KR101841909B1

KR101841909B1 - 누룩과 혼합곡물을 이용한 유산균의 배양방법

Info

Publication number: KR101841909B1
Application number: KR1020170041361A
Authority: KR
Inventors: 정수희; 정욱
Original assignee: 비타민하우스(주)
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-03-26

Abstract

본 발명은 렌틸콩, 현미, 찰보리, 통밀, 팥, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및, 옥수수로 이루어진 VH14곡물을 분쇄한 후 혼합하고, 상기 전통누룩 및 물을 배지의 기질로 하여 유산균인 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus KCTC 3545), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri KCTC 3594) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum KCTC 3112) 배지에 접종한 후 20℃에서 24시간 당화시킨 후 오토클레이브( autoclave )에서 121℃에서 15분간 가열하여 진균류를 비활성화시키는 과정을 갖는 유산균의 배양방법에 관한 발명이다.

Description

누룩과 혼합곡물을 이용한 유산균의 배양방법 {Culture method of lactic acid bacteria using nuruk and mixed grains}

본 발명은 렌틸콩, 현미, 찰보리, 통밀, 팥, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및 옥수수로 이루어진 혼합곡물(이하 "VH14곡물" 이라 약칭한다.)과 전남지방의 전통누룩(송학곡자)를 이용하여 곡물의 당화를 유도하였고, VH14곡물의 중량에 따른 누룩의 최적첨가비율을 통해 누룩에 포함된 야생효모에 의한 알코올 발효를 최대한 억제하면서 상기 VH14곡물 5 ~ 30중량%, 전통누룩 1 ~ 10중량 및 물69 ~ 85중량%를 이용하여 20℃에서 24시간 당화를 진행한 후 autoclave (121℃, 15분간) 하여 진균류를 비활성화시킨 다음 유산균을 접종하여 37℃에서 36시간 동안 유산균을 배양 후 환경 안정성과 기능성이 증대된 혼합곡물 유산균 제제를 얻는 유산균의 배양방법에 관한 발명이다.

유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 미생물을 말하며, 다른 미생물과 비교적 잘 공생하는 특징이 있고, 치즈, 발효유, 유산균 음료 등의 유제품이나 김치, 야채절임 등의 각종 발효식품의 제조에도 이용되고 있으며, 최근에는 정장효과 등의 각종 생리기능이 명확하게 확인되어 유산균의 균사 그 자체나 각종 유산균 배양물을 건강식품이나 의약품 등의 소재로서 다양하게 이용되고 있고, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 미생물로, 발효 음식에 풍부하게 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양 성분으로 만드는 역할을 담당하며, 인간을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 '프로바이오틱스' 라고도 한다.

유산균은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통상 혐기성균으로 유산균은 크게 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스톡(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 그리고 페디오코커스 (Pediococcus)로 나뉜다.

최근 건강에 대한 인식이 날로 늘어가고, 자연식품에 대한 선호라든가, 항생제의 남용으로 인한 항생제의 내성문제 등으로 인한 프로바이오틱스의 사용이 권장되고 있어 생균 원료를 사용하여 제제화하기 위한 프로바이오틱 균주의 자체개발과 생산기술축적이 요구된다.

국내공개특허 2012-8490호에는 유산균 수를 안정하게 유지할 수 있는 유산균 배양물을 얻기 위한 유산균의 배양방법이 개시되어 있으며, 국내등록특허 제10-1561002호에는 유산균 중 특히, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 과 락토바실러스(Lactobacillus) 그리고 스트렙토코커스(Streptococcus) 유산균의 빠른 증식을 도울 수 있으며 저비용 고효율의 배지 구성이 가능한 한방 배지에 관한 기술이 개시되어 있으며, 국내등록특허 제10-1437391호에는 이스트추출물, 무수포도당을 첨가된 배지에 유산균인 락토바실러스 브레비스(L. brevis)를 배양하여 유산균 배양액을제조하는 공정이 개시되어 있다. 또한, 국내공개특허공보 제2016-97419호에는 시금치 추출물, 단호박 추출물, 양배추 추출물, 비피더스 배양 상등액 및 복합유화액을 유산균 증식제로 포함하는 유산균배양액 및 이를 함유하는 유산균 발효유, 유산균 분말과 그들의 제조방법에 관한 기술이 개시되어 있다.

