CN104818230A

CN104818230A - 一株具有降解胆固醇功能的植物乳杆菌l01及其应用

Info

Publication number: CN104818230A
Application number: CN201510223068.0A
Authority: CN
Inventors: 刘昭明; 黄翠姬; 吴凡; 黄群
Original assignee: Guangxi University of Science and Technology
Current assignee: Guangxi University of Science and Technology
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明公开了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01，保藏编号为CCTCC NO：M2014568；并提供了其在降解胆固醇中和在制备能够降解胆固醇的发酵乳制品中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一株从传统泡菜中分离筛选获得的植物乳杆菌L01，来源于传统食品，具有很好的安全性，同时具有良好的耐酸、耐胆盐和细胞黏附性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用，能够应用在制备发酵乳制品中，其降解胆固醇的能力强，可有效降低血清胆固醇，提高机体免疫力。

Description

一株具有降解胆固醇功能的植物乳杆菌L01及其应用

技术领域

本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及一株具有降解胆固醇功能的植物乳杆菌L01及其应用。

背景技术

胆固醇是一种戊烷多氢菲衍生物，是构成细胞膜的重要组分，也是合成胆汁酸、维生素D以及性激素、肾上腺素的前体物质。人体内保持正常的胆固醇水平是必要的，但是如果人体内积累了过多的胆固醇，就会对人体的健康产生不良的影响，现有研究证实，血清中胆固醇水平偏高是引发心血管疾病的主要因素。20世纪70 年代，人们发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。自此许多研究集中于乳酸菌降胆固醇的功能作用方面并证实了不同种类的乳酸菌的降低胆固醇效果。2006年，联合国粮农组织(FAO)世界卫生组织(WHO)将这些经适量服用后，能够对人体健康起有益作用的活的微生物统称为益生菌（probiotic）。益生菌保健功能包括调整宿主体内肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢能力，产生抑菌素控制有害菌群生长，增强机体免疫力，预防癌症，降低血清胆固醇和抗氧化延缓衰老等，因此利用益生菌的保健作用开发相应的功能食品有重要意义。

益生菌大多数是乳酸菌中的乳酸杆菌和双歧杆菌。在食品行业中使用益生菌应该考虑三个方面的因素，一是对人体有保健作用，二是能在人体的肠道中定植存活，三是菌株的安全性。为达到此目标，作为益生菌必须具有耐酸、耐胆盐的特点，且在肠道内具有较好的黏附能力，这也是益生菌菌株筛选和应用的基础和前提。植物乳杆菌是一种重要的乳酸菌，目前，国内也一些有关植物乳杆菌降胆固醇的报道。但是筛选获得的植物乳杆菌的降胆固醇能力不高。例如，郭峰等（2014）研究了植物乳杆菌 M1-UVs29的降胆固醇作用，其降解率为37.3%，王今雨（2013）等研究了植物乳杆菌NDC75017的降胆固醇作用，其降解率为32.9%。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的不足，提供了一株具有降解胆固醇功能的植物乳杆菌L01及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01，保藏编号为CCTCC NO：M2014568。

植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) L01已于2014年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编 430072) ，保藏号为 CCTCC NO：M2014568。

本发明的第二个目的是提供了上述保藏编号为CCTCC NO：M2014568的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01在降解胆固醇中的应用。

本发明的第三个目的是提供了上述保藏编号为CCTCC NO：M2014568的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01在制备能够降解胆固醇的发酵乳制品中的应用。

上述保藏编号为CCTCC NO：M2014568的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01的筛选分离方法，包括以下步骤：

1）采用溶钙圈法，从广西柳州生产的传统泡菜中分离、纯化后获得22株乳酸菌；

2）以编码胆盐水解酶的功能性基因为引物，对步骤1）分离出的22株乳酸菌，利用 PCR扩增的方法进行快速筛选，获得有11株具有产胆盐水解酶能力的乳酸菌菌株；

3）采用硫酸铁铵显色法对步骤2）得到的11株具有产胆盐水解酶能力的乳酸菌菌株进行体外降胆固醇实验，获得3株降解胆固醇能力强的乳酸菌；

4）对步骤3）获得的3株降解胆固醇能力强的乳酸菌菌株进行耐酸、耐胆盐能力、益生元利用能力及抗生素耐药性实验，获得1株安全性高的乳酸菌菌株；

5）通过过氧化氢酶实验、革兰氏染色、菌体形态和 16SrRNA 序列分析方法，鉴定所获得的菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L01；

