KR101561002B1 - 유산균 증식을 위한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법, 그리고 그것을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 유산균을 포함하는 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물 - Google Patents

유산균 증식을 위한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법, 그리고 그것을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 유산균을 포함하는 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유산균 증식을 위한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법, 그리고 그것을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 유산균을 포함하는 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 인체에 유익한 유산균 중 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 락토바실러스(Lactobacillus) 그리고 스트렙토코커스(Streptococcus) 유산균의 빠른 증식을 도울 수 있으며 저비용 고효율의 배지 구성이 가능한 한방 배지에 관한 것이며, 또한 이 한방 배지를 이용해 배양된 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균을 이용해 유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을 거둘 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

유산균 증식을 위한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법, 그리고 그것을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 유산균을 포함하는 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물{ORIENTAL CULTURE MEDIUM COMPOSITION FOR ENHANCING GROWTH OF LACTIC ACID BACTERIA AND MANUFACTURING METHOD THEREOF, AND LACTIC ACID BACTERIA CULTIVATION METHOD USING THE ORIENTAL CULTURE MEDIUM COMPOSITION AND PHAMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE LACTIC ACID BACTERIA PRODUCED BY THEREOF CULTIVATION METHOD}
본 발명은 유산균 증식을 위한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법, 그리고 그것을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 유산균을 포함하는 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 인체에 유익한 유산균 중 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 락토바실러스(Lactobacillus) 그리고 스트렙토코커스(Streptococcus) 유산균의 빠른 증식을 도울 수 있으며 저비용 고효율의 배지 구성이 가능한 한방 배지에 관한 것이며, 또한 이 한방 배지를 이용해 배양된 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균을 이용해 유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을 거둘 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
발효 음식에 풍부하게 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양 성분으로 만드는 역할을 담당하며, 이와 같이 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스 라고 한다.
유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 크게 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스톡(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다.
연쇄상 구균인 스트렙토코커스 속 미생물은 동형발효균으로, 우유를 발효시켜 유산을 생성함으로써 부패균이나 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다. 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이며, 쌍구균인 루코노스톡 속 미생물은 이형발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다. 또한, 비피도박테리아 속 미생물은 산소가 있는 곳에서는 생육하지 못하는 편성 혐기성균으로, 당을 발효하여 유아에게 유용하게 대사될 수 있는 L(+)형의 유산을 생성한다. 마지막으로, 페디오코커스속 미생물은 사련균의 형태를 가지는 동형 발효균으로, 김치나 절임 식품에 존재하며 소시지 등의 육류 발효에 관여한다.
그 중에서도 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 젖산 간균에 의해 생산되는 아시도필린(acidophillin)은 이질균, 살모넬라균, 포도상 구균, 대장균 등의 성장을 저해한다고 알려져 있다. 또한, 설사 원인균의 증식을 억제하고 장내균총을 정상화함으로 설사를 멈추게 하는 작용을 한다.
하지만 장건강에 이로운 이 같은 유산균은 배양 방법의 조건과 환경이 까다롭고 배양시 실제 증식율이 높지 않아 상품화하는데 어려움이 많으며(한국등록특허 제0109051호 및 한국공개특허 제2014-0102888호 참조), 특히 장이 약한 영유아에게 안전하면서 영유아의 장건강에 효과적인 유산균 약제에 대한 개발이 당업계에서 요구되고 있다.
본 발명은 인체에 유익한 유산균 중 특히 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균의 빠른 증식을 도울 수 있으며 저비용 고효율의 배지 구성이 가능한 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 이 한방 배지를 이용해 배양된 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균을 효과적으로 증식시키기 위한 유산균 배양방법과, 이 배양방법으로 제조된 유산균을 이용해 유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을 거둘 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 한방 배지 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 한방추출물에는 MRS 파우더를 더 포함되는 것을 특징으로 한다.
