CN115029247A - 一种植物乳杆菌复合冻干保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种植物乳杆菌复合冻干保护剂。这株植物乳杆菌的名称为植物乳杆菌S58(LactobacillusplantarumS58)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏编号为CCTCCNO：M2019595。植物乳杆菌复合冻干保护剂，包括如下成分：脱脂奶粉9.24％，青稞多糖5.62％，谷氨酸钠4.85％。将植物乳杆菌菌液与复合冻干保护剂液体按1:2比例进行冷冻干燥，冻干存活率达到90.49％。本发明提供的冻干保护剂具有存活率高、低污染、便于保藏、运输，使用方便等优点。

Description

一种植物乳杆菌复合冻干保护剂
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌复合冻干保护剂，属于微生态制剂工艺技术领域。
背景技术
植物乳杆菌是一种革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，因其促进健康的特性而被用作食品补充剂或发酵剂。植物乳杆菌可以天然定植于人类胃肠道，因其益生菌特性而受到人们的高度重视。植物乳杆菌过程保藏过程中，为了避免菌体的衰老死亡，通常是将菌体的水分去除，以避免菌体的新陈代谢，从而保存菌体。通常使用的去除水分的方法是冷冻干燥法，冷冻干燥又称升华干燥，其基本原理是在低温低压下传热传质。冷冻干燥过程会对菌体细胞造成一定的伤害甚至使菌体死亡，主要原因包括冻干过程中形成的冰晶将菌体撑破和部分蛋白变性等，降低了菌种的存活率，对生产十分不利。在实际生产中通常采用各种保护剂以保护菌体免遭破坏。
冻干保护剂根据不同的标准可以分成不同的类别，按其作用方式可分为渗透型和非渗透型；按分子大小分为低分子和高分子化合物；根据其性质又可分为多元醇类，糖类，氨基酸类，蛋白质及肽类，聚合物类，其他类型的保护剂等。保护剂中蛋白类如乳清蛋白等保护机理为蛋白类可以在细胞外形成一层致密的蛋白保护层，通过蛋白保护层阻止细胞与外界的接触，降低氧、营养物等与菌体接触的几率，进而减少菌体体内的代谢，最终达到稳定益生菌在冷冻干燥过程的活性。保护剂中的多糖类如海藻糖、透明质酸钠等作用机理是：多糖类的氢键等可以与微生物细胞膜上的糖蛋白等结合，使细胞的功能蛋白、多糖等相对稳定；多糖类可以在微生物细胞膜周围形成玻璃化的保护壳，保护益生菌的空间结构稳定。保护剂从外层包裹着菌体，极大地减少了它们与氧的接触，进而降低了细胞代谢死亡率。冻干保护剂既可以提高菌体在冻干过程中的存活率，又可以巩固其在后期保藏时的稳定性。
此外，菌体与保护剂的配比会影响冻干后细胞存活率。若保护剂太少，会有大量细胞膜裸露在介质中，在冻干时就可能改变细胞通透性，不能起到保护菌体的作用；若保护剂太多，细胞的渗透压和通透性也会受影响。另外，几种物质的复合物较单一保护剂有更好效果。因此，对复合冻干保护剂进行响应面试验，选出最优配比，提高菌体在冻干和储藏过程中的稳定性和存活率，对于工业生产具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌复合冷冻干燥保护剂。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种植物乳杆菌复合冻干保护剂，包括如下成分：脱脂乳粉、青稞多糖和谷氨酸钠。
进一步的，按植物乳杆菌菌液的重量百分比计，包括如下成分：
脱脂奶粉1％-20％
青稞多糖2％-10％
谷氨酸钠3％-7％
进一步的，按植物乳杆菌菌液的重量百分比计，包括如下成分：
脱脂奶粉9.24％
青稞多糖5.62％
谷氨酸钠4.85％
进一步的，将植物乳杆菌菌液与复合冻干保护剂液体按1:1比例进行冷冻干燥，冻干存活率达到90.49％。
本发明的有益技术效果在于：本发明提供的植物乳杆菌复合冻干保护剂，能够在冻干、干燥、保藏等不利的条件下免受冻伤，因此能够应用于低温下的细菌细胞保护，大幅度提高菌种冻干存活率。
附图说明
图1为脱脂乳粉和青稞多糖对冷冻干燥存活率交互影响；
图2为脱脂乳粉和谷氨酸钠对冷冻干燥存活率交互影响；
图3为青稞多糖和谷氨酸钠对冷冻干燥存活率交互影响；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:
1.植物乳杆菌的活化培养：
将冻存于安瓿管中的植物乳杆菌CCTCC NO：M 2019595用接种于MRS培养基中，37℃恒温培养18h。然后用接种环挑取一环菌悬液在MRS固体平板上划线，37℃恒温培养48h，然后将平板上长出的单菌落接种至装有10mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h。再次将培养好的菌液在MRS培养基平板上划线培养，37℃恒温培养48h后，将单菌落接种至装有10mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养48h。将以上操作重复3次，完成植物乳杆菌的活化。
2.植物乳杆菌的种子液的制备：
将活化好的植物乳杆菌按2％的接种量接种至装有150mL MRS培养基的250mL锥形瓶中，37℃恒温培养18h。
3.菌体收集：
收集MRS液体培养基37℃培养18h后的菌体，在4000r/min,4℃条件下离心10min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体两次，获得植物乳杆菌菌体。
4.活菌计数：
采用平板计数法，取1mL待测菌液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，每个梯度3个平行，选择适当的稀释梯度，吸取10uL菌液于固体MRS培养基，37℃培养48h，待长出菌落后进行计数，计数公式如下：