6）检测植物乳杆菌L01对肠道细胞的黏附能力；

7）检测植物乳杆菌L01的体内降胆固醇能力。

本发明的有益效果为：本发明提供的一株从传统泡菜中分离筛选获得的植物乳杆菌L01，来源于传统食品，具有很好的安全性，同时具有良好的人工胃液、肠液的耐受性和细胞疏水性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用，能够应用在制备发酵乳制品中，其降解胆固醇的能力强，可有效降低血清胆固醇，提高机体免疫力。

附图说明

图1为植物乳杆菌L01的体外黏附能力测定结果图。

图2为不同组别大鼠的血清总胆固醇含量测定结果图。

图3为不同组别大鼠的甘油三酯含量测定结果图。

图4为不同组别大鼠的低密度脂蛋白含量测定结果图。

图5为不同组别大鼠的高密度脂蛋白含量测定结果图。

具体实施方式

实施例1：

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01，保藏编号为CCTCC NO：M2014568，及其在降解胆固醇中的应用和其在制备能够降解胆固醇的发酵乳制品中的应用。

本发明所提供的具有高降胆固醇能力的植物乳酸杆菌 L01的筛选和鉴定：

（一）样品来源：

来源于广西柳州民间自产的传统发酵泡菜。

（二）从传统发酵泡菜中分离筛选得到乳酸菌：

在无菌的条件下，用移液枪吸取1mL泡菜汁液，接入MRS液体培养基中，37℃下富集培养48h；然后无菌吸取富集液1mL，用无菌的生理盐水稀释成8个浓度梯度，然后取10^-6、10^-7 和10^-8 3个浓度梯度的菌液0.1mL，涂于碳酸钙-MRS琼脂培养基中，37℃厌氧培养48h。选取具有明显溶钙圈的菌落，做革兰氏染色，并在数码显微镜下观察，挑取特征菌落，进一步分离纯化得到纯种乳酸菌。

（三）具有胆盐水解酶基因的乳酸菌的筛选：

（1）提取乳酸菌基因组DNA：

①取乳酸菌菌悬液1.5ml置于无菌离心管中，12000rpm离心1 min，去上清液；

②用无菌水洗涤沉淀，12000rpm离心1 min，去上清液；

③向沉淀中加入567μl的TE缓冲液，使沉淀悬浮，并加10μl溶菌酶(100mg/m1)于37℃保温2h；

④加入30μl 10%SDS和5μl蛋白酶K(10mg/m1)，混匀，37℃保温1.5h；

⑤加入100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀于65℃保温lOmin；

⑥用等体积酚：氯仿(1:1)抽提，12000rpm离心10min，将上清液转移到干净离心管中；

⑦用氯仿再抽提一次，取上清液移至干净管中加3μl RNA酶，混匀于37℃保温30min；

⑧向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，在-20℃下，静置30min，12000rpm离心10min，去上清液；

⑨用70％的乙醇洗涤沉淀两次，自然晾干，加TE缓冲液，低温保存备用；

（2）PCR扩增反应：

正向引物P1：5′-CGTATCCAAGTGCTCATGGTTTAA-3′，

反向引物P2：5′-ATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT -3′；

反应体系(50μL)：10×PCR buffer 5μl；脱氧核苷酸(dNTP)混合物 1μl；DNA模板 4μl；引物P1 1μl，引物P2 1μl；Taq DNA 聚合酶 0.5μl；双蒸水37.5μl；反应条件：预处理 94℃,4min;变性94℃,1min；退火55℃,1min；延伸72℃,1min；保温72℃,10min；30个循环；

（3）PCR产物电泳：

取0.2g琼脂糖用20mL TBE缓冲液(0.5×)加热溶解，用溴化乙锭(EB)染色，静置冷却到60℃左右倒胶，取3μLPCR扩增产物与2μl溴酚蓝混匀，点样于琼脂糖凝胶板上，在TBE缓冲液(0.5×)中进行电泳测定，调电压50v，一段时间后，取出凝胶板，在紫外灯下观察获得具有明显电泳条带的菌株，命名为L01。

