CN105018408B

CN105018408B - 一种在培养基中添加芦丁促进益生菌生长的方法

Info

Publication number: CN105018408B
Application number: CN201510470099.6A
Authority: CN
Inventors: 于大海; 房学迅; 相宏宇; 谢秋宏; 杨吉雨
Original assignee: Pu Sheng Tai Biotechnology Co ltd Of Jilin Province
Current assignee: Pu Sheng Tai Biotechnology Co ltd Of Jilin Province
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN105018408A

Abstract

本发明提供了一种促进益生菌生长的方法：所述方法通过将益生菌菌种（鼠李糖乳杆菌）接种到添加有芦丁的改良MRS乳酸细菌培养基（葡萄糖2%、蛋白胨2%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、柠檬酸氢二铵0.2%、硫酸镁0.025%、硫酸锰0.005%、吐温‑80 0.3%，pH 7.0）基质中进行发酵，每升发酵培养基中添加1g‑‑5g芦丁（纯度99%），该方法能够显著提高发酵液中益生菌的发酵速度和益生菌的活菌数；益生菌发酵生长24 h得到的益生菌发酵液的最大活菌数可达到约10⁹CFU/mL；添加的芦丁也能同时发挥其降低毛细管脆性、改善微循环、抗辐射和抗自由基等作用特点，可大幅提高培养产物的功能性效果。

Description

一种在培养基中添加芦丁促进益生菌生长的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种在培养基中添加芦丁促进益生菌生长的方法。

背景技术

益生菌是一类定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，对人体健康有重要作用的活的微生物的总称，广泛应用于食品、保健品和药品生产中。LGG（ATCC 53103）是一种鼠李糖乳杆菌，八十年代初由两位美国教授从健康人体内分离而得，也是目前全球研究最多的益生菌之一。大量的体外实验、动物实验、人体实验和流行病学调查研究充分证明了LGG的安全性。功能性方面，LGG具有显著的平衡和改善肠道菌群、预防和治疗腹泻、提高机体免疫力、预防过敏、结合并排除毒素、预防龋齿等功能。此外，作为一种益生菌，LGG还具有一些自身的优势：比如耐胃酸、耐胆汁、可定殖于人体肠道、最终产品（酸奶、牛奶等）保质期内活菌数保持恒定等(王世宾,刘金杰,乔岚,程琳. 益生菌LGG的研究. 广州食品工业科技 [J]. 2003, s1:55-58)。研究发现，益生菌在人体肠道内的数量对益生菌发挥保健和治疗功效起到决定性作用。除了益生菌在体内增殖，在加工过程中和贮藏期间保证其存活和保持生物活性等因素外，足量的活菌数是益生菌补充剂产品发挥其有效性的必要前提。