국내공개특허 2012-8490호 국내등록특허 제10-1561002호 국내등록특허 제10-1437391호 국내공개특허공보 제2016-97419호 한국등록특허 제10-1631362호 한국등록특허 제10-0871518호 국내공개특허공보 제2016-81189호 국내공개특허공보제2016-50342호

본 발명자들은 렌틸콩, 현미, 찰보리, 통밀, 팥, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및 옥수수로 이루어진 VH14곡물을 배지의 기질로 제공하는데 있다. 또한, 혼합곡물의 경우 미생물의 증식에 필요한 탄소원 중 대부분이 전분질로 유산균의 기질로 직접 사용하기 힘든 저장당 형태로 구성되어 있어 유산균의 최적증식 배지인 MRS 배지와 달리 직접 이용 가능한 단당류의 부재를 해결하기 위하여 전남지방의 전통누룩(송학곡자)을 사용하는데 있다.

또한, 본 발명의 기질은 VH14곡물 5 ~ 30중량%, 전통누룩 1 ~ 10% 및 물 69 ~ 85중량%로 조성되며, 20℃에서 24시간 당화를 진행한 후 오토클레이브( autoclave )에서 121℃ 15분간 가열하여 진균류를 비활성화시키는데 있다. 또한, 본 발명에서의 유산균은 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus KCTC 3545), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri KCTC 3594) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum KCTC 3112)을 접종함에 있다.

삭제

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 렌틸콩, 현미, 찰보리, 통밀, 팥, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및 옥수수로 이루어진 VH14곡물을 분쇄한 후 혼합하는 단계, 유산균인 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus KCTC 3545), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri KCTC 3594) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum KCTC 3112)을 준비하는 단계, 상기 VH14곡물 5 ~ 30중량%와 상기 전통누룩 1 ~ 10중량% 및 물 69 ~ 85중량%로 조성된 기질을 제조하는 단계, 상기 기질을 갖는 배지에 상기 유산균을 접종한 후 20℃에서 24시간 당화시키는 단계, 당화시킨 후 오토클레이브( autoclave )에서 121℃에서 15분간 가열하여 진균류를 비활성화시키는 단계 등을 갖는데 있다.

삭제

본 발명의 배양방법에 따라 유산균을 배양한 후 배양액을 원심 분리하여 균체를 회수한 후 -80℃ 초저온 냉동고에서 12시간 동결 후 동결건조기(일신, MCFD5520, KR)로 실온(25 ~ 29℃)에서 응축기 온도 -80℃, 압력 5 mmTorr 이하의 조건에서 72시간 동결건조하고 총균수를 측정한 결과 천연배지로 사용된 곡물이 유산균 원말에서 동결보호제로 작용하여 유산균의 동결에 따른 손상을 완화시키는 효과가 나타났으며, 특히 Lactobacillus reuteriKCTC 3594와 Lactobacillus fermentumKCTC 3112의 동결건조에 대한 저항성 증진에 효과가 큰 것으로 나타났다.

또한, 천연 곡물발효 배지는 유산균의 동결건조에 대한 저항성을 증가시켜주어 유산균의 생존율을 보장하여 장기보존에 유익한 것으로 확인되었다.