한편 본 발명은, (a) 식물성 원료로서, 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량%, 건강 2 내지 4 중량%를 혼합시키는 단계; (b) 혼합된 식물성 원료와 물의 비율을 1:5 내지 1:9의 비율로 혼합하고, 90℃ ~ 120℃의 조건에서 1 ~ 4시간 동안 추출액을 추출하는 단계; (c) 상기 추출액을 여과포로 여과한 후, 감압 600mmHg ~ 800mmHg의 감압조건에서 농축하는 단계; (d) 농축이 완료된 원료액에 덱스트린을 소정 배합비율로 혼합하고 80℃ ~ 85℃ 에서 30분 이상 살균한 후 냉각시켜 추출물을 추출하는 단계; 및 (e) 상기 추출물을 멸균수에 혼합하고 MRS 파우더를 녹여 넣어 한방 배지를 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 한방 배지의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (d) 단계에서 상기 원료액과 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
한편 본 발명에 따르면, (a) 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 락티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노수스 및 스트렙토코커스 써모필러스의 유산균을 MRS 액체배지가 담긴 캡튜브에 각각 접종 한 후 35℃ ~ 40℃ 배양기에서 계대 배양하는 단계; (b) 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물을 포함하여 이루어지는 한방 배지에 상기 (a) 단계에서 배양된 유산균을 접종하는 단계; 및 (c) 접종된 배지를 35℃ ~ 40℃ 배양기에서 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계에서 상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
한편 본 발명에 따르면, 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물을 포함하도록 이루어지는 한방 배지에 의해 배양된 비피도박테리움 비피덤 7 내지 13 중량%, 비피도박테리움 롱검 5 내지 9 중량%, 비피도박테리움 락티스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 루테리 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 애시도필러스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 람노수스 3 내지 7 중량% 및 스트렙토코커스 써모필러스 3 내지 7 중량%와 말토덱스트린 45 내지 55 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
한편 본 발명에 따르면, 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물을 포함하도록 이루어지는 한방 배지에 의해 배양된 비피도박테리움 비피덤 12 내지 18 중량%, 비피도박테리움 롱검 5 내지 9 중량%, 비피도박테리움 락티스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 루테리 3 내지 7 중량%, 락토바실러스 애시도필러스 3 내지 7 중량%, 락토바실러스 람노수스 3 내지 7 중량% 및 스트렙토코커스 써모필러스 3 내지 7 중량%와 말토덱스트린 45 내지 55 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 인체에 유익한 유산균 중 특히 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균의 빠른 증식을 도울 수 있으며 저비용 고효율의 배지 구성이 가능하게 되는 효과가 있다.
그리고 이 한방 배지 조성물 및 이의 제조방법을 이용한 유산균 배양방법 및 이 배양방법으로 제조된 한방 배지에 의해 비피도박테리움과 락토바실러스 그리고 스트렙토코커스 유산균을 효과적으로 증식시키고 이들 유산균을 통해 장이 약한 영유아에게 안전하면서 유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을 거둘 수 있는 약제학적 조성물을 제공할 수 있게 되는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 한방 배지 조성물은 백출(白朮), 매실(梅實), 백복령, 생강(生薑), 백작약(白芍藥), 계피(桂皮), 감초(甘草), 당귀(當歸), 산초(山椒), 건강(乾薑)을 포함하여 이루어짐을 특징으로 한다.
상기 백출은 비위(脾胃)의 기능이 허약해서 소식, 권태감이 생기고 얼굴빛이 황색이며 대변을 묽게 보거나 설사에 좋으며 수분이 정체되어 전신이 붓고 소화가 안 될때 수분 배설을 돕는다. 특히 본 발명에서는 백출의 뿌리줄기를 사용함을 특징으로 한다.
상기 매실은 폐(肺)의 열을 내리고, 진액(津液)을 발생시키고, 갈증을 없애며 부종(浮腫)을 줄여주고, 기운을 내려주며 마음을 안정시켜 주고, 구충(驅蟲), 해독(解毒), 지혈(止血)하는 효능이 있다.
상기 백복령은 옛날부터 강장제로 사용되었다. 폐경(肺經)·비경(脾經)·심경(心經)·신경(腎經)·방광경(膀胱經)에 작용하여 비장을 보하고 가래를 삭이며 정신을 안정시킨다. 특히 본 발명에서는 백복령의 균핵을 사용함을 특징으로 한다.
상기 생강은 감기로 인한 오한, 발열, 두통, 구토, 해수, 가래를 치료하며 식중독으로 인한 복통설사, 복만에도 효과가 있다. 약리작용으로 위액분비촉진, 소화력 증진, 심장흥분 작용, 혈액순환촉진, 억균작용 등이 있다.
상기 백작약은 간경(肝經) · 비경(脾經) · 폐경(肺經)에 작용한다. 혈액을 풍부하게 하고 통증과 땀을 멎게 하며 지혈하고 간화(肝火)를 없애며 소변이 잘 나오게 한다. 특히 본 발명에서는 백작약의 뿌리를 사용함을 특징으로 한다.
