CN103992969A - 一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌，属于微生物技术领域。该植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1-UVs300，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CGMCC No.7972。本发明所提供的植物乳杆菌具有来源广泛，分离方法简单，安全性高，毒副作用小的特点，其细菌素具有抑制金黄色葡萄球菌等病源菌生长的活性，天然防腐效果显著，适用于产业化推广应用。

Description

一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

技术背景

植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧菌。菌体呈短杆状，不产芽孢，是人体消化道内的有益菌群，其代谢可产生双乙酰、细菌素等多种抑菌物质，能调整肠道菌群关系，维持菌群平衡。

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成作用产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽。随着人们生活水平不断提高，食品防腐剂的安全条件日益受到关注，化学防腐剂的潜在安全隐患以及不断出现的食品安全问题不容小觑，寻找一种新的替代品以减少化学防腐剂可能造成的危害已成为国内外学者的研究热点。细菌素由于无毒副作用、无残留、无抗药性等优点，并可抑制或杀死一些食物腐败菌，同时能被消化道中的部分蛋白酶分解，不会在人体内积蓄产生不良反应，已逐渐成为一种新型的天然食品防腐剂。

目前，Nisin已经作为一种公认安全、无毒的天然食品防腐剂在国际上被广泛应用到牛奶、罐头、肉制品等中。但在许多学者的研究证明应用具有产细菌素能力的乳酸菌进行发酵过程中，可以防止和控制杂菌污染，因此，一般认为添加能产细菌素的乳酸菌比直接添加细菌素效果更好，且操作更简便。这推动了科研工作者对高效抑菌菌株的筛选，以期找出细菌素高产、抑菌效果更强的菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌素具有抗菌活性的植物乳杆菌。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1-UVs300，其在位于中国北京市的中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.7972。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1-UVs300，其细菌素具有抗菌活性。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1-UVs300，可在抑制细菌生长中应用。

所述植物乳杆菌的部分16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果：

1.本发明中的植物乳杆菌M1-UVs300从各种来源的发酵制品中获得，来源广泛，分离方法简单，安全性高，毒副作用小。

2.本发明中的植物乳杆菌M1-UVs300以4％的接菌量，培养20h，已表现出十分明显的抑菌效果，扩大培养所需时间短，抑菌效果好。

3.本发明中的植物乳杆菌M1-UVs300可以应用到发酵乳制品、发酵蔬菜制品、发酵肉制品等各种发酵食品中，对于改善和提高各种发酵食品的质量和安全具有重要的意义。同时该菌株在满足发酵性能且兼具降高效胆固醇功能的基础上，天然防腐的功效显著，对于食品工业尤其是功能性食品具有及其重要的应用价值。

附图说明

图1诱变作用对植物乳杆菌抑菌圈直径的影响；

(3，左16mm、右15.5mm；5，左17mm、右15mm；6，左18mm、右15mm；7，左15mm、右16mm)。

图2稀释作用对植物乳杆菌抑菌圈直径的影响；

(1，原浓度，2，稀释2倍；3，稀释4倍；4，稀释8倍，左侧为诱变前上清液，右侧为诱变后上清液)。

具体实施方式

本发明提供了一种植物乳杆菌，菌株名称为发酵植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1-UVs300，已经于2013年7年30日在位于中国北京市的中国典型培养物保藏中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCC No.7972。下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1发酵植物乳杆菌M1-UVs300的分离鉴定

1、材料

样品：各种来源的发酵蔬菜制品，如酸菜、泡菜等。

试剂：

实验仪器：

1.培养基的配制：

⑴MRS液体培养基：蛋白胨l0g，牛肉膏l0g，酵母提取物5g，K₂HPO₄2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80lmL，MgSO₄·7H₂O0.5g，MnSO₄0.25g，蒸馏水1000mL，pH值6.2～6.4，121℃灭菌20min。固体培养基在液体培养基的基础上添加1.8％的琼脂。

⑵耐盐性试验培养基：MRS液体培养基分别添加2％、4％和6％的NaCl。

⑶耐硝酸盐性试验培养基：MRS液体培养基分别添加50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg的NaNO₂。

⑷产粘液培养基：MRS同体培养基，以5％的蔗糖代替葡萄糖。

⑸产H₂S培养基(醋酸铅纸条法)：蛋白胨10g，NaCl5g，牛肉膏l0g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，112℃灭菌20～30min。另外将普通滤纸剪成0.5～lcm宽的纸条，长度根据试管与培养基高度而定。用5～10％的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿中灭菌备用。

