性稳定;
(3)本发明的组合物能有效降低肝脏重、脏器比、肝脏总胆固醇和甘油三酯水平,具有缓解非酒精性脂肪肝的功能。
附图说明
图1为各组别大鼠的肝脏组织HE染色切片图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种益生菌组合物,包括植物乳杆菌冻干粉1-15份、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉1-15份、罗伊氏乳杆菌冻干粉1-15份、鼠李糖乳杆菌冻干粉1-15份、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉1-15 份、葡萄粉5-15份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-50份、维生素C 0.05-0.3份。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为 1×107CFU/g-1×1012CFU/g。所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉中的活菌数为 1×107CFU/g-1×1011CFU/g。所述罗伊氏乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g。所述鼠李糖乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)称取各原料备用;
(2)将除5种益生菌冻干粉(即植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉)外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀,得到混合小料,待用;若各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%,则加入赤藓糖醇,使重量之和达到总配方用料量的2%,再进行混合;
(3)将除5种益生菌冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在15-35rpm,优选30rpm,混合时间控制在10-20min,优选15min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种;沸腾制粒时,进风温度85-95℃,排风变频50-80%,物料温度50-60℃,雾化压力2.5-3.5bar,喷浆供浆泵转速50-80rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选择15-40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与5种益生菌冻干粉混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在15-35rpm,优选30rpm,混合时间控制在10-20min,优选15min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得益生菌组合物;包装时应该充入氮气,残氧量控制在3-10%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2-5%,水分活度控制在0.1-0.4aW。
步骤(1)~(6)全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在18-26℃,湿度控制在25-40%。
实施例1:植物乳杆菌1701清除DPPH的能力
将植物乳杆菌1701和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后,取对数生长末期菌液,4000rpm离心10min,弃上清,获得菌泥,PBS(pH=7.4)洗涤2次,菌悬液OD600调至0.5±0.1。在反应体系中加入待测菌悬液1mL,再加入1mL 0.1mmol/L DPPH的无水乙醇溶液,充分混匀后,室温下避光反应30min,然后6000rpm离心10min,取上清液,测定 517nm处的吸光度(OD值)。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组,并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算DPPH自由基的清除率: DPPH自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%。
A0:对照的OD510值,A1:植物乳杆菌1701菌液的OD510值。
由表1可知,植物乳杆菌1701DPPH自由基清除率显著高于商业对照菌(p<0.01),是对照商业菌株的2.10倍。说明植物乳杆菌1701具有较强的抗氧化潜力,具有缓解肝脏损伤的潜在能力。
表1植物乳杆菌1701清除DPPH能力
处理 | DPPH自由基清除率(%) |
LGG | 45.90±0.12 |
植物乳杆菌1701 | 96.54±0.56<sup>**</sup> |
与商业对照菌相比,**:p<0.01。
实施例2:植物乳杆菌1701清除羟自由基的能力
将植物乳杆菌1701和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后,取对数生长末期菌液,4000rpm离心10min,弃上清,获得菌泥,PBS(pH=7.4)洗涤2次,菌悬液OD600调至0.5±0.1。取1mL OD600为0.5的植物乳杆菌1701菌液、1mL 0.9%的生理盐水、1mL FeSO4(3mmol/L)和1mL H2O2(3mmol/L)充分混匀,室温静置10min。然后加入1mL水杨酸 (3mmol/L,乙醇溶解),混匀,37℃水浴20min,离心取上清,测定510nm的OD值。按照下式计算羟自由基的清除率:
羟自由基清除率=(As-Ap)/As×100%
Ap:植物乳杆菌1701菌液的OD510值,As:菌悬液换成0.9%的生理盐水的OD510值。
由表2可知,植物乳杆菌1701羟自由基清除率显著高于商业对照菌(p<0.01),是对照商业菌株的1.85倍。说明植物乳杆菌1701具有较强的抗氧化能力,具有缓解肝脏损伤的潜在能力。
表2植物乳杆菌1701清除羟自由基能力
处理 | 羟自由基清除率(%) |
LGG | 52.39±1.52 |