상기 계피는 기능을 활성화시키므로 소화기가 차서 소화장애가 있거나 복부가 차서 일어나는 복통 설사 등에 널리 이용된다. 뿐만 아니라 배가 차서 일어나는 구토에도 신속한 반응을 일으킨다.
상기 감초는 십이경맥(十二經脈)에 다 작용한다. 비기(脾氣)와 폐기(肺氣)를 강화하고 기침을 멈추게 하며 열사(熱邪)와 유독한 물질을 없애며 새살이 돋아나게 한다.
상기 당귀는 피가 부족할 때 피를 생성해 주는 보혈작용(補血作用)이 주요하며, 관상동맥의 혈류량을 촉진시키고, 적혈구 생성을 왕성하게 한다.
상기 산초나무는 복부의 찬 기운으로 인한 복통, 설사와 치통, 천식, 요통에 쓰며 살충작용이 있어 옴, 버짐, 음부가려움증, 음낭습진 등에도 사용한다.
상기 건강은 가슴과 배부위가 냉기가 돌며 은은하게 통증이 있고 배가 차고 소화가 안되며 구토, 설사를 하는 증상에 효과가 있다. 또한 맥이 약하고 팔다리가 차고 저리며 찬바람에 해수가 생기고, 호흡이 가빠질 때, 아랫배가 차고 이질 설사가 생길 때 사용한다.
이상과 같은 한방 배지 조성물에 사용되는 한방 추출물은 다음과 같은 과정을 통해 제조된다.
먼저 원료로 사용되는 백출, 매실, 백복령, 생강, 백작약, 계피, 감초, 당귀, 산초, 건강에 대한 기준 규격 검사 후 이 식물성 원료들은 1-2차례 세척하게 된다.
그리고 원료와 물의 비율을 1:5 내지 1:9의 비율로 혼합하고, 90℃ ~ 120℃의 조건에서 1 ~ 4시간 동안 추출하게 된다. 바람직하게는 상기 원료와 물의 비율은 1:7이며, 온도는 100℃ ~ 105℃ 인 것이 최적의 추출효율을 보인다.
이후 추출된 추출액을 25㎛의 여과포로 여과한 후, 진공 농축기상에서 감압 600mmHg ~ 800mmHg의 감압조건에서 15 ~ 25 브릭스(Brix)까지 농축하게 된다. 바람직하게는 상기 감압조건은 감압 700 mmHg이며, 농축은 20 브릭스(Brix)인 것이 좋다.
이렇게 농축이 완료된 원료액에 덱스트린(dextrin)을 소정 배합비율로 혼합하고 80℃ ~ 85℃ 에서 30분 이상 살균한 후 40℃ 전후로 냉각시킨다.
이후 분무건조기 상에서 건조시킨다. 여기에서 건조에 사용되는 열풍온도는 급기(inlet)에 200℃ ~ 240℃가 유지되고 배기(outlet)에 98℃가 유지된다.
여기에서 상기 백출, 매실, 백복령, 생강, 백작약, 계피, 감초, 당귀, 산초, 건강을 포함하는 식물성 원료들에 대하여 다양한 배합비율을 실험한 결과, 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량%, 건강 2 내지 4 중량%와 같은 배합비율로 제조된 상태에서 유산균 배지로서 좋은 성능을 보였다.
특히 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 24.5중량%, 매실 16.2중량%, 백복령 12.1중량%, 생강12.1중량%, 백작약 8.7중량%, 계피8.7중량%, 감초 8.1중량%, 당귀 3.2중량%, 산초 3.2중량%, 건강 3.2중량%의 비율로 한방 추출물을 투입했을 때 최적의 성능을 보였다.
여기에서 이 같은 한방 추출물과 상기 덱스트린과의 배합비율은 아래의 표 1 내지 표 3과 같이 식물성 원료인 한방 추출물을 30%, 20% 및 10%를 포함시켜 샘플들을 준비한 후 각 샘플들을 아래의 과정을 통해 배지화하였다.