⑹H₂O₂产生检测培养基

基础培养基：牛肉膏0.5g，酵母膏0.5g，吐温800.05mL，MnSO₄·4H₂O0.01g，琼脂1.5g，pH6.5，121℃15min。单独灭菌的无菌糖1％，倾倒平板。上层倾倒一薄层(1～2mL)同样培养基，加入4％MnO₂。

⑺抑菌试验培养基：

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。

⑻蛋白质降解活性试验培养基：在MRS固体培养基中添加15％脱脂乳粉。

⑼脂肪分解活性试验培养基：在MRS固体培养基中添加15％的猪油和中性红指示剂。

⑽高胆固醇MRSO-CHOL培养基：以1000mL的液体培养基计，含1.0mg/mL胆固醇胶束溶液制备：准确称量胆固醇0.1g放入小烧杯中，加入0.2g胆盐、0.1g蔗糖酯、1mL吐温80搅拌均匀，再移取5mL的冰乙酸加热溶解，把溶解液用超声波处理15min后，快速加入到配制好的液体培养基中，边加边搅拌，使其形成均匀稳定的胶体溶液。

配制X-gal溶液(20m/mL)以直径0.22μm一次性滤器过滤除菌，取50μL铺于MRS固体培养基上涂布均匀备用。

乳酸纸层析试剂

⑴展开剂：水、苯甲醇、正丁醇以1:5:5的量相混合，然后加1％的甲酸。

⑵显色剂：0.04％的溴酚蓝酒精溶液，用0.lmol/L NaOH调节pH到6.70。

2.发酵植物乳杆菌M1-UVs300的分离、纯化：

2.1菌株分离：各种来源的发酵蔬菜制品如酸菜、泡菜。分别取20g样品于180mL无菌蛋白胨水(蛋白胨1g/L,Nacl0.85g/L，吐温80lmL)震荡(震荡摇床200r/min，震荡60min)混匀，系列稀释，取上清液以MRS+3％CaCO₃作培养基倾倒平板，挑取产生溶钙圈的单菌落，划线分离纯化，纯菌进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性和触酶阴性菌，进行斜面保存。

2.2初筛：对出筛出的乳酸菌进行发酵特性试验(产粘性实验、耐盐性实验、耐亚硝酸盐性实验、产生H₂O₂、产氨实验、葡萄糖产气实验、产H₂S实验、石蕊牛乳实验、硝酸盐还原能力实验、氨基酸脱叛酶实验、抑菌实验、产酸能力实验、乳酸纸层析试剂)在发酵肉制品中，优势菌株应具有耐6％NaCl和150mg/kgNaNO₂、产酸速度快、发酵葡萄糖不产气、不产H₂S、水解精氨酸不产氨、不具有氨基酸脱梭酶活性、不产粘液、不产H₂O₂、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、发酵碳水化合物产物主要为乳酸，从分离的乳酸菌中筛选优良菌株。实施例2植物乳杆菌M1-UVs300的抗菌活性

植物乳杆菌作为生产发酵食品的主要发酵剂，所产植物乳杆菌素能够抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌等食源性病原菌，可以直接用于食品的防腐保鲜。

取一接菌环初始菌株接入15mL MRS液体培养基，37℃培养24h，传代三次后，取600μL菌液接入150mL MRS肉汤培养基中扩大培养，37℃培养20h，将菌液4000r/min离心20min，取上清液备用。

细菌素抗菌活性的检测采用牛津杯法。在培养皿中注入灭菌的营养琼脂15mL，水平放置使之凝固，作为底层。用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。取指示菌培养基(本次试验使用的是营养琼脂)，冷却至50℃左右，加入400μL金黄色葡萄球菌菌液混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。用镊子拔出牛津杯，在小孔中加满相同量的上清液(100μL)，每个平板左侧为诱变前菌株上清液，右侧为诱变后菌株上清液。将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养24h后(其中以真菌做指示菌的培养时间为30℃、3d)取出测量抑菌圈直径。

结果如图1所示，诱变前的直径左侧添加的为诱变前菌株上清液，右侧添加的为诱变后菌株的上清液。由图可知，诱变前后菌株均对金黄色葡萄杆菌有显著的抑制作用，且诱变后的菌株抑菌效果没有明显的变化。

