CN111676157A - 一种基于植物乳杆菌的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品领域，公开了一种基于植物乳杆菌的组合物及其制备方法。该组合物包括植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、菊粉、赤藓糖醇、维生素C，能够降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖。用于制备植物乳杆菌冻干粉的植物乳杆菌1701兼具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖；此外，植物乳杆菌1701灭活后也具有减肥功能，因此产品稳定性和保质期更长。

Description

一种基于植物乳杆菌的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及一种基于植物乳杆菌的组合物及其制备方法。
背景技术
肥胖主要是由于机体能量代谢平衡发生紊乱，导致能量摄入大于能量消耗，引起体内脂肪过多积累，所产生的代谢类疾病。肥胖不仅受遗传、环境、代谢、生理等多因素影响，同时还与高血脂、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、高尿酸血症、非酒精性脂肪肝、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病紧密相关。目前，肥胖及其并发症已经成为全球范围内主要的公共卫生问题，其不仅影响个体的外表体征，还对人类的健康造成着严重的危害。
目前，大量研究表明肥胖与肠道微生物菌群有着密切的联系。而益生菌能够通过其良好的耐受性和黏附性，定植于肠道，达到调节肠道菌群结构，维持肠道菌群平衡，从而发挥出相应的益生功能。肥胖会引起体内脂肪堆积，甘油三酯、总胆固醇的含量升高，而甘油三脂、胆固醇水平偏高，会增加肥胖相关疾病高血脂、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝的患病风险。研究表明，益生菌能够降低高脂饮食诱导的肥胖模型鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，改善脂质代谢，减少体内脂肪堆积，降低体重，减少肥胖相关疾病患病风险。
已有商业化益生菌菌株能够减少脂肪堆积或降低体重。森永乳业的短双歧杆菌B-3有助于降低亚肥胖成年人的体脂水平。杜邦丹尼斯克的动物双歧杆菌B420能够控制体重，增加AKK(Akkermansia muciniphila)菌的定植。雪印乳业的加氏乳杆菌SP株具有减少内脏脂肪积累，减脂、控制体重功效。可尔必思的噬淀粉乳杆菌CP1563能够通过减少胆固醇含量，改善脂质代谢，达到降低体脂的功效。然而，这些不同益生菌的作用是具有菌株特异性的，并且个体肠道菌群及生理状态差异明显，同一种益生菌不一定能够对所有个体都适用。因此，仍然需要开发有更多具有控制体重、减少脂肪堆积的其它益生菌新菌株来填补现有菌株的空白(虽然多数新菌株自身也具有特异性，但是可能存在这种情况：现有菌株对某个体无效而新菌株却刚好有效)。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于植物乳杆菌的组合物及其制备方法。本发明将植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、赤藓糖醇、菊粉、维生素C进行复配，通过沸腾制粒技术进行制粒，可显著改善组合物口感，还可显著改善条包灌装机灌装性能；所得组合物能够降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖。
本发明的具体技术方案为：
一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于，包括植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、菊粉、赤藓糖醇、维生素C；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在 2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
本发明配方中，以特定的植物乳杆菌冻干粉为主要功能物，白芸豆提取物、菊粉、赤藓糖醇、维生素C为辅料。其中，用于制备植物乳杆菌冻干粉的植物乳杆菌1701是一种从中国西藏地区采集的传统发酵食品中所分离得到的益生菌菌株，经过动物实验验证，其具有良好的耐受性和黏附性，能顺利到达肠道，与肠道上皮细胞发生黏附，发挥益生功效，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖，而且，在其灭活后也具有减肥功能。此外，在动物实验过程中，未发现实验动物死亡、精神不振、食欲不振等不良状态，说明该菌种具有较高的安全性。
具体而言，上述植物乳杆菌1701具有以下优点：
(1)具备良好的耐酸耐胆盐特性：在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％，在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％；良好的耐酸性使植物乳杆菌1701在制备冻干粉和组合物的过程中，特别是在制备冻干粉时的发酵过程中，能适应更宽的pH范围，从而使本发明的基于植物乳杆菌的组合物具有更高的活菌含量；
(2)具备良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达4.90±0.65，是对照商业菌株的1.9倍以上；
(3)活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重；
(4)活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清总胆固醇和甘油三酯水平，降低血脂；
(5)活菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×107CFU/d-1× 109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.50-8.69％，脂肪重量降低10.53-14.86％，体脂比降低4.79-10.06％；
(6)灭活菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.92％，脂肪重量降低12.22％，体脂比降低7.24％；
(7)活菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量：服用剂量在1×107CFU/d-1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达12.34-14.63％，脏器比降低4.52-9.04％；