当前提高益生菌活菌总数的研究方向主要集中在发酵工艺的优化和复合菌高密度发酵。向发酵培养基中添加有益物质不但能提高益生菌的活菌数，发酵乳还能兼具有益物质的功能。林莹等将菊粉、大豆低聚糖和低聚果糖等益生素添加到酸奶中进行发酵，结果表明，益生素对双歧杆菌的增殖有显著影响，其中又以大豆低聚糖对双歧杆菌的增殖最有效，活菌数量从0.49×10⁸ cfu/ml有效增殖到1.2×10⁸ cfu/ml（林莹,梁世中. 益生菌保健酸奶发酵剂配制和益生素对菌体数量影响的研究.广州食品工业科技[J]. 2003, S1:41-43）。有专利文献报道一种提高益生菌活菌数的方法，是将北虫草提取物加入到常规的乳酸菌培养基中，能够使乳酸菌活菌数从1.5×10⁸ cfu/ml提高到1.3×10⁹cfu/ml (中国专利申请号：200910038553.5)。刘成国等将益生菌菌种接种到添加有紫薯浆的发酵牛乳基质中进行发酵，能够显著提高益生菌发酵乳中益生菌的活菌数，得到的益生菌发酵乳的最大活菌数从10⁹-10¹⁰cfu/ml提高到10¹⁰-10¹²cfu/ml。脱脂乳中添加大豆蛋白水解物和酵母膏复合剂对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长具有显著的促进作用，添加增殖复合剂可使乳酸菌数量比脱脂乳培养基提高1-2个数量级。(白凤翎, 曲玲童, 张柏林等. 大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖发酵的研究. 食品工业科技[J]. 2012, 33 (16):209-212)。李慧静等研究了添加黄芪之后嗜酸乳杆菌的生长状况的变化，她们把制备的黄芪提取液添加到改良的MRS培养基中，研究不同浓度黄芪提取液对嗜酸乳杆菌生长的影响，结果表明：当添加黄芪提取液浓度为0.032 g/mL时，对嗜酸乳杆菌生长有明显的促进作用，48h OD从0.6提高到0.8（李慧静. 嗜酸乳杆菌与黄芪相关性研究[D]，安徽工程大学，2013）。赵玉萍等研究不同浓度的甘草多糖和党参多糖对鼠李糖乳杆菌的影响，发现1.5% (m/v)的党参多糖对鼠李糖乳杆菌的增殖影响最大，其活菌数最大可达到3.29×10⁹cfu/mL，提高了3倍左右，并且能够使其提前2～3 h达到最大产酸量，缩短发酵时间，较好地提高其耐酸、耐胆盐及耐高温的能力 (赵玉萍，贾建波，中药多糖对鼠李糖乳杆菌性质的影响. 食品科技[J], 2008, 13-15)。徐海燕等研究低聚木糖对乳杆菌、双歧杆菌及肠道菌群生长的影响。结果1%的低聚木糖对植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌有明显的增殖作用。（徐海燕,辛国芹, 曹银生, 武香玉, 汪孟娟, 谷巍. 低聚木糖对益生菌及人肠道菌群的影响. 药学研究[J]. 2013, 9:500-503）

当前益生菌增殖技术取得了一定成果，向发酵培养基中添加有益物质是一种高效、简便的提高益生菌的活菌数的方法。不但能降低发酵生产成本，在某些情况甚至能够缩短发酵周期。但是更多的具备特殊功能的添加剂的研究还不是很多。

芦丁，分子式：C₂₇H₃₀O₁₆，分子量：610.51，别名芸香甙。芦丁属于黄酮类物质，具有多种生理作用，如有降低毛细血管通透性和脆性的作用；保持及恢复毛细血管的正常弹性；用于防治高血压脑溢血；糖尿病视网膜出血和出血性紫癜等；也用作食品抗氧剂和色素。芦丁对人体安全，早在几十年前，美国FDA已批准芦丁为GRAS级（即“公认为安全的”）产品，不仅可供药用，也可用于保健食品或化妆品等产品中。随着世界各国患血栓病的人数在不断上升，作为能有效增强毛细血管壁、防止血管破裂和脑出血等症的药物芦丁，需求量在不断增加。我国是芦丁的生产和出口大国，预期芦丁总产量和出口数量也会不断增加。据统计，目前全球芦丁原料药总产量已达3000～3600吨，而我国芦丁总产量估计在1200吨左右，约占全球芦丁总产量的1/3。近年来，芦丁及其加工产品在国内外市场上十分畅销，其营养品质与深加工利用己成为国内学者们的研究热点。当前研究的热点集中在芦丁在抗氧化、清除自由基、抗突变、抗癌症、抗心血管疾病、抗高血糖、改善肝功能等功效方面的研究。据悉，美国市场上已有多种以芦丁为主要原料的保健产品，如芦丁与维生素的合剂（如芦丁+VC，芦丁+VE，芦丁+VK等等）以及芦丁与植物性保健原料的合剂如芦丁与银杏叶提取物片剂，芦丁与沙棘果提取物片剂，芦丁与山楂果提取物片剂，芦丁与紫锥菊提取物片剂等等。芦丁已成为美国医药保健品市场上的新宠儿。但是，当前关于芦丁对益生菌具有增殖作用的研究尚没有文献报道，添加芦丁的微生态制剂也未见报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种提高益生菌活菌数的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种提高益生菌体外培养活菌数的方法，所述方法为：将益生菌菌种接种到添加有芦丁溶液的MRS培养基中，进行益生菌的增殖。

