CN115678782A - 一种植物乳杆菌冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌冻干保护剂及其制备方法和应用，包括方法如下步骤：将银耳多糖溶液与酪蛋白溶液混合，进行湿热接枝反应，即得。本发明利用银耳多糖和蛋白质发生水热反应生成具有两亲性的糖基化产物，该产物能降低益生菌菌体的损伤，显著提高了长期处于低温冷冻干燥条件下的植物乳杆菌的冻干存活率，解决了现有植物乳杆菌菌粉在冷冻干燥制备、贮藏过程中容易失活的问题，且克服了现有技术中冻干保护剂无法为植物乳杆菌恢复活力与增殖提供营养物质的难点。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制剂技术领域，具体指一种富含银耳多糖的植物乳杆菌冻干保护剂的制备。
背景技术
植物乳杆菌因其具有调节肠道菌群、缓解乳糖不耐症、增强机体免疫力、降低胆固醇等益生作用，在食品、医疗等方面的应用日益广泛，市场需求巨大。植物乳杆菌冻干粉主要通过真空冷冻干燥技术来生产，冷冻干燥过程一般会造成益生菌的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH值被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等，菌液直接冷冻干燥存活率极低。因此，在益生菌制剂的生产过程中，为了保护益生菌的活性，除了控制冻干工艺制程外，最关键的是的挑选益生菌合适的冻干保护剂提高菌体存活率，此外，菌粉的后期储藏稳定性也与冻干保护剂有着密切的关系，因此开发一种合适的植物乳杆菌冻干保护剂尤为重要。
银耳多糖(Tremella polysaccharides，TPS)是一种真菌黏性多糖，目前已有报道证实具有益生活性。因其特殊的结构，有较高良好的成膜性和阻氧性等特性。植物乳杆菌为厌氧或兼性厌氧菌，银耳多糖良好的成膜性可密切包裹菌株，其阻氧特性更有利于隔绝氧气。且由于银耳分子结构中含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，属于酸性多糖，可以与蛋白质发生复合反应，作为冷冻保护剂运用于冻干菌粉中。两种大分子物质之间通过静电作用和其他弱相互作用如疏水相互作用、范德华力、氢键作用等非共价结合。但由于银耳多糖的分子质量较大，低浓度下就表现出很高的粘度，不易与菌液混合均匀，影响其在冻干过程对菌种的保护作用。因此，对银耳多糖的结构进行适度的改性，并利用其与蛋白质的相互作用，构建一种具有促益生活性的菌种保护剂。在冷冻干燥过程中，减缓益生菌菌体内部结构破坏带来的损伤，保证菌株存活率，提高冻干菌粉应用价值。
发明内容
本发明的目的在于解决现有冷冻干燥生产植物乳杆菌菌粉在生产制备、贮藏中容易失活的问题，且克服现有技术中益生菌冻干保护剂无法为植物乳杆菌恢复活力与增殖提供营养物质的难点，本发明提供了一种植物乳杆菌冻干保护剂及其应用，所使用的保护剂含有能够促进植物乳杆菌增殖的银耳多糖，同时利用改性后的银耳多糖与酪蛋白相互作用生成的糖基化产物，有效提高植物乳杆菌冻干后的存活率。
本发明的目的是提供了一种冻干保护剂，本发明采取的技术方案为：
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：将银耳多糖溶液与酪蛋白溶液混合，进行湿热接枝反应，即得。
进一步地，所述银耳多糖溶液的制备方法为：取银耳多糖加水配置成溶液，超声处理，即得。
进一步地，所述超声功率为240～480W，超声温度为30℃，超声时间为2～10min。
进一步地，所述酪蛋白溶液的制备方法为：将酪蛋白溶解在pH7.0的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解，即可。
进一步地，所述银耳多糖溶液与所述酪蛋白溶液的质量浓度为4％，所述银耳多糖溶液与酪蛋白溶液的混合比例为3:1～7:1。
进一步地，所述湿热接枝反应的条件为：反应温度为120℃，反应pH为7.0，反应时间为10～30min。
本发明所述的植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌活化，接种和扩大培养，得植物乳杆菌培养液，所述植物乳杆菌培养液离心，得到菌泥；所述菌泥洗涤后重悬于无菌蒸馏水中得到菌悬液备用；
(2)将步骤(1)的菌悬液和本发明所述的植物乳杆菌冻干保护剂充分混合形成混合物；
(3)将步骤(2)的混合物冷冻干燥，即得所述植物乳杆菌冻干粉。
进一步地，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和权利要求1～6任一所述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2-3小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
优选地，步骤(2)的混合物中，所述菌悬液与所述植物乳杆菌冻干保护剂的质量比为1:5。
在本发明中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌Lp-115(Lactobacillus plantarumLp-115)。
本发明选用的银耳多糖采用以下方式提取：
(1)鲜银耳在95℃使用纯水(纯水和鲜银耳的重量比为8:1)煮提3.5h；
(2)煮提产物在均质压力为25Mpa均质2次，得到均质处理物；
(3)均质处理物使用纤维素酶与戊聚糖酶复合酶(纤维素酶与戊聚糖酶复合酶的质量比为1.5:1)在50℃酶解2小时，升温至95℃，保温10min，进行酶的灭活后，使用80目的筛网过滤，固液分离得到银耳多糖提取液；
(4)采用截留分子量为3600Da的透析袋对银耳多糖提取液进行透析，收集截留液，冷冻干燥，得到所述银耳多糖。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，利用银耳多糖和蛋白质发生水热反应生成具有两亲性的糖基化产物，该产物能降低益生菌菌体的损伤，显著提高了长期处于低温冷冻干燥条件下的植物乳杆菌的冻干存活率，解决了现有植物乳杆菌菌粉在冷冻干燥制备、贮藏过程中容易失活的问题，且克服现有技术中冻干保护剂无法为植物乳杆菌恢复活力与增殖提供营养物质的难点。
(2)本发明中的保护剂未添加任何化学合成物质，安全性高，制备方法操作简单，成本低，值得进一步推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
下述实施例中涉及的银耳多糖，来自于实验室提取(其中多糖含量为83.6％)；酪蛋白，购于上海士锋生物科技有限公司；植物乳杆菌Lp-115(Lactobacillus plantarumLp-115)，丹尼斯克有限公司；MRS培养基所用试剂及其它试剂皆为国产分析纯。
实施例1
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率240W，超声温度30℃，超声时间2min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照3:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为10min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