植物乳杆菌1701 | 96.75±2.04<sup>**</sup> |
与商业对照菌相比,**:p<0.01。
实施例3:植物乳杆菌1701缓解非酒精性脂肪肝的能力
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄,200±20g),适应7天后,随机分为4组,每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃,湿度为30-70%,12h光照交替,自由饮水,自由摄入饲料。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成;高脂高糖饲料是在基础饲料中添加15%蔗糖、15%猪油、10%酪蛋白。动物实验分组如下:
对照组:基础饲料喂养;
模型组:高脂高糖饲料喂养造模,使大鼠发生非酒精性脂肪肝;
实验组1:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃本发明菌株悬液,灌胃剂量为1×109CFU/d;实验组2:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃本发明灭活菌株悬液,灌胃剂量为1×109CFU/d。
试验周期为10周,试验结束后,用1%戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉,脱颈处死后,解剖取肝脏,称重,用ELISA试剂盒检测肝脏中总胆固醇、甘油三酯、IL-1β、IL-6 和NO含量,肝脏组织进行HE切片观察。
由表3可知,与对照组相比,模型组肝脏重和脏器比显著高于对照组(p<0.01),肝脏重是对照组的1.80倍,说明模型组肝脏存在脂肪堆积,已经形成非酒精性脂肪肝。
由表3可知,与模型组相比,实验组1和实验组2大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组(p<0.01)。说明植物乳杆菌1701活菌株或灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低肝脏重量,减少肝脏脂肪堆积。
表3肝脏和脏器比结果
处理 | 肝脏重(g) | 脏器比(肝脏/体重,%) |
对照组 | 9.46±0.81** | 2.66±0.20** |
模型组 | 17.06±1.99 | 3.95±0.24 |
实验组1 | 14.56±2.58** | 3.59±0.37** |
实验组2 | 14.67±1.51** | 3.52±0.20** |
与模型组相比,*:p<0.05;**:p<0.01。
由表4可知,与对照组相比,模型组肝脏组织甘油三酯和总胆固醇水平显著高于对照组(p<0.01),说明模型组大鼠已经形成非酒精性脂肪肝。
由表4可知,与模型组相比,实验组1和实验组2肝脏组织甘油三酯和总胆固醇水平显著低于模型组(p<0.01),说明植物乳杆菌1701活菌株或灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d 能够缓解非酒精性脂肪肝。
表4肝脏组织甘油三酯和总胆固醇含量
处理 | 甘油三酯(mmol/L) | 总胆固醇(mmol/L) |
对照组 | 21.78±4.68** | 0.34±0.03** |
模型组 | 358.53±14.94 | 0.76±0.08 |
实验组1 | 195.20±33.03** | 0.47±0.07** |
实验组2 | 226.28±19.96** | 0.58±0.06** |
与模型组相比,*:p<0.05;**:p<0.01。
由表5可知,与对照组相比,模型组肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β和NO的含量显著高于对照组(p<0.01),说明模型组肝脏已经发生炎症。
由表5可知,与模型组相比,实验组1和实验组2大鼠肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β和NO显著低于模型组(p<0.01),与对照组相当。说明植物乳杆菌1701活菌株或灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著改善大鼠肝脏组织炎症状态,减轻肝脏损伤。
表5肝脏炎症相关细胞因子含量
处理 | IL-1β(ng/L) | IL-6(ng/L) | NO(ng/μl) |
对照组 | 16.90±1.78** | 231.63±10.51** | 0.51±0.06** |
模型组 | 29.19±1.51 | 353.71±12.69 | 0.95±0.08 |
实验组1 | 16.50±1.78** | 236.83±16.61** | 0.54±0.04** |
实验组2 | 16.29±1.20** | 235.43±11.24** | 0.64±0.05** |
与模型组相比,*:p<0.05;**:p<0.01。
由图1可知,对照组大鼠肝脏组织小叶结构完整,细胞界限清晰,细胞核位于中央,末见脂肪空泡。模型组大鼠肝脏组织细胞结构被破坏,细胞肿胀,细胞间隙不清,脂肪沉积明显,肝组织小泡性脂肪变性及水样变性,可见大量肝细胞脂肪空泡,说明模型组大鼠已经形成非酒精性脂肪肝,且肝脏组织严重受损。实验组1和实验组2大鼠肝脏组织细胞的脂肪变性减轻,脂肪空泡减少,且空泡更小。病理学结果同血清指标的结果一致,说明植物乳杆菌1701活菌株或灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够有效改善肝脏脂肪变性,能够缓解非酒精性脂肪肝。
综上所述,植物乳杆菌1701活菌株或灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著减少肝脏脂肪堆积,降低脏器比,降低肝脏甘油三酯和总胆固醇水平,减轻肝脏组织脂肪变性,改善肝脏组织炎症状态,是一株具有缓解脂肪肝功能的菌株。
实施例4:益生菌冻干粉的制备
将植物乳杆菌1701以1%的接种量接种于10mL液体MRS培养基中,在37℃恒温培养箱中培养16h(一代种子液)。一代种子液以1%的接种量接种于100mL液体MRS培养基中,在 37℃恒温培养箱中培养16h(二代种子液)。二代种子1%的接种量接种于10L含有液体MRS 培养基的发酵罐中,150rpm,pH 6.0,37℃培养16h,收集菌液,8000rpm离心10min收集菌体,用0.9%生理盐水洗涤一次,加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬,真空冷冻干燥,菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达2×1012CFU/g,可用于含有植物乳杆菌1701的具有抗氧化和缓解非酒精性脂肪肝功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。