삭제

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 렌틸콩, 팥, 현미, 통밀, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및, 옥수수로 이루어진 VH14곡물을 분쇄한 후 혼합하는 단계,

유산균인 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus KCTC 3545), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri KCTC 3594) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum KCTC 3112)을 준비하는 단계,

상기 VH14곡물 5 ~ 30중량%와 상기 전통누룩 1 ~ 10% 및 물 69 ~ 85중량%로 조성된 기질을 제조하는 단계,

상기 기질을 갖는 배지에 상기 유산균을 접종한 후 20℃에서 24시간 당화시키는 단계, 당화시킨 후 오토클레이브(autoclave)에서 121℃ 15분간 가열하여 진균류를 비활성화시키는 단계를 갖는 데 특징이 있다.

미생물의 생육에는 기본적으로 탄소원과 질소원이 요구되며 그 중 질소원으로 렌틸콩은 단백질과 식이섬유 성분을 포함하며 비타민과 미네랄 등의 영양성분과 항산화물질이 풍부하고 소화흡수율도 우수하다 또한, 항산화 및 항암작용·노화예방·면역력 강화·변비예방에 도움이 되며, 콜레스테롤 수치를 낮추어 심혈관계 질환을 예방하는 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 고단백 저칼로리로 다이어트에도 효과적이며, 다량의 철분과 엽산이 들어있어 빈혈에도 좋다.

그리고 탄소원으로 현미는 수확한 벼를 건조, 탈곡한 후 고무 롤러로 된 기계로 왕겨를 벗긴 쌀로서 당질(녹말)이 대부분을 차지하고, 단백질이나 지방은 많지 않다. 쌀겨 층은 소화가 되지 않는 단점이 있지만 식이섬유를 많이 가지고 있어 현미를 먹게 되면 변비 예방과 유해물질 배출 등에 도움을 줄 수 있다. 보리와 통밀은 식이섬유를 다량 함유하며 혈당 조절에 도움을 줄 수 있다. 이와 같이 곡류와 두류는 영양학적으로 부족하기 쉬운 영양소를 서로 보완해주는 효과가 있다. 콩에는 필수아미노산 중 메티오닌과 시스테인 등 함황 아미노산이 부족한 반면, 쌀에는 라이신과 성장기 어린이에게 필요한 아르기닌이 부족하다. 콩과 쌀을 함께 섭취하면 서로에게 부족한 아미노산을 보완해 줄 수 있고 풍부한 식이섬유는 유산균 증식에 이로움을 줄 수 있는 prebiotics로 작용할 수 있어 기존의 유산균 증식 배지인 MRS의 탄소원과 질소원을 대체하기 위하여 곡물을 Table 1과 같이 조합하였으며 주력 4종 곡물과 미량 10종 곡물을 멀러로 분쇄한 다음 Table 1의 비율로 혼합하였다.

Table 1. VH14곡물 배지의 종류 및 조성

Media	Composition(origin)	Concentration(%)
VH14곡물	렌틸콩(캐나다)	30
	현미(국산)	20
	찰보리(국산)	15
	통밀(국산)	15
	팥(국산)	2
	차조(국산)	2
	수수(국산)	2
	귀리(국산	2
	메밀(국산)	2
	호밀(국산)	2
	율무(국산)	2
	감자(국산)	2
	고구마(국산)	2
	옥수수(국산)	2

〈VH14곡물과 누룩의 당화〉

VH14곡물의 경우 미생물의 증식에 필요한 탄소원 중 대부분이 전분질로 유산균을 직접 배양하기 힘든 저장당 형태로 구성되어 있다. 그러므로 유산균의 최적증식 배지인 MRS 배지와 달리 직접이용 가능한 단당류의 부재를 해결하기 위하여 전남지방의 전통누룩(송학곡자, 국산)을 이용하였다. 누룩은 그 자체 포함되어 있는 Aspergillus 속 등의 진균류가 증식하면서 생성한 당화효소를 함유하고 있으므로 이를 이용하여 곡물의 당화를 유도하였고 VH14곡물의 중량에 따른 누룩의 최적첨가비율을 통해 누룩에 포함된 야생효모에 의한 알코올 발효는 억제하면서 유산균 증식에 필요한 당화과정이 최대한 진행되도록 하였다.