植物乳杆菌活菌数(CFU/mL)＝每平皿平均菌体数(CFU)×100×稀释倍数。
5.冻干活菌计数方法：
取1g菌泥加入到9mL无菌水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行测定。分别吸取样品稀释液10uL，每个稀释度做三个平板，倒置于37℃恒温箱中培养48h，计数，并按如下公式计算：
植物乳杆菌菌泥活菌数(CFU/g)＝每平皿平均菌体数(CFU)×100×稀释倍数
6.保护剂与冻干粉的制备：
各保护剂按质量浓度配制成实验设计浓度的水溶液。菌体离心收集后得菌泥，加保护剂溶液于离心管中，其中V菌泥:V保护剂为1:1。将其放于-80℃条件下预冻3h-5h，而后取出在冷冻干燥机中干燥，冷阱温度-36℃左右，真空度10Pa，干燥36h左右后得到植物乳杆菌干粉，测定干粉的活菌数。
7.冻干存活率的测定：
按照如下公式计算在冻干保护剂作用下植物乳杆菌的存活率，由此确定较好的保护剂配方。
存活率(％)＝(冻干样品复水后1ml菌液中测得的活菌数/冻干前1ml菌液测得活菌数)×100％
8.复合冻干保护剂的配方优化：
采用单因素试验，对脱脂乳粉，青稞多糖，谷氨酸钠浓度进行优化，选出最佳单因素比例，分别是脱脂乳粉10％，青稞多糖4％，谷氨酸钠4％；
根据菌种冻干保护剂的单因素试验结果，以菌种存活率为考察目标利用Design-Expert软件(Version 8.06Stat-Ease Inc.MN，USA)进行响应面分析，试验因素与水平设计见表1，试验结果见表2.
表1试验因素与水平设计表
Figure BDA0003670186660000041
表2响应面优化植物乳杆菌冻干保护剂配方试验设计与结果
Figure BDA0003670186660000042
Figure BDA0003670186660000051
利用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行二次多项回归拟合，得到植物乳杆菌冻干保护剂不同比例配方存活率的回归方程：
Y＝88.86-0.1212A+2.22B-0.09C-2.81AB-1.96AC-1.76BC-9.30A2-0.727B2-1.00C2
其中，Y为响应值冷冻干燥菌种存活率，A、B、C分别为脱脂乳粉、青稞多糖、谷氨酸钠质量浓度。
为了检验模型的有效性，对模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，P＝0.0034＜0.01，表明该模型很显著，回归模型系数的显著性检验结果R2＝92.55％，说明此模型与数据拟合度很高,因此该模型可用于预测响应面值不同冻干保护剂配方下植物乳杆菌的存活率。
表3植物乳杆菌冻干保护剂回归方程的方差分析
Figure BDA0003670186660000052
注：P＜0.05，差异显著，P＜0.01，差异极显著。
图1、图2、图3是由多元回归方程式所作的响应曲面三维图和等高线图。可以对任何两个因素的交互作用进行分析和评价，以确定最佳因素水平范围。
利用Design Expert软件以存活率最大值为目标优化出方案，得出唯一最优方案为：脱脂奶粉9.24％，青稞多糖5.62％，谷氨酸钠4.85％为复合保护剂使用时，能使植物乳杆菌冷冻干燥存活率达到90.49％。
综上所述，本发明的植物乳杆菌复合冻干保护剂使用方便，可应用于植物乳杆菌的冻干。
上述实施例，仅是本发明的较佳实施方式，在本发明技术原理的前提下，根据技术方案及其构思加以改进或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂组份具体如下：脱脂奶粉，青稞多糖，谷氨酸钠。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于：脱脂乳粉、青稞多糖和谷氨酸钠加超纯水水，并进行灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间20min，完成灭菌后放置到常温。
3.根据权利要求1-2所述植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于：所述脱脂奶粉含量为9.24％。
4.根据权利要求1-2所述植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于：所述青稞多糖含量为5.62％。
5.根据权利要求1-2所述植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于：所述谷氨酸钠含量为4.85％。
6.根据权利要求1所述植物乳杆菌复合冻干保护剂应用方法，其特征在于，所述方法具体如下：在植物乳杆菌发酵培养到对数生长稳定期18h，将发酵液4℃，4000rpm，10min离心得到菌泥，用0.9％无菌生理盐水洗涤两次得到菌泥；按照菌泥与复合冻干保护剂体积比1:1加入灭菌的脱脂奶粉、青稞多糖、谷氨酸钠。
7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，在-80℃冷冻冰箱中进行预冷冻处理3h-5h，然后进行真空冷冻干燥，冷阱温度-40℃左右，真空度10Pa，干燥24h后得到植物乳杆菌干粉，冻干存活率达到90.49％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115678782A (zh) * 2022-11-23 2023-02-03 广西大学 一种植物乳杆菌冻干保护剂及其制备方法和应用

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