CN111714572B - 一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品领域，公开了一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法，本发明将植物乳杆菌冻干粉、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C、硬脂酸镁进行复配，通过使用直压型辅料，采用直压技术，可减少造粒等工艺流程、降低能耗、提高产能，还可显著改善压片性能。该益生菌片剂可降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖。此外片剂中所含植物乳杆菌1701还兼具有良好的耐受性和黏附性，并且该菌株灭活后仍具有减肥功能，因此含有该菌株的产品稳定性和保质期更长。

Description

一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法。
背景技术
肥胖主要是由于机体能量代谢平衡发生紊乱，导致能量摄入大于能量消耗，引起体内脂肪过多积累，所产生的代谢类疾病。肥胖不仅受遗传、环境、代谢、生理等多因素影响，同时还与高血脂、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、高尿酸血症、非酒精性脂肪肝、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病紧密相关。目前，肥胖及其并发症已经成为全球范围内主要的公共卫生问题，其不仅影响个体的外表体征，还对人类的健康造成着严重的危害。
目前，大量研究表明肥胖与肠道微生物菌群有着密切的联系。而益生菌能够通过其良好的耐受性和黏附性，定植于肠道，达到调节肠道菌群结构，维持肠道菌群平衡，从而发挥出相应的益生功能。肥胖会引起体内脂肪堆积，甘油三酯、总胆固醇的含量升高，而甘油三脂、胆固醇水平偏高，会增加肥胖相关疾病高血脂、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝的患病风险。研究表明，益生菌能够降低高脂饮食诱导的肥胖模型鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，改善脂质代谢，减少体内脂肪堆积，降低体重，减少肥胖相关疾病患病风险。
已有商业化益生菌菌株能够减少脂肪堆积或降低体重。森永乳业的短双歧杆菌B-3有助于降低亚肥胖成年人的体脂水平。杜邦丹尼斯克的动物双歧杆菌B420能够控制体重，增加AKK(Akkermansia muciniphila)菌的定植。雪印乳业的加氏乳杆菌SP株具有减少内脏脂肪积累，减脂、控制体重功效。可尔必思的噬淀粉乳杆菌CP1563能够通过减少胆固醇含量，改善脂质代谢，达到降低体脂的功效。然而，这些不同益生菌的作用是具有菌株特异性的，并且个体肠道菌群及生理状态差异明显，同一种益生菌不一定能够对所有个体都适用。因此，仍然需要开发有更多具有控制体重、减少脂肪堆积的其它益生菌新菌株来填补现有菌株的空白(虽然多数新菌株自身也具有特异性，但是可能存在这种情况：现有菌株对某个体无效而新菌株却刚好有效)。
另一方面，如何更合理地将益生菌与其他成分进行复配以充分发挥其功效，以及如何改进制备工艺制备具有减肥降脂功能的产品，也值得进一步的探索研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂及其制备方法，本发明将植物乳杆菌冻干粉、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C、硬脂酸镁进行复配，通过使用直压型辅料，采用直压技术，可减少造粒等工艺流程、降低能耗、提高产能，还可显著改善压片性能。所得片剂含有植物乳杆菌冻干粉活菌数为1×107CFU/片-1×1012CFU/片，能够降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖。
本发明的具体技术方案为：一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂，包括植物乳杆菌冻干粉、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁。
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离所得，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
本发明配方中，以特定的植物乳杆菌1701为主要功能物，茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素、硬脂酸镁为辅料。其中，植物乳杆菌1701是一种从中国西藏地区采集的传统发酵食品中所分离得到的益生菌菌株，经过动物实验验证，其具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖，而且，在其灭活后也具有减肥功能。此外，在动物实验过程中，未发现实验动物死亡、精神不振、食欲不振等不良状态，说明该菌种具有较高的安全性。
具体而言，上述植物乳杆菌1701具有以下优点：
(1)具备良好的耐酸耐胆盐特性：在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％，在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％；良好的耐酸性使植物乳杆菌1701在制备冻干粉和片剂的过程中，特别是在制备冻干粉时的发酵过程中，能适应更宽的pH范围，从而使本发明的产品具有更高的活菌含量；
(2)具备良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达4.90±0.65，是对照商业菌株的1.9倍以上；
(3)活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重；
(4)活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清总胆固醇和甘油三酯水平，降低血脂；
(5)活菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×107CFU/d-1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.50-8.69％，脂肪重量降低10.53-14.86％，体脂比降低4.79-10.06％；
(6)灭活菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.92％，脂肪重量降低12.22％，体脂比降低7.24％；
