CN114601174B - 一种乳酸菌溶胞物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种乳酸菌溶胞物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乳酸菌溶胞物，其特征在于，按重量份折干计，含有蛋白类物质和肽聚糖，其中，所述蛋白类物质为40‑70份，所述肽聚糖含量为30‑60份，其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的50‑90wt％。本发明所述的乳酸菌溶胞物，多肽的含量高，多肽的分子量高，肽聚糖含量高。抗氧化能力高，抑制酪氨酸酶活性高，提高免疫力的能力高。高多肽含量高肽聚糖含量对于自由基清除，酪氨酸酶抑制率，以及提高NK细胞活性提高免疫力方面较单纯的菌体有显著的提高。

Description

一种乳酸菌溶胞物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种乳酸菌溶胞物及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌是可利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的无芽孢，革兰氏阳性细菌。在工业上应用比较多的主要有乳球菌属，乳杆菌属，链球菌属，肠球菌属，酒球菌属，小球菌属，明串珠菌属等。乳酸菌类细胞壁占细胞干重的10-25％，主要化学成分是肽聚糖，含量占细胞壁物质的40-60％，肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通过β-1,4苷键连接而成的多糖骨架，以及短肽聚合而成的多层网状结构的大分子化合物。另外还含有占细胞壁干重50％的磷酸壁和占细胞壁干重2％的脂类以及还有少量的10％的蛋白质。
目前乳酸菌在健康方面的研究主要调节宿主胃肠道菌落比例，改善胃肠道功能，并能增强宿主免疫力。肽聚糖在益生菌与宿主联系中起重要作用，并对宿主免疫反应具有一定的调节作用和抗炎作用。肽聚糖可被宿主天然免疫系统中存在的相关模式识别受体识别，通过诱导非特异性免疫因子或特异性免疫因子的释放或表达来刺激机体免疫系统发挥功能。乳酸菌胞内液中丰富的蛋白质，可水解成小分子的多肽和氨基酸，肽的分子量一般在180-5000Da之间。其中分子量在180-1000Da之间的肽称为小肽或寡肽或低聚肽，也称为小分子活性多肽。多肽具有免疫调节，抗菌，抗肿瘤及提高机体免疫力生理活性作用。肽类能够被肠道完整吸收，不仅仅是以二肽，三肽吸收，而且也可以更大的多肽而吸收。
乳酸菌除了发挥活菌调节肠道的作用，其溶胞物同样具有各种调节功能。可用于各类食品和保健食品中，能起到改善食品风味，发挥免疫调节，帮助运动后恢复等功能。在护肤方面可以抗氧化，促进受损细胞恢复等功能。乳酸菌溶胞物通过内服外用可以发挥其更广阔的应用空间。
发明内容
现有技术中乳酸菌溶胞物的技术应用面较窄，由于市场热度问题，市场乳酸菌都以活性菌作为主要开发方向，对菌体的利用较少。类似产品限制于动物饲料，培养基或护肤产品中，并没有涉及作为一种内服外用的针对人类健康的产品。对乳酸菌溶胞物中多肽的分子量多少及其分布没有研究以及其制备工艺的研究欠缺。
本发明解决的技术问题是：
现有技术中的乳酸菌溶胞物蛋白含量低，多肽含量低，肽聚糖含量低。抗氧化能力低，抑制酪氨酸酶的活性低，提高免疫力的能力低。
具体而言，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种乳酸菌溶胞物，其特征在于，按重量份折干计，含有蛋白类物质和肽聚糖，其中，所述蛋白类物质为40-70份，所述肽聚糖含量为30-60份，其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的50-90wt％。
优选的，其中，按重量份折干计算，含有蛋白类物质为45-65份，其中优选蛋白质含量55份，肽聚糖35-55份，优选肽聚糖含量40份；其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的80wt％。
优选的，其中，所述自由基清除率相比等量乳酸菌菌体提高100-200％，优选的，酪氨酸酶抑制率提升80％-200％，更优选的，小鼠NK细胞活性提高40-100％。
本发明还提供了所述的乳酸菌溶胞物的制备方法，其中，包括如下步骤：
步骤1：乳酸菌原料经过扩大培养得到乳酸菌发酵液；
步骤2：步骤1得到的乳酸菌发酵液经过离心洗涤处理；
步骤3：步骤2经过离心洗涤处理后的乳酸菌发酵液进行破壁处理得到乳酸菌破壁液；
步骤4：步骤3得到的乳酸菌破壁液进行酶解后处理，即得到乳酸菌溶胞物。
优选的，其中，所述步骤1中的乳酸菌原料包括乳杆菌和/或双歧杆菌，优选双岐杆菌。
优选的，其中，所述乳杆菌包括戊糖乳杆菌，干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌中的一种或两种以上；优选的，所述双歧杆菌包括长双歧杆菌和/或短双歧杆菌，更优选的，所述双歧杆菌为短双岐杆菌。