将德氏乳杆菌乳亚种815、罗伊氏乳杆菌1723、鼠李糖乳杆菌1155、乳酸乳球菌乳酸亚种2311以1%的接种量接种于10mL液体MRS培养基中,在37℃恒温培养箱中培养24h(一代种子液)。一代种子液以1%的接种量接种于100mL液体MRS培养基中,在37℃恒温培养箱中培养24h(二代种子液)。二代种子1%的接种量接种于10L含有液体MRS培养基的发酵罐中,150rpm,pH 6.0,37℃培养18h,收集菌液,8000rpm离心10min收集菌体,用0.9%生理盐水洗涤一次,加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬,真空冷冻干燥,菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1×1011CFU/g至2×1012CFU/g。
将以上制得的冻干菌粉过筛,筛网选择15目标准筛,即获得冻干粉。
上述液体MRS培养基的配方为葡萄糖20g、牛肉膏13g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨7g、酵母粉6g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.2g,水1000mL;调整其pH为6.5。
实施例5:益生菌组合物的制备
一种益生菌组合物,包括植物乳杆菌冻干粉4份、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉4份、罗伊氏乳杆菌冻干粉4份、鼠李糖乳杆菌冻干粉4份、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉4份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9份、维生素C 0.1份。所述植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉由实施例 4制得,其中的活菌数均为1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与5种益生菌冻干粉共20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表6。
表6实施例5所得组合物及其内容物检测结果
对比例1:只含一种益生菌(植物乳杆菌1701)的组合物的制备
一种益生菌组合物,包括植物乳杆菌冻干粉20份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9 份、维生素C 0.1份。所述植物乳杆菌冻干粉由实施例4制得,其中的活菌数为1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表7。
表7对比例1所得组合物及其内容物检测结果
对比例2:只含一种益生菌(德氏乳杆菌乳亚种815)的组合物的制备
一种益生菌组合物,包括德氏乳杆菌乳亚种冻干粉20份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9份、维生素C 0.1份。所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉由实施例4制得,其中的活菌数为1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与德氏乳杆菌乳亚种冻干粉20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表8。
表8对比例2所得组合物及其内容物检测结果
对比例3:只含一种益生菌(罗伊氏乳杆菌1723)的组合物的制备
一种益生菌组合物,包括罗伊氏乳杆菌冻干粉20份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9份、维生素C 0.1份。所述罗伊氏乳杆菌冻干粉由实施例4制得,其中的活菌数为 1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与罗伊氏乳杆菌冻干粉20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表9。
表9对比例3所得组合物及其内容物检测结果
对比例4:只含一种益生菌(鼠李糖乳杆菌1155)的组合物的制备
一种益生菌组合物,包括鼠李糖乳杆菌冻干粉20份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9份、维生素C 0.1份。所述鼠李糖乳杆菌冻干粉由实施例4制得,其中的活菌数为 1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与鼠李糖乳杆菌冻干粉20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表10。
表10对比例4所得组合物及其内容物检测结果
对比例5:只含一种益生菌(乳酸乳球菌乳酸亚种2311)的组合物的制备
一种益生菌组合物,包括乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉20份、葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇27.9份、维生素C 0.1份。所述乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉由实施例4制得,其中的活菌数为1×109CFU/g。
一种益生菌组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)按照重量份配比称取各原料备用;
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀,得到混合小料;
