CN110804553B - 一种提高乳酸菌保存存活率的培养基及其应用 - Google Patents

一种提高乳酸菌保存存活率的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高乳酸菌保存存活率的培养基及其应用。本发明提供的培养基是将乳酸菌液体培养基中的碳源由葡萄糖替换为蔗糖，还可以包含碳酸钙。本发明通过改变培养基碳源和添加盐类物质中和培养过程中产生的乳酸，提高培养基pH，进而提高乳酸菌的冷藏保存率。经过比较研究，发现以蔗糖代替葡糖糖的改良MRS培养基，对能利用蔗糖的乳酸菌培养效果无不良影响，却能显著降低其冷藏保存的死亡率。培养时培养液添加1％的碳酸钙，其保存效果更佳。本发明利用的碳源为蔗糖，成本低，易于利用。酸的中和盐类是碳酸钙，用量少、成本低。

Description

一种提高乳酸菌保存存活率的培养基及其应用
技术领域
本发明属于微生物保存领域，特别涉及一种提高乳酸菌保存存活率的培养基及其应用。
背景技术
乳酸菌作为发酵食品、酸奶、青贮饲料等的发酵剂被广泛利用，因此它的低成本培养、长时间保存尤为重要。到目前为止，其标准培养基都是以葡萄糖为碳源，培养后冷藏保存菌数减少速度快，长时间保存影响其使用效果。一种改善方法是将培养好的乳酸菌进行真空冷冻干燥，虽然这种方法具有活菌数高、保质期长、质量稳定等优点，但冷冻干燥需要昂贵的冻干设备和繁琐的冻干程序，对于条件不具备的生产使用者难以实现。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高乳酸菌保存存活率的培养基。
本发明的另一目的在于提供上述提高乳酸菌保存存活率的培养基的应用。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种提高乳酸菌保存存活率的培养基，是将乳酸菌液体培养基中的碳源由葡萄糖替换为蔗糖。
所述的乳酸菌液体培养基是适合乳酸菌生长、且含葡萄糖的培养基，包括但不限于MRS液体培养基、SL液体培养基、LBs液体培养基；优选为MRS液体培养基。
所述的MRS液体培养基的组成如下：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、吐温80 1mL/L、柠檬酸铵2g/L、醋酸钠5g/L、七水合硫酸镁0.1g/L、四水合硫酸锰0.05g/L、磷酸氢二钾2g/L、蒸馏水余量。
所述的SL液体培养基的组成如下：酪蛋白水解物10g/L、酵母提取物5g/L、柠檬酸二铵2g/L、醋酸钠25g/L、七水合硫酸镁0.58g/L、葡萄糖20g/L、吐温80 1mL/L、磷酸氢二钾6g/L、七水合硫酸亚铁0.03g/L、四水合硫酸锰0.15g/L、蒸馏水余量。
所述的LBs液体培养基的组成如下：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、柠檬酸铵2g/L、醋酸钠5g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、吐温80 1mL/L、磷酸氢二钾2g/L、四水合硫酸锰0.05g/L、蒸馏水余量。
所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基还包括碳酸钙。
所述的碳酸钙在所述提高乳酸菌保存存活率的培养基中的含量优选为质量体积比0.5～1.5％；更优选为1％。
所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基在冷藏保存乳酸菌中的应用，优选包括如下步骤：用所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基培养乳酸菌，然后将得到的乳酸菌培养液冷藏备用。
所述的乳酸菌优选培养至对数增长期或平台期。
所述的乳酸菌是能利用蔗糖的乳酸菌；如鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌。
所述的鼠李糖乳杆菌选用鼠李糖乳杆菌HT1为试验对象。
所述的植物乳杆菌选用植物乳杆菌CCZZ1为试验对象。
所述的培养的条件为适合乳酸菌生长的条件，优选为于35～38℃培养；更优选为于37℃培养。
所述的培养的时间优选为24～72h；更优选为24h。
所述的冷藏的温度优选为2～8℃；更优选为4℃。
所述的冷藏的时间优选为少于30天。
与其他碳源以及现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过改变培养基碳源和添加盐类物质中和培养过程中产生的乳酸，提高培养基pH，进而提高乳酸菌的冷藏保存率。经过比较研究，发现以蔗糖代替葡糖糖的改良MRS培养基，对能利用蔗糖的乳酸菌培养效果无不良影响，却能显著降低其冷藏保存的死亡率。培养时培养液添加1％的碳酸钙，其保存效果更佳。本发明利用的碳源为蔗糖，成本低，易于利用。酸的中和盐类是碳酸钙，用量少、成本低。
(2)本发明的方法可冷藏贮藏乳酸菌更长时间，菌数减少缓慢。
(3)本发明的方法不需要冻干干燥，操作简单方便且效果明显。
附图说明
图1为不同碳源对乳酸菌培养的影响结果图；其中，左图为鼠李糖乳杆菌HT1，右图为植物乳杆菌CCZZ1。
图2为不同碳源对乳酸菌冷藏保存的影响结果图；其中，左图为鼠李糖乳杆菌HT1，右图为植物乳杆菌CCZZ1。