원 재 료 명 배 합 비 율(%)
원물 추출고형분
백출(뿌리줄기) 24.5




30.0
매실 16.2
생강 12.1
백복령(균핵) 12.1
백작약(뿌리) 8.7
계피 8.7
감초 8.1
당귀 3.2
건강 3.2
산초 3.2
합계 100.0
덱스트린 70.0
합계 100.0
표 1의 샘플은 한방 추출물 중 총 중량에 대하여 백출 24.5중량%, 매실 16.2중량%, 백복령 12.1중량%, 생강12.1중량%, 백작약 8.7중량%, 계피8.7중량%, 감초 8.1중량%, 당귀 3.2중량%, 산초 3.2중량%, 건강 3.2중량%를 배합하였으며, 이러한 한방 추출물의 농축액에 덱스트린을 3 : 7로 혼합한 샘플이다. 이하의 설명에서는 농도 30% 샘플로 칭한다.
원 재 료 명 배 합 비 율(%)
원물 추출고형분
백출(뿌리줄기) 24.5




20.0
매실 16.2
생강 12.1
백복령(균핵) 12.1
백작약(뿌리) 8.7
계피 8.7
감초 8.1
당귀 3.2
건강 3.2
산초 3.2
합계 100.0
덱스트린 80.0
합계 100.0
표 2의 샘플은 한방 추출물 중 총 중량에 대하여 백출 24.5중량%, 매실 16.2중량%, 백복령 12.1중량%, 생강12.1중량%, 백작약 8.7중량%, 계피8.7중량%, 감초 8.1중량%, 당귀 3.2중량%, 산초 3.2중량%, 건강 3.2중량%를 배합하였으며, 이러한 한방 추출물의 농축액에 덱스트린을 2 : 8로 혼합한 샘플이다. 이하의 설명에서는 농도 20% 샘플로 칭한다.
원 재 료 명 배 합 비 율(%)
원물 추출고형분
백출(뿌리줄기) 24.5




10.0
매실 16.2
생강 12.1
백복령(균핵) 12.1
백작약(뿌리) 8.7
계피 8.7
감초 8.1
당귀 3.2
건강 3.2
산초 3.2
합계 100.0
덱스트린 90.0
합계 100.0
표 3의 샘플은 한방 추출물 중 총 중량에 대하여 백출 24.5중량%, 매실 16.2중량%, 백복령 12.1중량%, 생강12.1중량%, 백작약 8.7중량%, 계피8.7중량%, 감초 8.1중량%, 당귀 3.2중량%, 산초 3.2중량%, 건강 3.2중량%를 배합하였으며, 이러한 한방 추출물의 농축액에 덱스트린을 1 : 9로 혼합한 샘플이다. 이하의 설명에서는 농도 30% 샘플로 칭한다.
이 같은 한방추출물 샘플을 배지화하기 위해 영양분이 풍부한 액체 배지로 리치 미디어(rich media)인 유산균 전용 MRS(Lactobacilli MRS agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)를 기반으로 제작하였으며, 여기에서 해당 배지의 메뉴얼에 소개 되어 있는 비율(MRS/water = 55g/L)을 유지하여 배지화를 진행하였다.
농도 10% 샘플, 농도 20% 샘플, 농도 30% 샘플의 각 액체 한방추출물 배지는 1리터를 기준으로 MRS 파우더 55g을 각각 한방추출물 100ml과 멸균수 900ml, 한방추출물 200ml과 멸균수 800ml, 한방추출물 300ml과 멸균수 700ml에 녹인 후 약 121℃에서 약 20분간 고압멸균기를 사용하여 제조하였다.
이렇게 완성된 한방추출물 배지를 이용해 유산균을 배양하는 방법에 대해 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 한방추출물 배지를 통해 배양시킬 유산균은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum MG731), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum MG723), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis MG741), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri MG505), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus MG501), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus MG316), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus MG510) 등 7종의 유산균이다. 균주를 활성화시키기 위해 초저온 냉동고에 보관된 각 균주를 MRS 액체배지가 담긴 캡튜브(cap tube)에 각각 2% 접종 한 후 35℃ ~ 40℃의 배양기(incubator)에서 20시간씩 2회 계대 배양한 후 본 배양실험을 진행하였다. 보다 정확하게는 실제 배양실험은 37℃ 배양기에서 진행하였다. 각각의 농도별로 준비 된 액체 한방추출물 배지에 7종의 유산균을 액체 한방추출물 배지의 전체양의 0.3%씩 접종하여, 최종적으로 2.1%의 접종이 이루어지도록 하였다. 접종된 배지는 최적온도인 35℃ ~ 40℃ 배양기에서 20시간 배양하였다. 보다 정확하게는 접종된 배지는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
이 같은 한방추출물의 배지화 결과물에 대하여 유산균 특히 비피도박테리움(B)과 락토바실러스(L) 그리고 스트렙토코커스(S) 유산균의 배양 실험을 실시한 결과가 다음의 표 4에 나타나 있다.