如图2所示，稀释作用对抑菌效果有十分显著的影响，随着上清液浓度的降低，抑菌作用明显减弱，稀释四倍之后，对金黄色葡萄杆菌几乎无抑制作用。

1为原浓度，2、3、4一次稀释2倍，左侧为诱变前上清液，右侧为诱变后上清液。

结果：1号：17.5mm   18mm

      2号：14mm   13mm

      3号以后抑菌圈不明显

实施例3

发酵植物乳杆菌M1-UVs300灌胃对高血脂小鼠的疗效观察。动物模型分为正常对照组(NC)，诱导的高脂对照组(HFC)，低剂量组(LD)，中剂量组(MD)和高剂量组(HD)分别给予发酵植物乳杆菌M1-UVs300灌胃饲养，观察各组小鼠的体重、病理改变等。结果表明：发酵植物乳杆菌M1-UVs300能够降低实验动物的血脂水平，减轻临床症状，能有效防治由高血脂所引发的各种冠心病、动脉粥样硬化、高脂血症等心血管疾病。

一、材料和方法：

1、实验动物分组和饲养

选用雌雄各半的Wistar大鼠60只，6.8周龄，体重180～220g，购于长春生物制品公司，饲养于清洁级动物房。适应性饲养1周后，按体重分为4组：正常对照组(NC)，高脂对照组(HFC)，低、中和高剂量组(LD，MD和HD，菌液用生理盐水稀释为l×10⁴CFU/mL、l×10⁷CFU/mL、1×l0CFU/mL后备用)。

实验基础饲料为：玉米面30％，豆饼粉20％，麦麸25％，面粉16％，鱼粉5％，骨粉2％，酵母粉1％，食盐1％；

实验高脂饲料为：基础饲料93％，胆固醇1.5％，胆酸钠0.5％，猪油5％。

正常对照组(NC)饲喂基础饲料，其余四组均喂高脂饲料。

1.2主要试剂

发酵植物乳杆菌M1-UVs300菌悬液，胆固醇，猪胆盐，甘油三酯，TC、TG、HDL-C试剂盒(北京中生生物试剂公司提供)，牛肉粉(北京奥博星生物技术责任有限公司、20040607)、吐温80(西安富力化学厂、批号021125)、磷酸二氢钾(河南省焦作市化工三厂、批号20010404)、琼脂(北京奥博星生物技术责任有限公司)、柳氮磺胺毗啶片(SASP，上海福达制药有限公司、批号041207)、DSS(分子量5000，Sigma公司)。其它试剂均采用分析纯。

1.3主要仪器

生化全自动分析仪，日立7020；高速台式离心机(TGL.16G)上海安宁离心机厂；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；组织均浆器；电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂；液体快速混合器；JEM-1200EX电子显微镜。

2、实验方法：

2.1实验细菌：发酵植物乳杆菌M1-UVS300如前述方法分离、鉴定所得。菌在MRS培养基中厌氧培养24小时后收集菌落，用分光光度计计数后备用。

2.2动物模型：人为喂饲高胆固醇饲料以制造动物高脂模型。益生菌(发酵植物乳杆菌M1-UVs300菌液灌胃均从饮用菌悬液开始前2天先开始进行，每只小鼠每天灌胃一次，每次0.3ml/20g。

2.3实验分组：实验Wistar大鼠，随机分成5组，各组均为12只分组情况如下。

A、正常对照组：基础饲料，正常饮食无特殊处理。

B、阳性高脂对照组：用高脂饲料喂养。

C、高剂量组：用高脂饲料喂养l×10¹⁰CFU/mL菌液灌胃。

D、中剂量组：用高脂饲料喂养，1×10⁷CFU/mL菌液灌胃。

E、低剂量组：用高脂饲料喂养，1×10⁴CFU/mL菌液灌胃。

2.4血脂测定：实验第8周末，空腹10h，采眼框血，测定TC、TG和HDC-C含量，TC、TG、HDL-C均采用北京中生生物试剂公司试剂盒测定。

2.5数据统计分析

各项数据均采用生物统计SAS(8.0版)软件在计算机上进行方差分析，两组间比较用T检验。

二、结果

对大鼠血脂的影响如表1，HFC组的TC、TG极显著高于NC组(P<0.01)，HDL-C显著低于NC组(P<0.05)，表明饲喂高脂饲料可导致大鼠高脂血症；LD、MD和HD组TC、TG极显著低于HFC组(P<0.01)，HDL-C极显著高于HFC组(P<0.01)。提示菌悬液具有降血脂作用，而且MD组降血脂效果优于LD和HD组。

表1对大鼠血清TC、TG和HDL_-C含量的影响

a：P<0.01和正常组比较,b：P<0.01和高脂组比较.

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum M1-UVs300，其特征在于，于2013年7月30日在位于中国北京市的中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.7972。

2.根据权利要求1所述植物乳杆菌，其特征在于，其细菌素具有抗菌活性。

3.植物乳杆菌CGMCC No.7972，在抑制细菌生长中应用。