(8)灭活菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量。服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达11.68％，脏器比降低6.38％。
白芸豆提取物中含有α-淀粉酶抑制蛋白，能够与体内的α-淀粉酶形成复合体，从而抑制淀粉酶的活性，阻碍食物中部分淀粉的消化吸收，可以在不影响其他营养吸收的同时，减少糖分吸收，减少脂肪合成，从而有良好的减轻体重，降低血脂的功能。同时，白芸豆提取物为一种纯天然物质，安全无毒，耐受性好，是一种可以长期食用的减肥功能原料。
菊粉是一种公认的膳食纤维，可以刺激肠道益生菌的生长，改变肠道菌群的结构，并可被菌群代谢产生短链脂肪酸，特别是丁酸，能促进胰岛素分泌，提高机体能量消耗，抑制脂肪堆积。同时可以调节脂质代谢，降低棕榈酸、油酸等脂肪酸含量，影响糖酵解、脂肪酸氧化等代谢，进而降低血脂，显著减少内脏脂肪堆积，缓解肥胖。
赤藓糖醇是一种天然的四碳多元醇，其甜味纯正，甜味特点与蔗糖非常接近，但是其能量热值非常低，仅为蔗糖的十分之一，是一种低代谢性的低热甜味剂，不能被人体消化，不会引起人体血糖和胰岛素变化。另外，本发明的组合物为以益生菌——植物乳杆菌1701为核心成分，其具有一般益生菌组合物所具有的对水分、水分活度异常敏感的特点，组合物水分、水分活度越低，越有利于组合物中植物乳杆菌1701的活性稳定。组合物水分、水分活度与组合物中各组分自身含水量及吸湿性能有关，自身水分含量越低、吸湿性越低，越容易维持组合物的低水分、低水分活度。赤藓糖醇吸湿性极低，是糖醇及蔗糖等甜味剂中最小的，在温度20℃、相对湿度90％的环境中，放置5天，其吸湿增重仅2％，是非常理想的用于维持组合物低水分、低水分活度的食品原料，有利于植物乳杆菌1701的活性稳定。
维生素C是维持生物正常生长发育必需的一类微量营养物质，天然存在于新鲜蔬菜、水果中，有清爽愉悦的酸味，是非常良好的食品酸味来源，在改善口味的同时，可以补充人体所需的营养。
作为优选，组合物中按重量份包括植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物2-11份、菊粉20-40份、赤藓糖醇40-60份、维生素C 0.05-0.3份。
作为优选，所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
作为优选，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备；
2)菌株保护剂的制备；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养；
4)发酵结束后取发酵产物，离心；
5)离心产物与菌株保护剂混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
本发明采用生物工程高密度发酵技术、冷冻干燥技术、粉碎过筛工艺制备物乳杆菌冻干粉，获得的冻干粉具有活菌数高，且水分含量低、水分活度低，能保证其中的植物乳杆菌的活性稳定，此外还具有粒径分布合理、与其他物料的混合性能良好等特点。
作为优选，步骤1)中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-801-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2。
作为优选，步骤2)中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L。
作为优选，步骤3)中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h。
作为优选，步骤3)中，发酵pH为4.5-5.6。
本发明采用的是高密度发酵工艺，需要对发酵pH进行调控。在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH4.5-5.6时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍。
作为优选，步骤4)中，离心转速4,000-10,000rpm，离心时间3-10min。
作为优选，步骤5)中，所述离心产物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合。
作为优选，步骤7)中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
一种基于植物乳杆菌的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取各原料备用；
(2)将除植物乳杆菌冻干粉外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料，待用；
(3)将除植物乳杆菌冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；
(6)将步骤(5)所得总混合半成品进行包装，即得基于植物乳杆菌的组合物。
步骤(4)中，通过沸腾制粒技术进行制粒，可显著改善组合物的口感，若采用条包灌装机进行包装，则还可显著改善组合物的灌装性能。
作为优选，步骤(2)中，若各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％，则加入赤藓糖醇，使重量之和达到总配方用料量的2％，再进行混合。
作为优选，步骤(4)中，沸腾制粒过程中采用粘合剂；所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种。
作为优选，步骤(3)中，混合转速为15-35rpm，优选30rpm；混合时间为10-20min，优选15min。
作为优选，步骤(4)中，沸腾制粒时，进风温度85-95℃，排风变频50％-80％，物料温度50-60℃，雾化压力2.5-3.5bar，喷浆供浆泵转速50-80rpm。
作为优选，步骤(4)中，过筛时，筛网选择15-40目标准筛。
作为优选，步骤(5)中，混合转速为15-35rpm，优选30rpm，混合时间为10-20min，优选15min。
作为优选，步骤(6)中，采用条包灌装机进行包装。
作为优选，步骤(6)中，包装时，充入氮气，残氧量为3％-10％。
作为优选，步骤(6)中，包装所用包材，采用铝塑包材。
作为优选，步骤(1)～(6)全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，优选为在十万级GMP车间中进行，温度为18-26℃，湿度为25-40％。
作为优选，步骤(6)中，所述基于植物乳杆菌的组合物的水分含量为2-5％，水分活度为0.1-0.4aW。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、赤藓糖醇、菊粉、维生素C进行复配。除可发挥植物乳杆菌1701的功能外，白芸豆提取物、菊粉可起到额外的辅助作用；赤藓糖醇可在混合、包装等过程中维持组合物的低水分、低水分活度，有利于植物乳杆菌1701的活性稳定；维生素C可提供良好的口味并补充人体所需的营养；