前述方法具体技术方案包括以下步骤：

（1）芦丁溶液的制备：准确称量芦丁配置成芦丁浓溶液，搅拌至溶解，115℃灭菌30min；

（2）增菌培养基的配置：将步骤（1）制备得到的芦丁溶液加至灭菌后的改良MRS培养基中；同时准备一个未添加芦丁的对照组

（3）益生菌种子液的制备：将保存到的益生菌菌株，经复苏、扩大后制成种子液；

（4）益生菌的增菌培养：将步骤（3）得到的益生菌种子液接种到步骤（2）得到的增菌培养基中进行增菌培养。

（5）活菌数的测定：发酵的过程从0 h开始，采用常规10倍稀释平板厌氧培养计数法每间隔一段时间测定一次活菌数，最终获得该益生菌的最大活菌数。

较优地，所述步骤（1）中，芦丁单体（纯度99%）以100 mg/mL的浓度配置成芦丁的DMSO浓溶液。DMSO溶液可以提高芦丁的溶解性，且按之后的比例加入到增菌培养体系，DMSO并不会抑制益生菌的生长增殖。

较优地，所述步骤（2）中，步骤（1）中所得芦丁溶液按一定体积加至改良MRS培养基中，使芦丁终浓度为0.1 mg/mL至5 mg/mL。所述的改良乳酸菌培养基（改良MRS）配置好后于115℃、0.1 Mpa下灭菌30 min。

较优地，所述步骤（3）中，将鼠李糖乳杆菌种以1% (v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37 ℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10%～20% (v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37 ℃静止培养12小时进行鼠李糖乳杆菌种子液的制备。

较优地，将步骤3)得到的益生菌种子液按照3%(v/v)的比例接种到步骤2)得到的增菌培养基中进行增菌培养。增菌培养温度为37 ^oC，增菌培养时间为16 – 24 h。

本发明以益生菌为发酵菌种，通过在增菌培养基中添加经处理的芦丁溶液，在适宜温度下制成发酵乳，显著提高了增菌培养过程中益生菌的生长和活菌数，从而为之后制备益生菌微生态制剂提供大量活益生菌菌体。另外，如在微生态制剂中加入适量的芦丁单体，不仅可以促进人体胃肠道内部分益生菌的生长，还可以起到其他保健作用。本发明还综合利用了低成本的芦丁资源，并发现了芦丁在提高益生菌活菌数中的作用，并且对部分种属的益生菌有明显的增殖效果。

附图说明

图1：两种不同株的鼠李糖乳杆菌16S rDNA序列的对比图。

图2: 不同浓度芦丁对不同株鼠李糖乳杆菌生长的影响。

图3: 芦丁对鼠李糖乳杆菌（9-2）体外生长增殖的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

（1）芦丁溶液的制备：将芦丁加入DMSO中，搅拌至溶解，115 ℃灭菌30 min。所述芦丁单体(纯度99%)以100 mg/mL的浓度配置成芦丁的DMSO浓溶液。

（2）增菌培养基的配置：将步骤(1)制备得到的芦丁溶液按一定浓度加至改良MRS培养基中，使芦丁终浓度为1 mg/mL。所述的改良乳酸菌培养基（改良MRS）配方如下表1所示：

表1：改良乳酸菌培养基（改良MRS）配方

成分	用量（g）
		蛋白胨	20.0
牛肉膏	10.0
		酵母膏	5.0
柠檬酸氢二铵[（NH₄）₂HC₆H₅O₇]	4.0
		葡萄糖 (C₆H₁₂O₆·H₂O)	20.0
吐温-80	3.0 mL
		乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O）	5.0
磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）	2.0
		硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）	0.25
硫酸锰（MnSO₄·H₂O）	0.05
		琼脂	18.0
蒸馏水	1 000 mL
		pH	7.0