图3为在乳酸菌培养时添加不同水平CaCO3对乳酸菌冷藏保存存活率的影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实例1：不同碳源对乳酸菌培养、保存的影响
以乳酸菌发酵剂广泛利用的鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌为代表菌种进行测试实验，具体使用了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HT1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCZZ1两个菌株，这两个菌株都是华南农业大学草产品加工研究室的专利菌株(其中，鼠李糖乳杆菌HT1已在ZL201110118135.4中公开和植物乳杆菌CCZZ1已在专利ZL201210192285.4中公开)。将两种乳酸菌分别通过在MRS固定培养基上划线活化后，挑取单菌落再用MRS液体培养基37℃培养24小时，混匀后分别按0.02mL菌液接种于5mL液体培养基的方式，将两种乳酸菌分别接种等量的菌液于MRS液体培养基、蔗糖改良MRS液体培养基、果糖改良MRS液体培养基中，37℃静置培养24h、48h、72h，每个处理3个重复。不同时间培养后，用MRS固体培养基测定菌数。无论鼠李糖乳杆菌HT1还是植物乳杆菌CCZZ1，3种碳源培养的菌数在培养24h后均随着培养时间的延长逐渐减少，但在任一相同培养时间下，3种碳源的乳酸菌菌数差异不显著(P>0.05)(图1)。因此，以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源对这类乳酸菌培养都可，考虑成本因素，蔗糖作为这两种乳酸菌的碳源是较好的选择。
将培养24h后的乳酸菌液于4℃冷藏保存，在不同的时间取样，用MRS固体培养基测定菌数。从图2可见，4℃冷藏保存4周时，用蔗糖改良MRS液体培养基培养的乳酸菌存活率都显著高于葡萄糖的培养基(即MRS液体培养基)。
实例2.添加碳酸钙对乳酸菌保存的影响
以植物乳杆菌CCZZ1为对象，在蔗糖改良MRS培养基中添加不同比例的碳酸钙进行乳酸菌培养，添加0.5％～1.5％的CaCO3对培养24h的乳酸菌数量无显著影响(P>0.05)。但在后续冷藏保存过程中(3-24d)，不同水平的CaCO3对存活率具有显著影响(P<0.05)，特别是添加较高浓度(1.0％和1.5％)的CaCO3，更加有效地提高了乳酸菌存活率，24d时乳酸菌存活率仍高达92％(图3)。综合考虑，乳酸菌培养时添加1.0％CaCO3，对随后的冷藏保存极为有利。
培养基制备和菌数测定方法：
1)培养基制备方法：
MRS液体培养基组成为蛋白胨(Proteose peptone)10.0g、牛肉膏(Beef extract)10.0g、酵母提取物(Yeast extract)5.0g、葡萄糖(Dextrose)20.0g、吐温80(Polysorbate80)1mL、柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g、醋酸钠(NaAc)5.0g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05g、磷酸氢二钾(K2HPO4)2.0g、蒸馏水(H2O)定容至1000mL；
MRS固体培养基是在MRS液体培养基中加15g/L琼脂(Agar)；
蔗糖改良MRS液体培养基：与MRS液体培养基的区别仅在于，用等量蔗糖取代葡萄糖。
果糖改良MRS液体培养基：与MRS液体培养基的区别仅在于，用等量果糖取代葡萄糖。
所有的培养基121℃灭菌20min。
2)菌数测定方法：无菌条件下取培养或保存不同时间的培养液1mL，加入装有9mL的生理盐水试管，混匀后取1mL继续稀释到10-9，然后取稀释后的培养液0.1mL于MRS固体培养基上，涂抹均匀后倒置，37℃厌氧培养2～3d计测菌数。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高乳酸菌保存存活率的培养基在冷藏保存乳酸菌中的应用，其特征在于包括如下步骤：用所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基培养乳酸菌，然后将得到的乳酸菌培养液冷藏备用；
所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基是将MRS液体培养基中的碳源由葡萄糖替换为蔗糖；
所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基还包括碳酸钙；碳酸钙在所述提高乳酸菌保存存活率的培养基中的含量为质量体积比0.5～1.5%；
所述的培养的条件为于35～38℃培养；
所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的碳酸钙在所述提高乳酸菌保存存活率的培养基中的含量为质量体积比1%。
3.根据权利要求1所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基在冷藏保存乳酸菌中的应用，其特征在于：
所述的乳酸菌培养至对数增长期或平台期。
4.根据权利要求1所述的提高乳酸菌保存存活率的培养基在冷藏保存乳酸菌中的应用，其特征在于：所述的冷藏的温度为2～8℃。
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