(2)本发明的组合物中所采用的植物乳杆菌1701兼具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖；此外，植物乳杆菌1701灭活后也具有减肥功能，因此产品稳定性和保质期更长；
(3)在本发明的制备方法中，将除植物乳杆菌冻干粉外的原料通过沸腾制粒技术进行制粒，可显著改善组合物口感，若采用条包灌装机进行包装，则还可显著改善组合物的灌装性能；
(4)本发明所选用的植物乳杆菌冻干粉，采用生物工程恒pH高密度发酵技术、冷冻干燥技术、粉碎过筛工艺所得，具有活菌数高，水分含量低、水分活度低，粒径分布合理，与其他物料的混合性能良好等特点；
(5)本发明在制备植物乳杆菌冻干粉的过程中，采用恒pH高密度发酵技术，对发酵pH进行调控，当发酵过程pH控制于pH4.5-5.6时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍；再配合本发明采用的菌株保护剂、冷冻干燥工艺，所得植物乳杆菌冻干粉中活菌数可达2.3×1011CFU/g，水分含量可达3.11％，水分活度可达0.19aW；
(6)通过动物实验表明，本发明的组合物能够降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖；此外，本发明的组合物采用铝塑材料进行充氮气包装，可以很好的保持组合物的低水分、低水分活度、低氧环境，进而有利于保持植物乳杆菌1701的活性稳定。
附图说明
图1为本发明菌株的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。
图2为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左侧两图为对照商业菌株的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株植物乳杆菌1701(图中标示为植物乳杆菌WHH1701)的黏附实验镜检结果图。
图3为Wistar大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图4为Wistar大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图5为Wistar大鼠肝脏重和脏器比的变化。A图为肝脏重，B图为脏器比。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图6为Wistar大鼠脂肪重和体脂比的变化。A图为脂肪重，B图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图7为Wistar大鼠血清瘦素的变化。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图8为Wistar大鼠血脂四项的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯，C图为高密度脂蛋白，D图为低密度脂蛋白。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种基于植物乳杆菌的组合物，包括植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物2-11份、菊粉 20-40份、赤藓糖醇40-60份、维生素C 0.05-0.3份。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为 1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备：所述培养基为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；调整其pH为6.5±0.2；
2)菌株保护剂的制备：所述菌株保护剂的配方为脱脂乳80g/L、海藻糖100g/L、甘油20g/L；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h，发酵过程pH控制于pH5.0-5.6；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，离心转速4,000-10,000rpm，离心时间3-10min；
5)将离心产物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，筛网选择15-80目标准筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
一种基于植物乳杆菌1701的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取各原料备用。
(2)将除植物乳杆菌冻干粉外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料，待用；若各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％，则加入赤藓糖醇，使重量之和达到总配方用料量的2％，再进行混合；
(3)将除植物乳杆菌冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；混合转速控制在15-35rpm，优选30rpm，混合时间控制在10-20min，优选15min；
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；沸腾制粒过程采用粘合剂，所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种；沸腾制粒时，进风温度85-95℃，排风变频50％-80％，物料温度50-60℃，雾化压力2.5-3.5bar，喷浆供浆泵转速50-80rpm；沸腾制粒后产物进行过筛，筛网选择15-40目标准筛；
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在15-35rpm，优选30rpm，混合时间控制在10-20min，优选15min；
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装，即得基于植物乳杆菌的组合物；包装时应该充入氮气，残氧量控制在3％-10％；包装所用包材，采用铝塑包材；所述基于植物乳杆菌的组合物的水分含量控制在2-5％，水分活度控制在0.1-0.4aW。
步骤(1)～(6)全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在18-26℃，湿度控制在25-40％。
实施例1
本发明所提供的菌株经鉴定属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为1701，于2019 年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC No.18728。