（四）菌株16SrDNA鉴定：

(1) 菌株基因组DNA提取：

将菌株L01接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h，取100μl发酵液,加入等体积的氯仿，混匀，于4℃下12000rpm离心10min，收集菌体。其余步骤采用DNA提取试剂盒的操作步骤进行操作。

(2) PCR扩增反应：

① 扩增引物：

正向引物为P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGTGAACGAACGG-3′；

反向引物为P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′；

② 反应体系及反应条件：

将提取的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50μl反应体系（同前述）进行PCR扩增，反应条件除退火温度为56℃外，其余同前述的反应条件，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(3) 纯化PCR产物：

按照试剂盒的方法纯化PCR产物（胶回收、TA克隆、转化、质粒提取）。

(4) 测序：

将纯化过的质粒邮寄到检测机构进行测序，以此确定菌株属性。测序工作由上海生物工程有限公司完成。

将菌株L01的质粒测序结果登录NCBI网站的DNA数据库，使用BLAST软件，将测得的DNA序列与数据库中已存在的相似序列进行比对，结果发现菌株L01的基因序列，在所有相似的序列中，与乳杆菌属的植物乳杆菌(Lactobacillus. plantarum) 的同源性为99%，因此判断菌株L01是植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L01。

实施例2：

体外降胆固醇能力的测定：

将胆固醇-MRS液体培养基，分装于5支灭菌过的洁净试管中，每支试管装5mL。以2%的接种量将各菌悬液接种至胆固醇MRS液体培养基的4支试管中（留一支作对照），37℃恒温厌氧培养24h。取发酵液0.2mL，加无水乙醇至10mL，振荡充分混匀，1500rpm离心10min得上清液。先用移液枪取2mL上清液至干燥试管中，然后再加入2mL硫酸铁铵显色液，混匀，冷却到室温，在560nm处测定吸光度值。利用以下公式计算胆固醇降解率：

胆固醇降解率＝（对照液OD₅₆₀- 发酵上清液OD₅₆₀）/对照液OD₅₆₀×100%

测得菌株的降胆固醇能力为46.4%。

实施例3：

植物乳杆菌的胃肠道耐受性模拟实验：

（1）耐酸性实验：

用盐酸将MRS液体培养基的pH值分别调为2.0,3.0,4.0，分别取2 mL植物乳杆菌L01菌悬液接种到100mL不同pH值的培养基中，37℃厌氧恒温培养24 h。然后用灭菌生理盐水将不同pH的发酵液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7和10^-8 3个浓度梯度的菌液0.1mL，涂布于MRS琼脂培养基中，37℃ 恒温培养48 h，以pH值为6.8的常规MRS发酵液作为对照。通过平板计数法计算菌落数，存活率换算公式如下：

存活率＝（不同酸度发酵液中活菌数∕常规发酵液中活菌数）×100%

植物乳杆菌L01的耐酸能力的测定结果如表1所示。

表1

。

（2）耐胆盐实验：

用猪胆盐粉末配制0.1%、0.2%、0.3%、0.4%不同胆盐浓度的MRS-胆盐液体培养基，取2 mL植物乳杆菌L01菌悬液接种到100mL不同胆盐浓度的培养基中，37℃ 厌氧恒温培养24 h。然后用灭菌的生理盐水将不同胆盐浓度的发酵液进行梯度稀释，取10^-6、10^-7 和10^-8 3个浓度梯度的菌液0.1mL，分别涂布于MRS琼脂培养基中，37℃ 厌氧恒温培养48 h，以常规MRS发酵液作为对照。通过平板计数器来计算菌落数，按如下公式计算其存活率。