实施例2
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率240W，超声温度30℃，超声时间10min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照7:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为20min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻3小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
实施例3
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率360W，超声温度30℃，超声时间5min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照5:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为20min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2.5小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
实施例4
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率360W，超声温度30℃，超声时间10min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照7:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为30min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2.1小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
实施例5
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率480W，超声温度30℃，超声时间5min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照7:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为10min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2.6小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
实施例6
一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，对所述分散液进行超声处理，超声条件为：超声功率480W，超声温度30℃，超声时间10min，得到银耳多糖溶液备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照5:1的质量比混合，进行湿热接枝反应，反应条件为：温度120℃，pH7.0，反应时间为30min，反应完全后冷却，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
上述植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和上述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物，其中，混合物中包含如下质量百分比的成分：植物乳杆菌冻干保护剂50.0％，菌悬液10.0％，余量为无菌蒸馏水；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2.8小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
为了说明本发明植物乳杆菌冻干保护剂的应用效果，本发明设置了对比例1-3，并对实施例1-6及对比例1-3制得的植物乳杆菌冻干粉的冷冻干燥存活率进行测定，具体如下：
对比例1：
对比例1与实施例1的区别在于：步骤S3未进行湿热接枝反应，具体如下：
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照5:1的质量比混合，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
其余步骤同实施例1。
对比例2：
对比例2与实施例1的区别在于：步骤S1未对银耳多糖进行超声处理，具体如下：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，即为银耳多糖溶液，备用。
其余步骤同实施例1。
对比例3：
对比例3与实施例1的区别在于：步骤S1未对银耳多糖进行超声处理，步骤S3也未进行湿热接枝反应，具体如下：
S1.称取一定质量的银耳多糖分散于水中，在45℃恒温磁力搅拌器搅拌均匀得到质量浓度为4％的分散液，即为银耳多糖溶液，备用；
S2.将酪蛋白溶解在pH7.0、50mmol/L的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解得到质量分数为4％的酪蛋白溶液；
S3.将步骤S1的银耳多糖溶液与步骤S2的酪蛋白溶液按照5:1的质量比混合，即得所述植物乳杆菌冻干保护剂。
其余步骤同实施例1。
对上述实施例1～6和对比例1～3中制得的植物乳杆菌冻干粉的冷冻干燥存活率进行测定，测定结果见表1。菌粉冷冻干燥存活率的测试方法为：
取0.1g冻干菌粉于9.9mL无菌生理盐水中完全溶解，梯度稀释后利用平板计数法计数。
根据式(1)计算存活率。式中NA是冻干前活菌数，NB为冻干后活菌数，单位为cfu/g。
表1冻干保护剂的保护效果
从表1可以看出，对质量浓度为4％的银耳多糖进行超声处理，当超声功率为360W，超声温度为30℃，超声时间为5min时，得到的植物乳杆菌冻干粉冻干存活率最高。
此外，超声后的银耳多糖溶液与酪蛋白溶液是否进行湿热接枝反应，也与最终获得的植物乳杆菌冻干粉冻干存活率相关，由实施例1与对比例1的结果可以看出，进行湿热接枝反应后，实施例1获得的植物乳杆菌冻干粉冻干存活率高达65.62％，比未进行湿热接枝反应的对比例1高出约60％。
综上可知，本发明通过将银耳多糖改性并和酪蛋白湿热糖基化反应，可以起到协同保护作用，减小冻干过程对菌体活力和数量的损伤，使得菌体具有较高的活力和活菌数量，相比于对比例1～3获得了较好的技术效果。另外，实施例1～6中采用本发明的冻干保护剂后，菌种的活力均有显著性提升，可能是由于保护剂的添加抑制了冻干过程中冰晶的生成。从不同实施例可以看出，冻干保护剂的组分比例会对保护剂的效果产生明显影响，其中实施例3所述的冻干保护剂的保护效果最佳。但是当超声功率及时间过长，湿热反应的时间不足，保护的效率会相应降低。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将银耳多糖溶液与酪蛋白溶液混合，进行湿热接枝反应，即得。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述银耳多糖溶液的制备方法为：取银耳多糖加水配置成溶液，超声处理，即得。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述超声功率为240～480W，超声温度为30℃，超声时间为2～10min。