(7)活菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量：服用剂量在1×107CFU/d-1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达12.34-14.63％，脏器比降低4.52-9.04％；
(8)灭活菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量。服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达11.68％，脏器比降低6.38％。
茶叶茶氨酸是茶叶中含量最高的氨基酸，占到茶叶中总氨基酸含量的50％以上，以游离形式大量存在于茶树的新叶及幼根中，有降低血压、抑制肿瘤、舒缓神经、抗疲劳、降脂减肥等作用。原国家卫生计生委在2014年第15号公告中批准茶叶茶氨酸为新食品原料，说明其作为普通食品的安全属性。现代科学研究表明，茶叶茶氨酸可以通过促进降低生物体内的胆固醇含量，达到降脂减肥的效果。
魔芋是原国家卫生计生委在2004年第17号公告中批准为普通食品的一种较为新型的食品原料。魔芋功能性成分为天然高分子葡甘聚糖，含量占到魔芋的60％，这种物质具有强大的吸水性、膨胀力和粘韧度，在溶于水时，会形成粘稠的溶胶，能有效吸附胆固醇、胆汁酸，并抑制肠道对胆固醇的重吸收，同时，其强大的膨胀特性，会填充肠胃，消除饥饿感，而且自身不会被人体消化吸收，因而会表现出非常好的降脂减肥功能。现代科学研究表明，魔芋能明显降低体重、内脏器周边脂肪含量，同时明显降低血脂含量。
维生素C是维持生物正常生长发育必需的一类微量营养物质，天然存在于新鲜蔬菜、水果中，有清爽愉悦的酸味，是非常良好的食品酸味来源，在改善口味的同时，可以补充人体所需的营养。
硬脂酸镁是现代食品工业中，特别是片剂生产中最常用的辅料之一，能够改变物料颗粒间的结合力，具有助留作用及润滑作用。
作为优选，所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖和直压型微晶纤维素中的一种或多种。
作为优选，所述片剂按重量份包括植物乳杆菌冻干粉1-10份、茶叶茶氨酸2-10份、魔芋粉20-40份、直压型辅料40-80份、维生素C 0.05-0.3份和硬脂酸镁0.2-1份。
作为优选，所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
一种益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取各原料备用；
(2)将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料；
(3)将除硬脂酸镁外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到初混合物；
(4)将步骤(3)所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；
(5)将步骤(4)所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；
(6)将步骤(5)所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
本发明采用粉末直压技术，是将主要成分及合适的辅料混合均匀后，不经过湿法制粒、干法制粒、一步制粒等制粒技术而直接压制成片的一种方法，具有工艺简单、效率高、成本低的特点。直压型辅料是粉末直压技术的核心所在，其必须具有良好的流动性、可压性、润滑性，以及广泛的适应性和重现性。辅料直接关系到剂型的压片压力、压片效率等压片过程中的性能以及片剂的硬度、脆碎度等特性。
作为优选，步骤2)中，各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％时，加入直压型辅料，使重量之和达到总配方用料量的2％，再进行混合。
作为优选，步骤(3)中，混合转速控制在15～35rpm，混合时间控制在10～20min。
作为优选，步骤(4)中，混合转速控制在10～25rpm，混合时间控制在5～20min。
作为优选，步骤(5)中，压片过程中压片压力控制在7KN-18KN之间。
作为优选，步骤(1)～(6)全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18～26℃，湿度为25～40％。
作为进一步优选，步骤(3)中，混合转速控制在30rpm，混合时间控制在15min。
作为进一步优选，步骤(4)中，混合转速控制在15rpm，混合时间控制在10min。
作为优选，步骤(6)所得益生菌片剂的水分控制在2-5％，水分活度控制在0.1-0.4aW。
作为优选，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备；
2)菌株保护剂的制备；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养；
4)发酵结束后取发酵产物，离心；
5)离心产物与菌株保护剂混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
本发明采用生物工程恒pH高密度发酵技术、冷冻干燥技术、粉碎过筛工艺制备物乳杆菌冻干粉，获得的冻干粉具有活菌数高，且水分含量低、水分活度低，能保证其中的植物乳杆菌的活性稳定，此外还具有粒径分布合理、与其他物料的混合性能良好等特点。
作为优选，步骤1)中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-801-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2。
作为优选，步骤2)中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L。
作为优选，步骤3)中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h。
作为优选，步骤3)中，发酵pH为4.5-5.6。
本发明采用的是高密度发酵工艺，需要对发酵pH进行调控。在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH4.5-5.6时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍。
作为优选，步骤4)中，离心转速4000-10000rpm，离心时间3-10min。
作为优选，步骤5)中，所述离心产物与菌株保护剂以1∶1.5-3的重量比混合。