(3)将葡萄粉12份、菊粉40份、赤藓糖醇26份与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;沸腾制粒过程采用粘合剂,所述粘合剂为纯水;沸腾制粒时,进风温度90℃,排风变频80%,物料温度50℃,雾化压力3bar,喷浆供浆泵转速70rpm;沸腾制粒后产物进行过筛,筛网选40目标准筛;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉20份混合均匀,得到总混合半成品;混合转速控制在30rpm,混合时间控制在20min;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装,即得成品;包装时应该充入氮气,残氧量控制在1%;包装所用包材,采用铝塑包材;所述益生菌组合物的水分含量控制在2%,水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)~(6)中,操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度控制在20℃,湿度控制在20%。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测,所得检测结果见表11。
表11对比例5所得组合物及其内容物检测结果
测试例:比较实施例5与对比例1~5的组合物缓解非酒精性脂肪肝的效果将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄,200±20g),适应7天后,随机分为8组,每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃,湿度为30-70%,12h光照交替,自由饮水,自由摄入饲料。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成;高脂高糖饲料是在基础饲料中添加15%蔗糖、15%猪油、10%酪蛋白。动物实验分组如下:
对照组:基础饲料喂养;
模型组:高脂高糖饲料喂养造模,使大鼠发生非酒精性脂肪肝;
实验组1:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃实施例5中组合物,灌胃剂量为1×109CFU/d;实验组2:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃对比例1中组合物,灌胃剂量为1×109CFU/d。
实验组3:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃对比例2中组合物,灌胃剂量为 1×109CFU/d;
实验组4:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃对比例3中组合物,灌胃剂量为1×109CFU/d;实验组5:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃对比例4中组合物,灌胃剂量为1×109CFU/d;实验组6:高脂高糖饲料喂养造模,同时灌胃对比例5中组合物,灌胃剂量为1×109CFU/d。
试验周期为10周,试验结束后,用1%戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉,脱颈处死后,解剖取肝脏,称重,用ELISA试剂盒检测肝脏中总胆固醇、甘油三酯。
由表12可知,与对照组相比,模型组肝脏重和脏器比显著高于对照组(p<0.01),说明模型组肝脏存在脂肪堆积,已经形成非酒精性脂肪肝。
由表12可知,与模型组相比,实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5 和实验组6大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组(p<0.01)。但实验组1效果明显优于实验组 2~6,说明植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉复合使用比每种益生菌冻干粉单独使用的缓解非酒精性脂肪肝效果更佳,表现出良好的协同效果。
表12肝脏和脏器比结果
与模型组相比,*:p<0.05;**:p<0.01。
由表13可知,与对照组相比,模型组肝脏组织甘油三酯和总胆固醇水平显著高于对照组(p<0.01),说明模型组大鼠已经形成非酒精性脂肪肝。
由表13可知,与模型组相比,实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5 和实验组6肝脏组织甘油三酯和总胆固醇水平显著低于模型组(p<0.01),但实验组1效果明显优于实验组2~6,说明植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉复合使用比每种益生菌冻干粉单独使用的缓解非酒精性脂肪肝效果更佳,表现出良好的协同效果。
表13肝脏组织甘油三酯和总胆固醇含量
处理 | 甘油三酯(mmol/L) | 总胆固醇(mmol/L) |
对照组 | 25.23±3.11** | 0.36±0.02** |
模型组 | 346.27±11.59 | 0.74±0.07 |
实验组1 | 195.27±18.33** | 0.48±0.03** |
实验组2 | 210.38±20.55** | 0.58±0.04** |
实验组3 | 215.07±21.36** | 0.60±0.03** |
实验组4 | 209.85±22.74** | 0.56±0.04** |
实验组5 | 213.82±19.67** | 0.57±0.05** |
实验组6 | 209.66±17.53** | 0.55±0.03** |
与模型组相比,*:p<0.05;**:p<0.01。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有缓解非酒精性脂肪肝功能的益生菌组合物,其特征在于,包括以下原料:植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉、葡萄粉、菊粉、赤藓糖醇;