优选的，其中，所述步骤1中将挑取乳酸菌原料于MRS液体培养基中进行培养。
优选的，其中，所述步骤1中的培养温度为32-40℃，优选为35℃。
优选的，其中，所述步骤1中的培养为厌氧或兼性厌氧培养，优选的，当OD值为15-30时结束，得到所述乳酸菌发酵液。
优选的，其中，所述步骤2中离心处理的转速为5000-10000r/min，优选为10000r/min。
优选的，其中，所述步骤2中还包括离心处理后的洗涤步骤，其中，所述洗涤步骤为生理盐水进行溶解菌体，所述菌体与生理盐水的质量体积比为10-50wt/mL％；和/或所述洗涤温度为0-25℃，优选为10℃；和/或所述洗涤次数为1-5次，优选为3次。
优选的，其中，所述步骤3中破壁处理中的步骤2得到的乳酸菌菌体与水的质量体积比为1:100-1:5，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min，优选的，破壁处理中，乳杆菌和双歧杆菌的质量比为1:20-20:1，优选为1:2。
优选的，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上，优选为超声破碎。
优选的，其中，所述超声破碎的功率为60-200W，时间为15-60min，优选破壁功率150w，时间45min。
优选的，其中，所述高压均质的压力为20-100MPa，流速为0.1-100m3/h，均质次数为1-5次；优选压力80MPa，流速10m3/h，均质3次。
优选的，其中，所述酶解破壁的酶解温度为20-70℃，优选为30-60℃，更优选35℃；和/或pH为5-10，优选为4-9，更优选pH为6.5；和/或酶解时间为0.5-16h，优选为4-12h,更优选8h。
优选的，其中，所述酶解使用的酶为纤维素酶，优选的，所述纤维素酶包括β-葡聚糖酶，溶菌酶，α-葡聚糖酶，α-甘露聚糖酶，纤维素酶和木质素酶中的一种或两种以上，更优选为溶菌酶：纤维素酶＝1:1；
进一步优选的，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶添加量为0.05-5wt％，优选为1.0wt％。
优选的，其中，所述后处理为对乳酸菌破壁液进行酶解处理，酶解pH为3-9，优选为4-6；和/或酶解温度为20-70℃，优选为30-60℃，和/或酶解时间为1-24h，优选为6h。
优选的，其中，所述酶解使用的酶为蛋白酶，优选的，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，肽酶，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或两种以上；更优选为肽酶；进一步优选的，按乳酸菌破壁液的质量计，所述酶添加量为0.05-3wt％，优选为0.5-2wt％。
优选的，其中，步骤4后还包括酶灭活的过程，优选的，灭活温度为80-130℃，更优选的，灭活时间为3s-120min。
优选的，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
本发明还提供了所述的乳酸菌溶胞物在食品，饲料和/或保健品中的应用，优选在食品和/或保健食品中的应用。
优选的，其中，所述应用为乳酸菌溶胞物在抗氧化，抑制酪氨酸酶活性和/或提高免疫力中的作用。
本发明所取得的有益效果是：
本发明所述的乳酸菌溶胞物，多肽的含量高，多肽的分子量高，多肽分子量在180-1000D之间最佳比例为80％，肽聚糖含量高。抗氧化能力高，抑制酪氨酸酶活性高，提高免疫力的能力高。高多肽含量高肽聚糖含量对于自由基清除，酪氨酸酶抑制率，以及提高NK细胞活性提高免疫力方面较单纯的菌体有显著的提高。
菌种保藏信息
1.本发明所用的菌种植物乳杆菌RPC5(Lactobacillus plantarum RPC5)于2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2019566，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
2.本发明所用的菌种戊糖乳杆菌RPC2B(Lactobacillus pentosus RPC2B)于2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2019568，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
3.本发明所用的菌种嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017628，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052，已经在公开号为CN111920040A的专利申请中公开。