本发明所提供的菌株是发明人从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离得到。
本发明菌株植物乳杆菌1701的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色、不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起的菌落。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈长杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50CHL系统。表1中列出了本发明菌株植物乳杆菌1701菌株的API 50CHL测试的结果。
表1 API 50结果
Figure BDA0002526899060000081
Figure BDA0002526899060000091
生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例2
本发明植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS) 经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS 溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、4h、8h后菌数的变化。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0×100％。
N1为菌株孵育后活菌数，N0为菌株孵育0h活菌数。
结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％；在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％，与具有优秀耐受特性的商业菌株相似。
表2耐受性结果
Figure BDA0002526899060000092
Figure BDA0002526899060000101
实施例3
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。
于光学显微镜下进行观察，结果如表3和图2所示，植物乳杆菌1701的单细胞黏附数达4.90±0.65，显著优于对照商业菌株(2.58±0.36，1.46±0.25)。
表3黏附性结果
Figure BDA0002526899060000102
与对照商业菌相比，**：p<0.01。
实施例4
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用Wistar大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发Wistar大鼠肥胖症。同时灌胃植物乳杆菌1701菌株菌粉(活菌数1×107-1×109CFU/mL)和植物乳杆菌1701菌株灭活菌粉(菌数1×109CFU/mL，105℃处理10min)，其间每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测Wistar大鼠体重、附睾和肾周脂肪重量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功能。
将健康的SPF级雄性Wistar大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为6 组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，其配伍、主要营养成分及能量如表4、表5和表6所示。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，组成如表5所示，总能：4334kcal/kg。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型；
实验组1：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×107CFU/d；
实验组2：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×108CFU/d；
实验组3：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；
实验组4：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明灭活菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d。
表4基础饲料组成
Figure BDA0002526899060000111
表5高脂饲料组成
Figure BDA0002526899060000112
表6基础饲料和高脂饲料基本营养和能量组成
Figure BDA0002526899060000121
试验期间，每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行监测和记录；试验结束后，对Wistar 大鼠进行称重，用1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血的方法获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4000rpm，4℃离心15min，取上清，用ELISA 试剂盒检测血清中瘦素、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，称重，计算脏器比和体脂比。
由图3可知，与对照组相比，模型组第2到第10周体重显著高于对照组(p<0.05， p<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，实验组3在第6到第10周大鼠体重显著低于模型组(p<0.05，p<0.01)，总增重显著低于模型组(p<0.01)；实验组1、实验组2、实验组4在第7到第10周大鼠体重显著低于模型组(p<0.05)，总增重显著低于模型组(p<0.01)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在 1×109CFU/d能够显著降低体重、控制体重增加，具有减肥功能。
由图4可知，与模型组相比，不同处理组大鼠摄食量和摄入能量没有显著性差异，说明植物乳杆菌1701菌株不是通过降低大鼠摄食量和摄入能量来减轻体重。
由图5可知，与模型组相比，对照组肝脏重和脏器比均显著低于模型组(p<0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组((p<0.01)，实验组4大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组(p<0.01，p<0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在 1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低肥胖个体肝脏重量，减少肝脏脂肪堆积。