4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述酪蛋白溶液的制备方法为：将酪蛋白溶解在pH7.0的PBS缓冲液中，搅拌使其充分溶解，即可。
5.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述银耳多糖溶液与所述酪蛋白溶液的质量浓度为4％，所述银耳多糖溶液与酪蛋白溶液的混合比例为3:1～7:1。
6.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述湿热接枝反应的条件为：反应温度为120℃，反应pH为7.0，反应时间为10～30min。
7.权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的植物乳杆菌冻干保护剂。
8.权利要求7任一项所述的植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌活化，接种和扩大培养，得植物乳杆菌培养液，所述植物乳杆菌培养液离心，得到菌泥；所述菌泥洗涤后重悬于无菌蒸馏水中得到菌悬液备用；
(2)将步骤(1)的菌悬液和权利要求1～6任一所述的植物乳杆菌冻干保护剂充分混合形成混合物；
(3)将步骤(2)的混合物冷冻干燥，即得所述植物乳杆菌冻干粉。
9.根据权利要求8所述的植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将存放于-20℃环境下冷冻保存的植物乳杆菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；种子液放大培养，按3％的接种量接种在MRS培养基中，于37℃条件下厌氧培养至对数末期，得到植物乳杆菌培养液，在4500r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；将收集到的菌泥重悬于同体积的无菌蒸馏水中得到菌悬液备用，同时用平板计数法对该菌液计数；
(2)将步骤(1)的菌悬液和权利要求1～6任一所述的植物乳杆菌冻干保护剂在室温下充分搅拌混合30min，得到混合物；
(3)取一个无菌专用容器，加入步骤(2)的混合物50g，于-80℃预冻2-3小时，取出预冻的混合物置于温度为-50℃至-55℃、真空度为6.0-7.0Pa的环境中，冷冻干燥48h，得到植物乳杆菌冻干粉。
10.根据权利要求8所述的植物乳杆菌冻干保护剂在植物乳杆菌冻干粉制备中的应用，其特征在于：步骤(2)的混合物中，所述菌悬液与所述植物乳杆菌冻干保护剂的质量比为1:5。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160038547A1 (en) * | 2014-10-21 | 2016-02-11 | Beijing Kehuitongzhihui Technology., Ltd. | Lactobacillus plantarum capsule for poultry and use thereof |
| CN105420111A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-03-23 | 陕西科技大学 | 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法 |
| CN106047709A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-10-26 | 江南大学 | 一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
| CN109953339A (zh) * | 2017-12-22 | 2019-07-02 | 北京神飞航天应用技术研究院 | 一种适合航天员的益生菌营养制剂 |
| CN115029247A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-09-09 | 西南大学 | 一种植物乳杆菌复合冻干保护剂 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160038547A1 (en) * | 2014-10-21 | 2016-02-11 | Beijing Kehuitongzhihui Technology., Ltd. | Lactobacillus plantarum capsule for poultry and use thereof |
| CN105420111A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-03-23 | 陕西科技大学 | 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法 |
| CN106047709A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-10-26 | 江南大学 | 一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
| CN109953339A (zh) * | 2017-12-22 | 2019-07-02 | 北京神飞航天应用技术研究院 | 一种适合航天员的益生菌营养制剂 |
| CN115029247A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-09-09 | 西南大学 | 一种植物乳杆菌复合冻干保护剂 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 何晓叶等: "美拉德反应制备蛋白质-多糖共价复合物的研究进展", 食品工业科技, vol. 37, no. 6, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 2 - 3 * |
| 李兵兵等: "银耳多糖对冻干植物乳杆菌细胞膜及糖代谢酶的保护作用", 现代食品科技, vol. 37, no. 11, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 86 - 88 * |
| 王鲁慧;肖军霞;徐同成;王鹏;黄国清;: "湿热条件下大豆分离蛋白与葡萄糖、麦芽糖的美拉德反应", 食品科学, no. 16, 13 October 2017 (2017-10-13), pages 26 - 33 * |
| 郑守晶;王玉贝;郑明锋;: "银耳多糖对植物乳杆菌增殖作用的研究", 福建轻纺, no. 04, 16 April 2020 (2020-04-16), pages 34 - 40 * |
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