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得;所述植物乳杆菌命名为1701,已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No.18728,微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum;所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉由德氏乳杆菌乳亚种和/或其突变体制得;所述德氏乳杆菌乳亚种命名为815,已在2017年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.13750,微生物分类命名为德氏乳杆菌乳亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis;所述突变体为对所述德氏乳杆菌乳亚种进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述罗伊氏乳杆菌冻干粉由罗伊氏乳杆菌和/或其突变体制得;所述罗伊氏乳杆菌命名为1723,已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.18729,微生物分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri;所述突变体为对所述罗伊氏乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述鼠李糖乳杆菌冻干粉由鼠李糖乳杆菌和/或其突变体制得;所述鼠李糖乳杆菌命名为1155,已在2016年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC NO.11955,微生物分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus;所述突变体为对所述鼠李糖乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体;
所述乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉由乳酸乳球菌乳酸亚种和/或其突变体制得;所述乳酸乳球菌乳酸亚种命名为2311,已在2018年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No.15812,微生物分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp. lactis;所述突变体为对所述乳酸乳球菌乳酸亚种进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
2.如权利要求1所述的益生菌组合物,其特征在于,按重量份包括植物乳杆菌冻干粉1-15份、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉1-15份、罗伊氏乳杆菌冻干粉1-15份、鼠李糖乳杆菌冻干粉1-15份、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉1-15份、葡萄粉5-15份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-50份。
3.如权利要求2所述的益生菌组合物,其特征在于,按重量份还包括以下原料:维生素C0.05-0.3份。
4.如权利要求1或2所述的益生菌组合物,其特征在于:
所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g;和/或
所述德氏乳杆菌乳亚种冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g;和/或
所述罗伊氏乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g;和/或
所述鼠李糖乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g;和/或
所述乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1011CFU/g。
5.一种制备如权利要求1-4之一所述益生菌组合物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取各原料备用;
(2)将除植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀,得到混合小料,待用;
(3)将除植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀,得到混合半成品;
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒,过筛,得到沸腾制粒半成品;
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉、德氏乳杆菌乳亚种冻干粉、罗伊氏乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌乳酸亚种冻干粉混合均匀,得到总混合半成品;
(6)将步骤(5)所得总混合半成品进行包装,即得益生菌组合物。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%,加入赤藓糖醇,使重量之和达到总配方用料量的2%,再进行混合。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,沸腾制粒过程采用粘合剂。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种。
9.如权利要求5所述的方法,其特征在于:
步骤(3)中,混合转速为15-35rpm,混合时间为10-20min;和/或
步骤(4)中,沸腾制粒时,进风温度85-95℃,排风变频50-80%,物料温度50-60℃,雾化压力2.5-3.5bar,喷浆供浆泵转速50-80rpm;和/或
步骤(4)中,过筛时,筛网选择15-40目标准筛;和/或
步骤(5)中,混合转速为15-35rpm;混合时间为10-20min;和/或
步骤(6)中,包装时,充入氮气,残氧量为3-10%;和/或
步骤(1)~(6)全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行,温度为18-26℃,湿度为25-40%。
10.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(6)中,所述益生菌组合物的水分含量为2-5%,水分活度为0.1-0.4aW。
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