4.本发明所用的菌种短双歧杆菌001(Bifidobacterium breve001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017626，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
5.本发明所用的菌种鼠李糖乳杆菌001(Lactobacillus rhamnosus001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017630，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052，已经在公开号为CN111920040A的专利申请中公开。
6.本发明所用的菌种干酪乳杆菌001(Lactobacillus casei 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017631，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052，已经在公开号为CN111920040A的专利申请中公开。
7.本发明所用的菌种长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017627，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
8.本发明所用的菌种短乳杆菌(Lactobacillus brevis RPC2A)于2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2019567，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
具体实施方式
本发明的选取的原料主要为乳酸菌包括乳杆菌类(包括但不限于戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌)和双歧杆菌(包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双岐杆菌、青春双岐杆菌、婴儿双岐杆菌)，优选双岐杆菌，双歧杆菌中优选短双岐杆菌，长双歧杆菌和乳双歧杆菌。
本领域技术人员依据本发明记载，可利用现有技术中任一种或两种以上戊糖乳杆菌，任一种或两种以上干酪乳杆菌、任一种或两种以上嗜酸乳杆菌、任一种或两种以上植物乳杆菌、任一种或两种以上鼠李糖乳杆菌、任一种或两种以上短乳杆菌、任一种或两种以上长双歧杆菌、任一种或两种以上两歧双岐杆菌、任一种或两种以上青春双岐杆菌、任一种或两种以上婴儿双岐杆菌来实现本发明。
在本发明实施例中所使用的菌种植物乳杆菌为植物乳杆菌RPC5(Lactobacillusplantarum RPC5)，保藏编号为CCTCC NO:M2019566。本发明所用的菌种戊糖乳杆菌为戊糖乳杆菌RPC2B(Lactobacillus pentosus RPC2B)，保藏编号为CCTCC NO:M2019568。本发明所用的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)，保藏编号为CCTCC NO:M2017628。本发明所用的短双歧杆菌为短双歧杆菌001(Bifidobacterium breve001)，保藏编号为CCTCC NO:M2017626。本发明所用的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌001(Lactobacillus rhamnosus 001)，保藏编号为CCTCC NO:M2017630。本发明所用的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌001(Lactobacillus casei 001)，保藏编号为CCTCC NO:M2017631。本发明所用的长双歧杆菌为长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum 001)，保藏编号为CCTCCNO:M2017627。本发明所用的短乳杆菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis RPC2A)，保藏编号为CCTCC NO:M2019567。
1)乳酸菌菌种扩大培养：挑取乳酸杆菌、单个菌落一环放入MRS液体培养基中，逐级扩大培养，32-40℃厌氧或兼性厌氧培养，当OD值＝15-30时结束发酵，得到乳酸菌发酵液。
2)乳酸菌发酵液经过离心处理，转述5000-10000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照10-50％的质量体积比再次使用生理盐水进行溶解，低温0-25℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤次数1-5次，优选5次。