由图6可知，与模型组相比，对照组脂肪重和体脂比均显著低于模型组(p<0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠脂肪重显著低于模型组((p<0.05)，实验组3大鼠体脂比显著低于模型组((p<0.01)，实验组4大鼠脂肪重和体脂比显著低于模型组(p<0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在 1×109CFU/d能够显著降低体内脂肪堆积，减轻体重。
由图7可知，与模型组相比，对照组血清瘦素水平显著低于模型组(p<0.01)；实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清瘦素水平显著低于模型组(p<0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
由图8A可知，与模型组相比，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清总胆固醇水平显著低于模型组(p<0.01)。由图8B可知，与模型组相比，对照组、实验组 1、实验组2、实验组3、实验组4血清甘油三酯水平显著低于模型组(p<0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d 能够显著降低血脂水平。
总之，植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低脏器比和体脂比，减少血清瘦素，降低血脂，是一株具有减肥功能的新菌株。
实施例5
一种基于植物乳杆菌的组合物，包括植物乳杆菌冻干粉8份、白芸豆提取物11份、菊粉40 份、赤藓糖醇40.95份、维生素C 0.05份。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×109CFU/g。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备：所述培养基为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏13g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨7g、酵母粉6g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.2g，水1000mL；调整其pH为 6.5；
2)菌株保护剂的制备：所述菌株保护剂的配方为脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L；
3)以5％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为38℃，发酵时间为15h，发酵过程pH控制于pH5.0；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，离心转速5,000rpm，离心时间8min；
5)将离心产物与菌株保护剂以1:1.5的重量比混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，筛网选择15目标准筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
一种基于植物乳杆菌的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用；
(2)将维生素C 0.05份与赤藓糖醇1.95份混合均匀，得到混合小料；
(3)将白芸豆提取物11份、菊粉40份、赤藓糖醇39份与步骤(2)所得混合小料一起混合均匀，得到混合半成品；混合转速控制在20rpm，混合时间控制在20min；
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；沸腾制粒过程采用粘合剂，所述粘合剂为纯水；沸腾制粒时，进风温度85℃，排风变频80％，物料温度50℃，雾化压力2.5bar，喷浆供浆泵转速80rpm；沸腾制粒后产物进行过筛，筛网选择20目标准筛；
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉8份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在20rpm，混合时间控制在20min；
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装，即得基于植物乳杆菌的组合物；包装时应该充入氮气，残氧量控制在5％；包装所用包材，采用铝塑包材；所述基于植物乳杆菌的组合物的水分含量控制在5％，水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)～(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在26℃，湿度控制在40％。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测，所得检测结果见表7。
表7实施例5所得组合物及其内容物检测结果
Figure BDA0002526899060000141
实施例6
一种基于植物乳杆菌的组合物，包括植物乳杆菌冻干粉4份、白芸豆提取物6份、菊粉40份、赤藓糖醇49.9份、维生素C 0.1份。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为2×1011CFU/g。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备：所述培养基为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏10g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、酵母粉5.5g、醋酸钠4g、柠檬酸氢二铵1.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.23g，水1000mL；调整其 pH为6.5；
2)菌株保护剂的制备：所述菌株保护剂的配方为脱脂乳80g/L、海藻糖100g/L、甘油20g/L；
3)以10％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵时间为16h，发酵过程pH控制于pH5.3；
4)发酵结束后取发酵产物，离心；离心转速8,000rpm，离心时间10min；
5)将离心产物与菌株保护剂以1:2的重量比混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，筛网选择60目标准筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