作为优选，步骤7)中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明将植物乳杆菌1701、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C、硬脂酸镁复配。除可发挥植物乳杆菌1701的功能外，茶叶茶氨酸、魔芋粉可起到额外的辅助作用；直压型辅料能赋予组合物良好的可压性能；维生素C可提供良好的口味并补充人体所需的营养；硬脂酸镁可显著改善物料流动性、可压性。
(2)本发明采用的直压型辅料能赋予组合物良好的可压性能，从而可采用直接压片技术，可减少造粒等工艺流程、降低能耗、提高产能。
(3)本发明片剂中所采用的植物乳杆菌1701兼具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖的药品、保健品或健康食品；此外，本发明菌株灭活后也具有减肥功能，因此该菌株的产品形式更加丰富，其应用范围更广，产品稳定性和保质期更长。
(4)本发明所选用植物乳杆菌1701，采用生物工程恒pH高密度发酵技术、冷冻干燥技术、粉碎过筛工艺所得，具有活菌数高，低水分、低水分活度，粒径分布合理，与其他物料有良好的混合性能等特点。
(5)本发明植物乳杆菌1701在发酵过程中，采用恒pH高密度发酵技术，对发酵pH进行调控，当发酵过程pH控制于pH4.5-5.6时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍。再配合本发明采用的菌株保护剂、冷冻干燥工艺，所得植物乳杆菌1701活菌数达到2.3×1011CFU/g，水分含量达到3.11％，水分活度达到0.19aW。
(6)本发明片剂制作过程全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，可以很好的保持片剂的低水分、低水分活度环境，进而有利于保持植物乳杆菌1701的活性稳定；同时，由于益生菌产品活菌产品，成品无法进行杀菌，在GMP车间进行制作，可显著降低成品微生物污染的问题。
(7)本发明片剂成品采用内置干燥剂的高密度聚乙烯材料进行包装，可以很好的保持片剂的低水分、低水分活度环境，进而有利于保持植物乳杆菌1701的活性稳定，本发明通过动物实验表明，能够降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖。
附图说明
图1为本发明菌株的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。
图2为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左侧两图为对照商业菌株的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株植物乳杆菌1701(图中标示为植物乳杆菌WHH1701)的黏附实验镜检结果图。
图3为Wistar大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图4为Wistar大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图5为Wistar大鼠肝脏重和脏器比的变化。A图为肝脏重，B图为脏器比。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图6为Wistar大鼠脂肪重和体脂比的变化。A图为脂肪重，B图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图7为Wistar大鼠血清瘦素的变化。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图8为Wistar大鼠血脂四项的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯，C图为高密度脂蛋白，D图为低密度脂蛋白。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂，包括植物乳杆菌冻干粉1-10份、茶叶茶氨酸2-10份、魔芋粉20-40份、直压型辅料40-80份、维生素C 0.05-0.3份、硬脂酸镁0.2-1份。所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖、直压型微晶纤维素等常见具有直压性能的辅料单种或多种复合物。
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备：所述培养基为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；调整其pH为6.5±0.2；
2)菌株保护剂的制备：所述菌株保护剂的配方为脱脂乳80g/L、海藻糖100g/L、甘油20g/L；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h，发酵过程pH控制于pH5.0-5.6；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，离心转速4,000-10,000rpm，离心时间3-10min；
5)将离心产物与菌株保护剂以1∶1.5-3的重量比混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，筛网选择15-80目标准筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
一种上述益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用。
(2)将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料；各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％时，加入直压型辅料，使其达到总配方用料量的2％，再进行小料混合。
(3)将除硬脂酸镁外的各辅料与混合小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速控制在15～35rpm，优选30rpm，混合时间控制在10～20min，优选15min。
(4)将步骤3)所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在10～25rpm，优选15rpm，混合时间控制在5～20min，优选10min。
(5)将步骤4)所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力控制在7KN-18KN之间。
(6)将步骤5)所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