Table 2. VH14곡물과 누룩의 당화공정 최적화

Composition	Concentration(%)				Temperature(℃)	Time(day)
VH14곡물	5	10	20	30	20	5
전통누룩	1	3	5	10	20	5

Table 3. VH14곡물과 누룩의 배합비율

Sample(No.)	VH14 cereals(%)	Nuruk(%)
S1	5	1
S2	5	3
S3	5	5
S4	5	10
S5	10	1
S6	10	3
S7	10	5
S8	10	10
S9	20	1
S10	20	3
S11	20	5
S12	20	10
S13	30	1
S14	30	3
S15	30	5
S16	30	10

〈당화결과〉

VH14곡물과 누룩의 배합비율에 따라 총 16가지의 샘플을 20℃에서 5일간 당화공정을 진행하였다. 그 결과는 다음과 같으며 S1~8까지는 발효가 진행됨에 따라 색도가 증가하였으나, S9~16까지는 발효 1일차까지 증가한 후 발효 2일차부터는 감소하는 것으로 나타났다. 일반분석을 통한 VH14곡물과 누룩의 최적배합비율은 VH14곡물 5중량%, 누룩 3중량%를 배합하여 나머지는 물을 사용하여 20℃에서 24시간 당화공정을 거쳤을 때 유산균들의 증식에 직접적인 도움이 되는 환원당의 함량이 가장 높게 나타났다.

· 환원당

환원당은 DNS(dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 측정하였다.

· 환원당 결과

환원당은 VH14곡물 기질 동량에 따른 환원당으로 환산하여 Fig. 1에서 나타내었다. 그 결과 시간당 환원당의 생성속도는 발효 1일차의 S2가 최적인 것으로 볼 수 있다.

〈Fig. 1.〉 VH14곡물의 발효기간에 따른 환원당(동량비교)의 변화

〈유산균 및 균의 배양〉

실험에 사용한 균주는 생물자원센터에서 분양받은 Lactobacillus helveticus KCTC 3545, Lactobacillus reuteri KCTC 3594, Lactobacillus fermentum KCTC 3112를 배양에 사용하였다. 균주는 MRS 액체배지를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 150 rpm에서 진탕 배양 후 4℃에서 15분간 원심분리 한 균체를 회수하여 실험에 사용하였다. 균주의 보존은 MRS 액체배지에서 3회 이상 계대 배양을 거쳐 glycerol stock법으로 -80℃에 균주를 보관하였다.

유산균별 생육곡선

MRS 액체배지를 대조군으로 하여 VH14곡물-S2에서 유산균별 배양은 Table 4와 같이 진행하였다.

Table 4. 배지별 유산균의 배양

Media	Composition	Concentration(%)	Temperature(℃)	Time(h)
MRS broth			37	36
VH14곡물-S2	VH14곡물	5	1^st: 20 / 2^nd: 37	24 / 36
VH14곡물-S2	전통누룩	3	1^st: 20 / 2^nd: 37	24 / 36

분석방법

· 총균수

총균수는 plate counting method법을 이용하여 MRS 고체배지에서 37℃에서 48시간 배양한 후 형성된 colony를 계수하여 colony forming unit(CFU/mL)로 나타내었다.

· MRS 액체배지 생육결과

MRS 액체배제에서 유산균의 생육도는 배양시간이 6 ~ 12 시간에서 총균수가 크게 변하였고, Lactobacillus reuteri KCTC 3594는 3 ~ 9시건에 생육이 증가하여 12 시간 이후 대수기에 도달하였고, Lactobacillus fermentum KCTC 3112의 경우 3 ~ 12 시간에서 생육이 증가하여 18 시간 이후 대수기에 도달하여 근소한 차이로 Lactobacillus reuteri KCTC 3594의 생육이 우수하였다. Lactobacillus helveticus KCTC 3545는 3 ~ 12 시간은 생육이 증가 후 대수기에 접어들어 다른 유산균에 비해 생육도가 낮은 것으로 나타났다.