一种基于植物乳杆菌的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用；
(2)将维生素C 0.1份与赤藓糖醇1.9份混合均匀，得到混合小料；
(3)将白芸豆提取物6份、菊粉40份、赤藓糖醇48份与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；混合转速控制在30rpm，混合时间控制在20min；
(4)将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；沸腾制粒过程采用粘合剂，所述粘合剂为纯水；沸腾制粒时，进风温度90℃，排风变频80％，物料温度50℃，雾化压力3bar，喷浆供浆泵转速70rpm；沸腾制粒后产物进行过筛，筛网选40目标准筛；
(5)将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉4份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在30rpm，混合时间控制在20min；
(6)将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装，即得成品；包装时应该充入氮气，残氧量控制在1％；包装所用包材，采用铝塑包材；所述基于植物乳杆菌的组合物的水分含量控制在2％，水分活度控制在0.3aW。
步骤(1)～(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在20℃，湿度控制在20％。
所得组合物及其内容物进行关键指标检测，所得检测结果见表8。
表8实施例6所得组合物及其内容物检测结果
Figure BDA0002526899060000161
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于，包括植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、菊粉、赤藓糖醇、维生素C；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
2.如权利要求1所述的一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于，按重量份包括植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物2-11份、菊粉20-40份、赤藓糖醇40-60份、维生素C0.05-0.3份。
3.如权利要求1或2所述的一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
4.如权利要求1或2所述的一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1）培养基的制备；
2）菌株保护剂的制备；
3）以5%-10%接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养；
4）发酵结束后取发酵产物，离心；
5）离心产物与菌株保护剂混合；
6）冻干；
7）冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
5.如权利要求4所述的一种基于植物乳杆菌的组合物，其特征在于：
步骤1）中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2；和/或
步骤2）中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L；和/或
步骤3）中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h；和/或
步骤3）中，发酵pH为4.5-5.6；和/或
步骤4）中，离心转速4,000-10,000rpm，离心时间3-10min；和/或
步骤5）中，所述离心产物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合；和/或
步骤7）中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
6.一种制备如权利要求1~5之一所述基于植物乳杆菌的组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取各原料备用；
（2）将除植物乳杆菌冻干粉外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀，得到混合小料，待用；
（3）将除植物乳杆菌冻干粉外的剩余原料与步骤（2）所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；
（4）将步骤（3）所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；
（5）将步骤（4）所得沸腾制粒半成品与植物乳杆菌冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；
（6）将步骤（5）所得总混合半成品进行包装，即得基于植物乳杆菌的组合物。
7.如权利要求6所述的一种制备基于植物乳杆菌的组合物的方法，其特征在于，步骤（2）中，若各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%，则加入赤藓糖醇，使重量之和达到总配方用料量的2%，再进行混合。
8.如权利要求6所述的一种制备基于植物乳杆菌的组合物的方法，其特征在于，步骤（4）中，沸腾制粒过程采用粘合剂；所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种。
9.如权利要求6所述的一种制备基于植物乳杆菌的组合物的方法，其特征在于：
步骤（3）中，混合转速为15-35rpm，混合时间为10-20min；和/或
步骤（4）中，沸腾制粒时，进风温度85-95℃，排风变频50%-80%，物料温度50-60℃，雾化压力2.5-3.5bar，喷浆供浆泵转速50-80rpm；和/或
步骤（4）中，过筛时，筛网选择15-40目标准筛；和/或
步骤（5）中，混合转速为15-35rpm；混合时间为10-20min；和/或
步骤（6）中，包装时，充入氮气，残氧量为3%-10%；
步骤（1）~（6）全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18～26℃，湿度为25~40％。
10.如权利要求6所述的一种制备基于植物乳杆菌的组合物的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述基于植物乳杆菌的组合物的水分含量为2-5%，水分活度为0.1-0.4aW。
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