농도(%) 0 10 20 30
L, S B L, S B L, S B L, S B
한방추출물 배지 생균수
28		 생균수
4		 생균수
33		 생균수
7		 생균수
36		 생균수 10 생균수
40		 생균수12
100% 100% 118% 175% 128% 250% 142% 400%
프락토올리고당 생균수
28		 생균수
4		 생균수
30		 생균수
6		 생균수
34		 생균수
8		 생균수
36		 생균수
10
100% 100% 107% 150% 121% 200% 128% 250%
갈락토올리고당 생균수
28		 생균수
4		 생균수
33		 생균수
7		 생균수
35		 생균수
10		 생균수
38		 생균수
10
100% 100% 118% 175% 125% 250% 135% 250%
표 4에서는 상술한 실험군인 한방추출물 배지와 그 대조군으로 프리바이오틱스(prebiotics)인 프락토올리고당(fructooligosaccharide) 배지 및 갈락토올리고당(galactooligosaccharide) 배지의 비교 결과가 보여진다. 대조군으로 사용한 프락토올리고당과 갈락토올리고당은 멸균된 증류수에 녹인 후, 한방추출물의 브릭스(brix)와 같은 농도로 제조 후 사용하였다. 여기에서 MRS의 농도가 희석되는 것을 방지하기 위해 증류수에 한방추출물 및 대조군을 각각 섞어 최종적으로 10%, 20%, 30%의 농도가 되도록 준비 한 후, 이에 MRS 배지 분말을 녹여 본 배양배지를 준비하였다. 표에서 농도 0%는 실험군 및 대조군을 포함하지 않고 순수 MRS만을 포함시킨 결과이며, 농도 10%, 농도 20% 및 농도 30%는 실험군 및 대조군을 포함시킨 비율을 의미한다. 즉, 한방추출물 배지 농도 30%는 한방 추출물 중 총 중량에 대하여 백출 24.5중량%, 매실 16.2중량%, 백복령 12.1중량%, 생강12.1중량%, 백작약 8.7중량%, 계피8.7중량%, 감초 8.1중량%, 당귀 3.2중량%, 산초 3.2중량%, 건강 3.2중량%를 배합하였으며, 이러한 한방 추출물의 농축액에 덱스트린을 1 : 9로 혼합한 것이며, 이 같은 한방추출물 300ml와 멸균수 700ml에 MRS 파우더 55g을 녹인 것을 의미한다. 실험은 MRS 접종 20시간 후의 결과이며, 여기에서 생균수의 단위는 (x108)이다.
배양 후 분석은 BCP agar, BL agar, BS agar 3가지의 배지로 진행하였다. 희석은 비피도박테리움, 락토바실러스, 스트렙토코서서스를 동시에 희석할 수 있는 미쯔오카(mitsuoka) 용액을 통해 진행하였으며, 각각의 배양액을 106, 107, 108의 단위로 희석하여 희석시료액 1㎖씩 멸균 페트리접시 3매 이상씩에 무균적으로 취하여 넣고 여기에 다시 약 37℃로 유지한 각각의 배지 15㎖를 무균적으로 분주한 다음 혼합한 후 냉각 응고시켜 BCP agar는 37℃ 배양기에 넣고 BL agar 및 BS agar는 혐기 배양기에 넣어 48시간 배양 후 콜로니(colony)를 계측하여 생균수를 분석하였다. BCP agar를 통해 락토바실러스 및 스트렙토코서서스 균수를 분석하고, BS agar를 통해 비피도박테리움 균수를 분석하여, 이 두 데이터의 총합의 수와 BL agar에서의 콜로니 수를 비교하여 확인하였다.
표 4를 통해 알 수 있는 바와 같이 기본적으로 대조군인 프락토올리고당 배지 및 갈락토올리고당 배지와 비교하여 실험군인 한방추출물 배지에서 유산균(비피도박테리움(B), 락토바실러스(L), 스트렙토코커스(S))의 증식이 훨씬 더 활발하게 이루어지고 있음을 확인할 수 있다.