3)破壁处理，乳杆菌：双歧杆菌按照质量比1:20-20:1的比例混合或乳杆菌与双歧杆菌单独使用，优选双歧杆菌：乳杆菌按照2:1的质量比例进行混合使用。乳酸菌菌体量与水的质量体积比按照1:100-1:5的浓度进行调配，调配后加热灭活温度80-130℃，时间3s-120min。分别使用超声破碎，高压均质机均质，溶菌酶酶解破壁三种方法，优选超声波破碎法。
a)超声法：超声波破碎仪功率设置60-200W，工作5s停5s，共15-60min，得到乳酸菌破壁液。
b)高压均质法：灭活后溶液，高压均质机处理，均质压力20-100MPa，均质1-5遍，流速500-1000m3/h，均质后获得乳酸菌破壁液。
c)酶解法：灭活后溶液，温度20-70℃(优选30-60℃)，pH5-10(优选6-9)，按照质量体积比0.05％-5％的纤维素酶(包括但不限于β-葡聚糖酶、溶菌酶、α-葡聚糖酶、α-甘露聚糖酶、纤维素酶、木质素酶或这些酶的组合)，酶解0.5-16h(优选4-12h)，酶解结束后即可得到乳酸菌破壁液。
4)后处理：选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液，调节pH3-9(优选4-6)，温度20-70℃(优选30-60℃)，加入0.05％-3％(优选0.5％-2％，这里指的酶量占乳酸菌破壁液干重的百分比，下同)的蛋白酶(包括但不限于碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的一种或多种)，酶解1-24h。酶解结束后80-130℃，时间3s-120min，使酶灭活。得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液。
5)乳酸菌破壁液可以直接作为一种产品形式或继续蛋白酶酶解获得富含多肽的的产品形式。产品最终状态包括但不限于液体、冻干粉、喷粉产品。
6)评价：测试时干粉的添加量与液体产品的固形物含量保持一致，测试DPPH自由基清除率，酪氨酸酶抑制率，小鼠抗疲劳程度考察。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。
其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表所示。
表1本发明所用到的原料和仪器的信息
实施例乳酸菌溶胞物的制备
实施例1
乳酸菌菌种扩大培养：挑取嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)菌落一环放入5L MRS液体培养基中，其中各成分比例为(牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。灭菌前pH为6.4。进行扩大培养，37℃兼性厌氧发酵，当OD值＝15时，得到发酵菌液，离心收集菌体。长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum 001)同时接入5L MRS液体培养基中扩大培养，其中各成分比例为(牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。35℃厌氧发酵，当OD值＝20时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转述10000r/min；嗜酸乳杆菌001和长双歧杆菌001分别离心，分别洗涤；离心处理得到乳酸菌菌体。按照15g菌体加入100ml生理盐水的比例进行溶解，低温4℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤1次。
破壁处理，嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)：长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum 001)按照质量比1:1的比例混合，乳酸菌菌体量与水的质量体积比按照1:10的浓度进行调配，调配后加热灭活温度85℃，时间60min。灭菌后液体体积为2L，温度45℃，pH＝6，按照质量体积比添加0.05％的β-葡聚糖酶和0.05％的α-甘露聚糖酶组合，酶解4h，酶解结束后即可得到乳酸菌破壁液。
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液2L，调节pH＝5.5，温度50℃，加入1wt％的胃蛋白酶，酶解5h，酶解结束后,100℃，30min使酶灭活。得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液。
浓缩干燥：上述乳酸菌溶胞液采用喷雾干燥得到淡黄色粉状产品50g，肽聚糖含量为20g，蛋白类含量为22.5g，其中多肽占14.6g，其中多肽占蛋白类物质的64.9wt％。
实施例2