存活率＝（不同胆盐浓度发酵液中活菌数∕常规发酵液中活菌数）×100%

植物乳杆菌L01的耐胆盐能力的测定结果如表2所示。

表2

。

实施例4：

植物乳杆菌L01的体外黏附能力实验：

（1）细胞培养：

将加细胞冷冻液保存液氮中(-196℃)的Caco-2细胞复苏后置于培养瓶中，加入DMEM完全培养液后，于37℃，浓度为5%二氧化碳培养箱中培养，每2 d更换培养液，待细胞生长良好时(70 %融合)，用0.25 %胰酶-EDTA消化传代，传代5次左右进行黏附试验。

（2）黏附实验：

将培养好的Caco-2细胞进行消化，用DMEM的完全培养液稀释细胞使浓度达到约5×10⁵个/mL，装于6 孔组织培养板中，每孔2 mL，于CO₂培养箱（ 5% CO₂ 95%空气）中37 ℃培养至细胞长至单层。将组织培养板各孔中培养液弃去，用无菌PBS缓冲液洗板2 次。其中一孔用 0.5 mL胰酶-EDTA消化液进行消化，之后加入0.5 mL无菌PBS缓冲液，使细胞完全消化并混匀，用血球计数板计算细胞浓度。其他5 孔各加入1 mL DMEM不完全培养液和1 mL菌悬液（菌悬液中植物乳杆菌L01的浓度分别为1×10⁴、 1×10⁵、 1×10⁶、 1×10⁷、1×10⁸ CFU/mL），混合均匀， 37℃培养2h后弃去组织培养板各孔中混合液，用无菌PBS缓冲液洗涤4次，除去未黏附的菌体。每孔用0.5 mL胰酶EDTA消化液进行消化后加入0.5 mL无菌PBS缓冲液，进行梯度稀释，平板计数法计算黏附的细菌数。按如下公式计算黏附率。

黏附菌数/CFU/Caco-2细胞）=黏附细菌数（CFU/孔）/ Caco-2细胞数（个/孔）。

植物乳杆菌L01的体外黏附能力测定结果如图1所示。可以看出，菌体浓度越高，植物乳杆菌L01的黏附能力越强。

实施例5：

SD 大鼠体内试验：

(1) 实验动物及分组：

实验使用5周龄雄性 SD 大鼠 30 只，平均体重130.8±9.6g。每只分别喂养于单独隔离的鼠笼，室温维持在 24±2℃，相对湿度为 60±4%，并且定时12小时光照和12小时黑暗。饲料和水由老鼠自由取食。SD大鼠在第一周适应期间喂食普通基础饲料。适应一周后，将大鼠随机分为 3 组，每组10只。

C组（空白对照组）：此组 SD 大鼠喂食基础普通饲料。

HC组（高胆固醇组）：此组 SD 大鼠喂食高胆固醇饲料(添加1.25%胆固醇和0.3%胆酸钠)。

HL组（高胆固醇 + 植物乳杆菌 L01组）：此组 SD 大鼠喂食高胆固醇饲料，并且每天灌胃1ml菌数含量为 1×10¹⁰CFU/ml的乳酸菌菌液。

(2) 实验内容：

实验进行 8 周后，将大鼠禁食 12h 后乙醚麻醉，心脏采血 2ml 放入 4℃冰箱。此外，将肝脏、脾脏、肾脏取出用生理盐水冲洗并擦拭干净后称重，计算大鼠脏器指数，结果如表3所示。

表3

。

结果表明饲喂植物乳杆菌 L01对大鼠没有明显毒副作用。

(3) 血清样品制备及胆固醇各指标分析：

将采集到的血液样品低温低速离心取上层淡黄色液体，立即冷冻保存于低温冰箱中备用。血清样品中总胆固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白四个指标，均利用市售相应指标的常规试剂盒来测定，结果见图 2、3、4、5。结果表明植物乳杆菌L01可以显著降低大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，但是对高密度脂蛋白的含量没有明显改变。

本发明提供的菌株植物乳杆菌 L01可以起到显著降低胆固醇的功效，具有良好的耐酸、耐胆盐和肠道黏附性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用。

本发明提供的菌株植物乳杆菌 L01的上述特性使其能够应用于制备发酵乳制品及制备保健食品和药品中。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01，保藏编号为CCTCC NO：M2014568。

2.权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：M2014568的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01在降解胆固醇中的应用。

3.权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：M2014568的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L01在制备能够降解胆固醇的发酵乳制品中的应用。