주목할 점은 농도 30%의 한방추출물 배지에서는 락토바실러스(L), 스트렙토코커스(S)가 142% 증식하였으며, 특히 비피도박테리움(B)이 400% 증식하는 결과를 보여 본 발명에 따른 한방추출물 배지가 유산균 증식에 효과적임이 실험적으로 확인되었다.
이렇게 한방추출물 배지를 통해 7종의 유산균인 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum MG731), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum MG723), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis MG741), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri MG505), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus MG501), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus MG316), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus MG510)를 효과적으로 배양할 수 있다.
한편 분유섭취 영양유아 보다 모유섭취 영양유아에서 비피도박테리움 균이 장내에서 우세하게 서식하고 있어 분유섭취 영유아에게는 특히 외부로부터 비피도 박테리움균의 공급이 필요하다. 또한 락토바실러스 루테리의 경우 모유에서 분리된 균이며 영유아에게 자연스럽게 섭취되는 균으로서 이 또한 마찬가지로 분유섭취 영유아에게 필요한 균주이다. 그리고 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노수스, 스트렙토코커스 써모필러스 균은 장내 정착·서식함으로써 면역증강, 아토피 개선, 설사예방 등 다양한 생리효과를 나타내는 균종으로 섭취의 필요성이 대두되고 있다.
이들 유산균을 유아 장건강을 위한 약제학적 조성물로 제공하기 위해 다음과 같은 유산균 추출 방법을 통해 각각의 유산균을 추출한 후 상술한 한방추출물 배지를 이용해 배양시킴으로써 영유아를 위한 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
먼저 7종의 유산균 중 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 락티스, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노수스는 유아의 분변에서 추출할 수 있다.
채취된 유아의 분변 속의 균주를 얻기 위해 0.85% saline 용액 50ml에 분변 1g을 넣고, 스토마커(stomacher)(simple mixer, 3M)를 이용하여 3분간 교반하였다. 교반 후 고형물 제거를 위해 페이퍼 필터(paper filter)를 이용하여 여과(filtration) 후 1ml을 취하여 0.85% saline 희석액으로 105까지 단계희석하였다. 원액, 10 ~ 105의 희석액을 0.2% BPB(bromophenol blue) 지시약 1%가 첨가된 BL, BS, MRS agar에 각각 농도별로 도말하여 30℃의 혐기배양기에서 48시간 배양하였다. 콜로니 주변이 노랗게 변한 균주를 육안으로 관찰하여 형태 및 색 등이 서로 다른 콜로니들을 각각 새로운 MRS agar plate에 스트리킹(streaking)하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 얻은 싱글 콜로니(single colony)는 2회 이상의 계대를 통해 순수배양을 유도하고, 얻어진 콜로니는 유전자 분석업체인 마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA gene의 염기서열을 통해 균주의 종(species)을 확인하였다.
다음으로 7종의 유산균 중 락토바실러스 루테리는 모유로부터 추출이 가능하며 스트렙토코커스 써모필러스는 우유로부터 추출할 수 있다.
채취된 모유 또는 우유를 원액으로 삼아 0.85% saline 희석액에 105까지 단계희석하였다. 원액, 10 ~ 105의 희석액을 0.2% BPB(bromophenol blue) 지시약 1%가 첨가된 BL, BS, MRS agar에 각각 농도별로 도말하여 30℃의 혐기배양기에서 48시간 배양하였다. 콜로니 주변이 노랗게 변한 균주를 육안으로 관찰하여 형태 및 색 등이 서로 다른 콜로니들을 각각 새로운 MRS agar plate에 스트리킹하여 30에서 48시간 배양하였다. 배양 후 얻은 싱글 콜로니는 2회 이상의 계대를 통해 순수배양을 유도하고, 얻어진 콜로니는 유전자 분석업체인 마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA gene의 염기서열을 통해 균주의 종을 확인하였다.
이렇게 추출되어 상기 한방추출물 배지를 이용해 배양된 7종의 유산균은 최적의 배합을 통해 영유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을 거둘 수 있는 약제학적 조성물로 만들 수 있다.