Fig. 2. MRS 액체배지에서 유산균별 생육시간에 따른 총균수 측정
▲;Lactobacillus helveticus KCTC 3545, ◆;Lactobacillus reuteri KCTC 3594,
×;Lactobacillus fermentum KCTC 3112

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〈 VH14곡물-S2 배지 생육결과〉

VH14곡물-S2 배지에서 유산균의 생육도는 배양시간이 0 ~ 6 시간에서 pH와 총균수의 크게 변하였다. Lactobacillus reuteri KCTC 3594, Lactobacillus fermentum KCTC 3112의 경우 3시간 이후 대수기에 도달하여 VH14곡물-S2 배지는 유산균의 초기증식 속도를 증가시켜주는 것으로 볼 수 있다. 이는 누룩을 이용한 당화효소로 유산균 증식에 도움이 되는 에너지원이 풍부한 배지 상태인 것으로 볼 수 있다. Lactobacillus helveticus KCTC 3545는 0 ~ 6 시간의 생육이 증가 후 대수기에 접어들어 다른 유산균에 비해 생육도가 낮았으나 최종균수에는 다른 유산균들과 유사하게 나타나고 MRS 액체배지에서의 총균수보다 근소하게 높게 나타나 VH14곡물-S2 배지는 Lactobacillus helveticus KCTC 3545의 느린 생육에 도움을 주는 것으로 볼 수 있다.

Fig. 3. VH14곡물-S2 배지에서 유산균별 생육시간에 따른 총균수 측정
▲;Lactobacillus helveticus KCTC 3545, ◆;Lactobacillus reuteri KCTC 3594,
×;Lactobacillus fermentum KCTC 3112

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- 발효액의 기능성

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· 총페놀성화합물함량(TPC)

총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Denis법에 의해 비색 정량하였다.

· 총 페놀성 화합물함량(TPC) 결과

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VH14곡물-S2 배지에서 총 페놀성 화합물함량이 증가하였으며 이는 곡물원료에 포함되어 있는 각종 식물성 폴리페놀류가 발효과정을 거치면서 활성화된 것으로 볼 수 있어 유산균의 기능성을 증가시키기 위한 천연배지로 곡물의 사용이 매우 긍정적임을 알 수 있다.

Fig. 4. 배지에 따른 유산균별 총페놀성화합물의 함량
전자공여능(DPPH radical scavenging assay)
유리 라디칼을 소거할 수 있는 활성검정은 DPPH radical scavenging assay를 사용하였다.
DPPH radical scavenging assay 결과
Lactobacillus helveticus KCTC 3545, Lactobacillus fermentum KCTC 3112의 경우 VH14곡물-S2 배지에서 각각 전자공여능이 증가하는데 긍정적인 영향을 나타내었다. Lactobacillus reuteri KCTC 3594의 경우 전자공여능이 변화는 없었으나 유산균 중 가장 높게 나타났다.

Fig. 5. 배지에 따른 유산균별 전자공여능의 비교

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- 유산균별 안정성

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· 동결건조 생존율

유산균을 배양한 후 배양액을 원심 분리하여 균체를 회수하였다. -80℃ 초저온 냉동고에서 12시간 동결 후 동결건조기(일신, MCFD5520, KR)로 실온(25 ~ 29℃)에서 응축기 온도 -80℃, 압력 5 mmTorr 이하의 조건에서 72시간 동결건조하고 총균수를 측정하였다.