其中，步骤1)，2)，3)，4)，5)，6)中，操作过程全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在18～26℃，湿度控制在25～40％。所得成品水分、水分活度需要控制，水分控制在2-5％，水分活度控制在0.1-0.4aW。
实施例1
一种基于植物乳杆菌的益生菌片剂，包括植物乳杆菌1701冻干粉10份、茶叶茶氨酸5份、魔芋粉20份、直压型辅料63.95份、维生素C 0.05份、硬脂酸镁1份。所述植物乳杆菌1701冻干粉中的活菌数在3×109CFU/g。所述直压型辅料为直压型麦芽糖醇。
所述植物乳杆菌1701为从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离所得，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌1701的制备方法包括：
1)培养基的制备，所述培养基，为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏13g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨7g、酵母粉6g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-801mL、一水合硫酸锰0.2g，水1000mL；调整其pH为6.5。
2)菌株保护剂的制备，所述菌株保护剂配方为脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L。
3)以5％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为38℃，发酵时间为15h，发酵过程pH控制于pH5.0。
4)发酵结束后取发酵产物，离心；离心转速5,000rpm，离心时间8min。
5)离心产物与菌株保护剂混合，离心产物与菌株保护剂的混合重量比例为1∶1.5。
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌1701；筛网选择15目标准筛。
基于植物乳杆菌1701的益生菌片剂的制备：
(1)按照重量份配比称取各原料备用。
(2)将维生素C0.05份与直压型麦芽糖醇1.95份混合均匀，得到混合后小料；
(3)将植物乳杆菌1701 10份、茶叶茶氨酸5份、魔芋粉20份、直压型麦芽糖醇62份与混合后小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速控制在35rpm，混合时间控制在20min。
(4)将所得初混合物与硬脂酸镁1份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在25rpm，混合时间控制在20min。
(5)将所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力控制在16KN。
(6)将步所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
步(1)～(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在18℃，湿度控制在40％。所得成品水分、水分活度需要控制，水分控制在5％，水分活度控制在0.3aW。
所得片剂成品进行关键指标检测，所得检测结果如下：
实施例2
一种基于植物乳杆菌1701的益生菌片剂，包括植物乳杆菌1701冻干粉4份、茶叶茶氨酸10份、魔芋粉10份、直压型辅料75.5份、维生素C 0.2份、硬脂酸镁0.3份。所述植物乳杆菌1701活菌数在1×1011CFU/g。所述直压型辅料为直压型山梨糖醇。
所述植物乳杆菌1701为从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离所得，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌1701的制备方法包括：
1)培养基的制备，所述培养基，为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏10g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、酵母粉5.5g、醋酸钠4g、柠檬酸氢二铵1.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.23g，水1000mL；调整其pH为6.5。
2)菌株保护剂的制备，所述菌株保护剂配方为脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L。
3)以10％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵时间为16h，发酵过程pH控制于pH5.3。
4)发酵结束后取发酵产物，离心；离心转速8,000rpm，离心时间10min。
5)离心产物与菌株保护剂混合，离心产物与菌株保护剂的混合重量比例为1∶2。
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌1701；筛网选择60目标准筛。
益生菌片剂及其制备：
(1)按照重量份配比称取各原料备用。
(2)将维生素C 0.2份与直压型山梨糖醇1.8份混合均匀，得到混合后小料；
(3)将植物乳杆菌1701 4份、茶叶茶氨酸10份、魔芋粉10份、直压型山梨糖醇73.7份与混合后小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速控制在30rpm，混合时间控制在15min。
(4)将所得初混合物与硬脂酸镁0.3份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在15rpm，混合时间控制在10min。
(5)将所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力控制在14KN。
(6)将所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
步骤(1)-(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在20℃，湿度控制在30％。所得成品水分、水分活度需要控制，水分控制在3％，水分活度控制在0.25aW。
所得片剂成品进行关键指标检测，所得检测结果如下：
实施例3
本发明所提供的菌株经鉴定属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为1701，于2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.18728。