먼저 영아가 섭취하기 쉬운 분말 형태의 약제학적 조성물은 비피도박테리움 비피덤 7 내지 13 중량%, 비피도박테리움 롱검 5 내지 9 중량%, 비피도박테리움 락티스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 루테리 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 애시도필러스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 람노수스 3 내지 7 중량% 및 스트렙토코커스 써모필러스 3 내지 7 중량%와 말토덱스트린 45 내지 55 중량%를 포함하도록 제조된다.
또한 영아 및 유아가 섭취할 수 있는 타정 형태의 약제학적 조성물은 비피도박테리움 비피덤 12 내지 18 중량%, 비피도박테리움 롱검 5 내지 9 중량%, 비피도박테리움 락티스 5 내지 9 중량%, 락토바실러스 루테리 3 내지 7 중량%, 락토바실러스 애시도필러스 3 내지 7 중량%, 락토바실러스 람노수스 3 내지 7 중량% 및 스트렙토코커스 써모필러스 3 내지 7 중량%와 말토덱스트린 45 내지 55 중량%를 포함하도록 제조된다.
이 같은 분말 및 타정 형태의 유산균 포함 약제학적 조성물의 최적 배합은 다음의 표 5와 같다.
균주 유래 분말용 타정용
비피도박테리움 비피덤 MG731 유아의 분변 10.00 15.00
비피도박테리움 롱검 MG723 유아의 분변 7.50 7.50
비피도박테리움 락티스 MG741 유아의 분변 7.50 7.50
락토바실러스 루테리 MG505 모유 7.50 5.00
락토바실러스 애시도필러스 MG501 유아의 분변 7.50 5.00
락토바실러스 람노수스 MG316 유아의 분변 5.00 5.00
스트렙토코커스 써모필러스 MG510 우유 5.00 5.00
말토덱스트린 50.00 50.00
Total 100.00 100.00
표 5와 같은 유산균을 이용한 약제학적 조성물은 상기 한방추출물 배지를 이용해 배양되기 때문에 증식율이 높아 상품화가 용이한 장점을 가지며, 특히 장이 약한 영유아에게 안전하면서 영유아의 변비 방지와 설사 방지 등의 장건강 효용을거둘 수 있게 된다.
이상과 같이 도면과 명세서에서 최적 실시 예가 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미 한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물로서 유산균 중 비피도박테리움 속, 락토바실러스 속 및 스트렙토코커스 속 중 적어도 하나 이상을 증식시키는 것을 특징으로 하는 한방 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 한방 배지 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 한방추출물에는 MRS 파우더를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 한방 배지 조성물.
  4. (a) 식물성 원료로서, 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량%, 건강 2 내지 4 중량%를 혼합시키는 단계;
    (b) 혼합된 식물성 원료와 물의 비율을 1:5 내지 1:9의 비율로 혼합하고, 90℃ ~ 120℃의 조건에서 1 ~ 4시간 동안 추출액을 추출하는 단계;
    (c) 상기 추출액을 여과포로 여과한 후, 감압 600mmHg ~ 800mmHg의 감압조건에서 농축하는 단계;
    (d) 농축이 완료된 원료액에 덱스트린을 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합하고 80℃ ~ 85℃ 에서 30분 이상 살균한 후 냉각시켜 추출물을 추출하는 단계; 및
    (e) 상기 추출물을 멸균수에 혼합하고 MRS 파우더를 녹여 넣어 한방 배지를 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 한방 배지의 제조방법.
  5. 삭제
  6. (a) 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 락티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노수스 및 스트렙토코커스 써모필러스의 유산균을 MRS 액체배지가 담긴 캡튜브에 각각 접종 한 후 35℃ ~ 40℃ 배양기에서 계대 배양하는 단계;
    (b) 조성물 중 총 중량에 대하여 백출 20 내지 28 중량%, 매실 13 내지 19 중량%, 백복령 9 내지 15 중량%, 생강 9 내지 15 중량%, 백작약 6 내지 10 중량%, 계피 6 내지 10 중량%, 감초 6 내지 10 중량%, 당귀 2 내지 4 중량%, 산초 2 내지 4 중량% 및 건강 2 내지 4 중량%를 포함하는 식물성 원료에 덱스트린을 혼합시킨 한방추출물을 포함하여 이루어지는 한방 배지에 상기 (a) 단계에서 배양된 유산균을 접종하는 단계; 및
    (c) 접종된 배지를 35℃ ~ 40℃ 배양기에서 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 배양방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 식물성 원료와 덱스트린은 1:9 내지 3:7의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 유산균 배양방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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