乳酸菌菌种扩大培养：挑取短乳杆菌菌落一环放入200LMRS液体培养基中扩大培养，其中各成分比例为(牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO42.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。灭菌前pH为6.4，37℃兼性厌氧发酵，当OD值＝18时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转述5000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照5g菌体加入100ml生理盐水中，低温10℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤5次。
短乳杆菌菌体量与水的质量体积比按照1:50的浓度进行调配调配体积100L，调配后加热灭活温度130℃，时间3smin。超声波破碎仪功率设置200W，工作5s停5s，共60min，得到乳酸菌破壁液。
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液100L，调节pH＝5.5，温度50℃，加入1％的木瓜蛋白酶：胰蛋白酶＝1：1，酶解4h，酶解结束后,100℃，30min使酶灭活。得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液。
浓缩干燥：上述乳酸菌溶胞液采用冷冻干燥得到浅黄色粉状产品2200g。肽聚糖含量为810g，蛋白类含量为1280g，其中多肽占1000g其中多肽占蛋白类物质的78.1wt％。
实施例3
乳酸菌菌种扩大培养：挑取戊糖乳杆菌RPC213(Pediococcus pentosaceusRPC213)菌落一环放入10LMRS液体培养基中扩大培养，其中各成分比例为(牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml。灭菌前pH为6.4，37℃兼性厌氧发酵，当OD值＝25时，得到发酵菌液，离心收集菌体。鼠李糖乳杆菌001(Bifidobacterium breve 001)同时接入上述相同MRS液体培养基中扩大培养，37℃厌氧发酵，当OD值＝30时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转速8000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照20g菌体加入到100ml生理盐水中，低温15℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤4次。
破壁处理，戊糖乳杆菌：鼠李糖乳杆菌按照质量比1:10的比例混合，乳酸菌菌体量与水的质量体积比按照1:20的浓度进行调配，配置50L溶液，调配后加热灭活温度80℃，时间120min。灭活后溶液，高压均质机处理，均质压力100MPa，均质3遍，流速500L/h,均质后获得乳酸菌破壁液。
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液50L，调节pH＝6.0，温度40℃，加入0.5％的肽酶，酶解3h，酶解结束后,121℃，5s使酶灭活,得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液,该产品以液体形式作为最终产品100g。其中肽聚糖含量为45.7g，蛋白类含量为47.6g，其中多肽占总蛋白34.3g，其中多肽占蛋白类物质的72.1wt％。
实施例4
乳酸菌菌种扩大培养：挑取短双岐杆菌001(Bifidobacterium breve001)菌落一环放入100LMRS液体培养基中进行扩大培养,其中各成分比例为(牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000ml，灭菌前pH为6.4，37℃厌氧发酵，当OD值＝25时，得到乳酸菌发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转速3000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照40g菌体加入到100ml生理盐水中，低温4℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤5次。
短双歧杆菌菌体量与水的质量体积比按照1:10的浓度进行调配，溶液总量50L，调配后加热灭活温度100℃，时间25min。破壁处理，灭活后溶液，温度55℃，pH＝5.0，按照质量体积比添加0.05％的β-葡聚糖酶和0.05％的溶菌酶组合，酶解2h，酶解结束后即可得到乳酸菌破壁液。
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液，调节pH＝6.0，温度45℃，加入0.5％的肽酶和0.5％菠萝蛋白酶，酶解3h，酶解结束后，100℃，30min使酶灭活,得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液。
浓缩干燥：上述乳酸菌溶胞液采用喷雾干燥的方法制备成淡黄色粉末1300g。其中肽聚糖含量为598g，蛋白类含量为650g，其中多肽占总蛋白537g，其中多肽占蛋白类物质的82.6wt％。