配置好后于115 ℃、0.1 Mpa下灭菌30 min，灭菌后自然冷却。

（3）益生菌种子液的制备：将保存的鼠李糖乳杆菌菌株，经复苏扩大后制成种子液。将鼠李糖乳杆菌种以1% (v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37 ℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10% (v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37 ℃静止培养12小时进行鼠李糖乳杆菌种子液的制备。

（4）益生菌的增菌培养：将步骤(3)得到的益生菌种子液接种到步骤(2)得到的增菌培养基中进行增菌。种子液按照3%(v/v)的比例加至增菌培养基。增菌培养温度为37 ℃，增菌培养时间为16 h。

本发明使用的芦丁可以不同程度促进不同株的鼠李糖乳杆菌的体外增殖。鼠李糖乳杆菌9-2分离自美国The Vitamin Shoppe生产的保健品Ultimate 10 Probiotic，鼠李糖乳杆菌AP-3分离自美国女性保健品raw probiotics vaginal care。两者的16S rDNA序列对比如图1所示，两者虽都属于鼠李糖乳杆菌，但是两者的DNA序列差别较大。发明中芦丁对两者的体外生长增殖均表现出促进作用如图2所示，1 mg/mL的芦丁对鼠李糖乳杆菌9-2的促进作用显著（p<0.05），体外生长6小时后发酵液活菌数达5.5×10⁸ CFU/mL，比未添加芦丁的发酵液活菌数提高了约3.7倍；而5 mg/mL的芦丁才对鼠李糖乳杆菌AP-3表现出显著的促进作用（p<0.05），体外生长14小时发酵液活菌数达6×10⁸CFU/mL，比未添加芦丁的发酵液活菌数提高了约2倍。如图3所示，添加芦丁溶液后，可以促进鼠李糖乳杆菌对数生长期的生长速率，使鼠李糖乳杆菌9-2快速分裂繁殖。

虽然，上文中己经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种提高鼠李糖乳杆菌体外培养活菌数的方法，其特征在于，所述方法为：将鼠李糖乳杆菌接种到含有1～5 mg/mL芦丁溶液的改良MRS培养基中，进行发酵培养；所述改良MRS培养基配方为：蛋白胨20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、（NH₄）₂HC₆H₅O₇ 4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 3.0 mL、CH₃COONa•3H₂O 5.0 g、K₂HPO₄•3H₂O 2.0 g、MgSO₄•7H₂O 0.25 g、MnSO₄•H₂O 0.05 g、蒸馏水1000 mL，pH7.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)芦丁溶液的制备：使用DMSO溶解芦丁干粉，所述芦丁纯度为99%，制成芦丁溶液；

2)鼠李糖乳杆菌的活化与种子液的制备：依次对保存的菌种进行复苏活化和扩大，得到种子液；

3)添加芦丁的改良MRS培养基的制备：向改良的MRS培养基中加入步骤1)制备得到的芦丁溶液，依次进行灭菌、冷却；

4)鼠李糖乳杆菌的发酵培养：将步骤2)得到的鼠李糖乳杆菌接种到步骤3)得到的添加芦丁的改良MRS培养基中进行发酵培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述改良的MRS培养基的芦丁添加量为1～5 mg/mL，并使用DMSO进行促溶，115 ℃灭菌30 min，冷藏备用。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中改良的MRS培养基配制完成后调节pH，在高压灭菌锅中115 ^oC灭菌30 min，取出冷却到37^oC左右。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述鼠李糖乳杆菌复苏接种的接种量为1%，种子液制备时的接种量为10%～20%，发酵培养的接种量为3%。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中发酵的发酵培养温度为37^oC，发酵时间为6 h～14 h。

7.权利要求1～6任一项所述的方法提高鼠李糖乳杆菌生长和活菌数的方法，鼠李糖乳杆菌发酵液的最大活菌数可达到约10⁹CFU/mL。