本发明所提供的菌株是发明人从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离得到。
本发明菌株植物乳杆菌1701的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色、不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起的菌落。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈长杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50CHL系统。表1中列出了本发明菌株植物乳杆菌1701菌株的API 50CHL测试的结果。
表1 API 50结果
生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例4
本发明植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、4h、8h后菌数的变化。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0×100％。
N1为菌株孵育后活菌数，N0为菌株孵育0h活菌数。
结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％；在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％，与具有优秀耐受特性的商业菌株相似。
表2耐受性结果
实施例5
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000 rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。
于光学显微镜下进行观察，结果如表3和图2所示，植物乳杆菌1701的单细胞黏附数达4.90±0.65，显著优于对照商业菌株(2.58±0.36，1.46±0.25)。
表3黏附性结果
菌株编号 黏附性(菌数/细胞数)
LGG 2.58±0.36
LcS 1.46±0.25
植物乳杆菌1701 4.90±0.65**
与对照商业菌相比，**：p＜0.01。
实施例6
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用Wistar大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发Wistar大鼠肥胖症。同时灌胃植物乳杆菌1701菌株菌粉(活菌数1×107-1×109CFU/mL)和植物乳杆菌1701菌株灭活菌粉(菌数1×109CFU/mL，105℃处理10min)，其间每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测Wistar大鼠体重、附睾和肾周脂肪重量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功能。
将健康的SPF级雄性Wistar大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为6组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，其配伍、主要营养成分及能量如表4、表5和表6所示。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，组成如表5所示，总能：4334kcal/kg。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型；
实验组1：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×107CFU/d；
实验组2：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×108CFU/d；
实验组3：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；
实验组4：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明灭活菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d。
表4基础饲料组成
原料名称 配方比(％) 原料名称 配方比(％)
鱼粉 6 维生素和矿物质 4.4
小麦 13 谷朊粉 2
玉米 41.6 石粉 1
麸皮 17 色拉油 2
豆粕 13
表5高脂饲料组成
原料名称 配方比(％) 原料名称 配方比(％)
基础维持鼠饲料 54.7 维生素和矿物质 2
蔗糖 15 磷酸氢钙 2
猪油 15 胆固醇 1
酪蛋白 10 胆酸钠 0.3
表6基础饲料和高脂饲料基本营养和能量组成
试验期间，每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行监测和记录；试验结束后，对Wistar大鼠进行称重，用1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血的方法获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4000rpm，4℃离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中瘦素、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，称重，计算脏器比和体脂比。
由图3可知，与对照组相比，模型组第2到第10周体重显著高于对照组(p＜0.05，p＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，实验组3在第6到第10周大鼠体重显著低于模型组(p＜0.05，p＜0.01)，总增重显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组4在第7到第10周大鼠体重显著低于模型组(p＜0.05)，总增重显著低于模型组(p＜0.01)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重、控制体重增加，具有减肥功能。
由图4可知，与模型组相比，不同处理组大鼠摄食量和摄入能量没有显著性差异，说明植物乳杆菌1701菌株不是通过降低大鼠摄食量和摄入能量来减轻体重。
由图5可知，与模型组相比，对照组肝脏重和脏器比均显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组((p＜0.01)，实验组4大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组(p＜0.01，p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低肥胖个体肝脏重量，减少肝脏脂肪堆积。