· 동결건조 생존율 결과

배지의 종류에 따른 동결건조 전-후 유산균의 생존율을 살펴본 결과 MRS 액체배지에서 생육하였을 경우 Lactobacillus helveticus KCTC 3545(83.4%), Lactobacillus reuteri KCTC 3594(67.9%), Lactobacillus fermentum KCTC 3112(66.8%)로 나타나 Lactobacillus reuteri KCTC 3594와 Lactobacillus fermentum KCTC 3112은 동결건조에 취약한 것으로 볼 수 있다. 하지만 VH14곡물-S2 배지에서 생육하였을 경우, Lactobacillus helveticus KCTC 3545(99.8%), Lactobacillus reuteri KCTC 3594(97.5%), Lactobacillus fermentum KCTC 3112(97.2%)로 나타나 천연배지로 사용된 곡물이 유산균 원말에서 동결보호제로 작용하여 유산균의 동결에 따른 손상을 완화시켜 주는 것으로 볼 수 있으며 특히 Lactobacillus reuteri KCTC 3594와 Lactobacillus fermentum KCTC 3112에서 동결건조에 대한 저항성 증진에 효율적인 것으로 나타났다. 천연 곡물발효 배지는 유산균의 동결건조에 대한 저항성을 증가시켜주어 유산균의 생존율을 보장하여 장기보존에 효과적인 것으로 볼 수 있다.

MRS VH14곡물-S2

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Fig. 6. 배지에 따른 유산균별 동결건조 생존율

Fig. 7. 배지에 따른 유산균별 동결건조 전-후 총균수

· 위액 내성

인공위액에 대한 내성은 1000U/mL 펩신에 1N-Hcl을 이용하여 pH를 2.5로 조정하여 인공위액을 준비하였다. 여기에 동결건조 시킨 유산균을 1mL 접종하고 0, 2시간 처리 후 총균수를 측정하였다.

· 위액 내성 결과

배지의 종류에 따른 위액 처리 전-후 유산균의 생존율을 살펴본 결과 MRS 액체배지에서 생육하였을 경우 모두 사멸하는 것으로 나타나 유산균이 위액에 매우 취약한 것으로 볼 수 있다. 하지만 VH14곡물-S2 배지에서 생육하였을 경우 Lactobacillus. helveticus KCTC 3545(82.4%), Lactobacillus. reuteri KCTC 3594(84.5%), Lactobacillus. fermentum KCTC 3112(85.3%)로 나타나 천연배지로 사용된 곡물에서 위액보호제로 작용하여 유산균의 위액에 대한 저항성 증진에 효율적인 것으로 나타났다. 그러므로 천연 곡물배지는 유산균의 위액에 대한 저항성을 증가시켜주어 유산균의 생존율을 보장하여 목표장기까지 이동에 대하여 효과적인 것으로 볼 수 있다.

Fig. 8. 배지에 따른 유산균별 위액 내성

Fig. 9. 배지에 따른 유산균별 위액 처리 전-후 총균수

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Claims

렌틸콩, 현미, 찰보리, 통밀, 팥, 차조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 율무, 감자, 고구마 및 옥수수의 조성비율이 30 : 20 : 15 : 15 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2 : 2로 이루어진 VH14곡물을 분쇄한 후 혼합하는 단계; 상기 분쇄한 VH14곡물 5 ~ 30중량%에 전통누룩 1 ~ 10 중량% 및 물 69 ~ 85중량%로 조성된 기질을 제조하는 단계; 상기 기질을 갖는 배지에 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus KCTC 3545), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri KCTC 3594) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum KCTC 3112) 중 어느 하나를 접종하는 단계;
상기 유산균을 접종한 후 당화시키는 단계;
당화시킨 후 오토클레이브(autoclave)에서 121℃로 15분간 가열하여 진균류를 비활성화시키는 단계;
로 구성되는 것을 특징으로 하는 유산균의 배양방법.
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제1항에 있어서,
당화는 20℃에서 150rpm으로 24시간 당화시키는 것을 특징으로 하는 유산균의 배양방법.
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