由图6可知，与模型组相比，对照组脂肪重和体脂比均显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠脂肪重显著低于模型组((p＜0.05)，实验组3大鼠体脂比显著低于模型组((p＜0.01)，实验组4大鼠脂肪重和体脂比显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体内脂肪堆积，减轻体重。
由图7可知，与模型组相比，对照组血清瘦素水平显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清瘦素水平显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
由图8A可知，与模型组相比，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清总胆固醇水平显著低于模型组(p＜0.01)。由图8B可知，与模型组相比，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清甘油三酯水平显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血脂水平。
总之，植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低脏器比和体脂比，减少血清瘦素，降低血脂，是一株具有减肥功能的新菌株。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (11)

1.植物乳杆菌在制备用于预防和治疗肥胖的药物中的应用，其特征在于，所述药物为益生菌片剂，由植物乳杆菌冻干粉、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁制得；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
2.一种用于预防和治疗肥胖的基于植物乳杆菌的益生菌片剂，其特征在于，由植物乳杆菌冻干粉、茶叶茶氨酸、魔芋粉、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁制得；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
3.如权利要求2所述的益生菌片剂，其特征在于，所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖和直压型微晶纤维素中的一种或多种。
4. 如权利要求2所述的益生菌片剂，其特征在于，按重量份由植物乳杆菌冻干粉1-10份、茶叶茶氨酸2-10份、魔芋粉20-40份、直压型辅料40-80份、维生素C 0.05-0.3份和硬脂酸镁0.2-1份制得。
5.如权利要求2或4所述的益生菌片剂，其特征在于，所述植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
6.一种如权利要求2~5之一所述益生菌片剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取各原料备用；
（2）将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀，得到混合小料；
（3）将除硬脂酸镁外的剩余原料与步骤（2）所得混合小料混合均匀，得到初混合物；
（4）将步骤（3）所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；
（5）将步骤（4）所得总混合半成品用压片机压片，即得益生菌片剂。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中，各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%时，加入直压型辅料，使重量之和达到总配方用料量的2%，再进行混合；和/或
步骤（3）中，混合转速控制在15~35rpm，混合时间控制在10~20min；和/或
步骤（4）中，混合转速控制在10~25rpm，混合时间控制在5~20min；和/或
步骤（5）中，压片过程中压片压力控制在7kN-18kN之间；和/或
步骤（1）~（5）全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18～26℃，湿度为25~40％。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中，混合转速控制在30rpm，混合时间控制在15min；和/或
步骤（4）中，混合转速控制在15rpm，混合时间控制在10min。
9.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）所得益生菌片剂的水分控制在2-5%，水分活度控制在0.1-0.4aW。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1）培养基的制备；
2）菌株保护剂的制备；
3）以5%-10%接种量将植物乳杆菌接种于发酵基质中进行发酵培养；
4）发酵结束后取发酵产物，离心；
5）离心产物与菌株保护剂混合；
6）冻干；
7）冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉。
11. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于：
步骤1）中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2；和/或
步骤2）中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L；和/或
步骤3）中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h；和/或
步骤3）中，发酵pH为4.5-5.6；和/或
步骤4）中，离心转速4000-10000rpm，离心时间3-10min；和/或
步骤5）中，所述离心产物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合；和/或
步骤7）中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
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