对比例
对比例1
乳酸菌菌种扩大培养：挑取嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)菌落一环放入10L的MRS液体培养基中，进行扩大培养，37℃兼性厌氧发酵，当OD值＝15时，得到发酵菌液，离心收集菌体。长双歧杆菌001(Bifidobacterium longum 001)同时接入10L的MRS液体培养基中扩大培养，35℃厌氧发酵，当OD值＝20时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转述10000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照15％的质量体积比再次使用生理盐水进行溶解，低温4℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤1次。
破壁处理，嗜酸乳杆菌：长双歧杆菌按照质量比1:1的比例混合，乳酸菌菌体量与水的质量体积比按照1:10的浓度进行调配，调配后加热灭活温度85℃，时间60min。(与实施例1相比，区别在于破壁处理的过程中没有加入葡聚糖酶和α-甘露聚糖酶)
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液，调节pH＝5.5，温度50℃，加入1％的胃蛋白酶，酶解5h，酶解结束后,100℃，30min使酶灭活。得到富含多肽成分的乳酸菌胞内液。
浓缩干燥：上述乳酸菌溶胞液采用喷雾干燥得到淡黄色粉状产品240g，肽聚糖含量为60.5g，蛋白类含量为107g，其中多肽占42.8g，其中多肽占蛋白类物质的40wt％。
对比例2
乳酸菌菌种扩大培养：挑取短乳杆菌菌落一环放入5L的MRS液体培养基中，进行扩大培养，37℃厌氧发酵，当OD值＝18时，得到发酵菌液，离心收集菌体。乳酸菌发酵液经过离心处理，转述5000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体。菌体按照5％的质量体积比再次使用生理盐水进行溶解，低温10℃搅拌均匀，再次离心洗涤，洗涤5次。
短乳杆菌菌体量与水的质量体积比按照1:50的浓度进行调配，调配后加热灭活温度130℃，时间3smin。超声波破碎仪功率设置200W，工作5s停5s，共60min，得到乳酸菌破壁液。
与实施例2相比，对比例2的区别在于没有进行后处理酶解过程。
浓缩干燥：上述乳酸菌溶胞液采用冷冻干燥得到浅黄色粉状产品55g。肽聚糖含量为20.1g，蛋白类含量为30.2g，其中多肽占总蛋白4.6g，其中多肽占蛋白类物质的15.2wt％。
对比例3
乳酸菌菌种扩大培养：挑取戊糖乳杆菌菌落一环放入5L的MRS液体培养基中，进行扩大培养，37℃兼性厌氧发酵，当OD值＝25时，得到发酵菌液，离心收集菌体。短双歧杆菌同时接入50LMRS液体培养基中扩大培养，37℃厌氧发酵，当OD值＝30时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌发酵液经过离心处理，转速8000r/min,离心处理得到乳酸菌菌体，不进行水洗处理。(与实施例3相比，对比例3的区别在于离心时不进行水洗处理)。
破壁处理，戊糖乳杆菌：短双歧杆菌按照质量比1:10的比例混合，乳酸菌菌体量与水的质量体积比按照1:20的浓度进行调配，调配后加热灭活温度80℃，时间120min。灭活后溶液，高压均质机处理，均质压力100MPa，均质3遍，流速500m3/h，均质后获得乳酸菌破壁液。
后处理，选择酶解工艺，原乳酸菌破壁液，调节pH＝6.0，温度40℃，加入0.01％的肽酶，酶解1h，酶解结束后，121℃，5s使酶灭活，得到冻干粉660g。其中肽聚糖含量为178g，蛋白类含量为309g，其中多肽占总蛋白232g，其中多肽占蛋白类物质的75.1wt％。
应用例1：测试DPPH自由基清除率
(1)基于DPPH自由基清除能力抗氧化活性评价
DPPH标准液的配制：烧杯称取0.003gDPPH，适量无水乙醇溶解，超声5min，转移至容量瓶定容至50mL，充分混匀。避光保存。
(3.5h内使用完)
样品溶液浓度的确定：
步骤一：DPPH 3.0mL，滴加样品液，溶液颜色基本褪去时记录加样量。步骤二：以步骤一中的加样量为最大加样量，往前设置5-6个浓度梯度；用蒸馏水补至3mL；加入3.0mLDPPH溶液；混匀；黑暗中静置30min。取出测定A值。关于对照的设置见表2：
表2测试DPPH自由基清除率的对照设置
样品 数值
3.0mL蒸馏水+3.0mL无水乙醇 Ai和A0的校零
3.0mL蒸馏水+3.0mLDPPH溶液 A0
3.0mL样品液+3.0mLDPPH溶液 Ai
3.0mL样品液+3.0mL蒸馏水 Aj
6.0mL蒸馏水 Aj校零
关于清除率的计算：
清除率S(％)＝[(A0-(Ai-Aj))/A0]*100％
作图，计算IC50值。注意标准曲线的R2值需要在0.99以上。
实施例和对比例中的DPPH自由基清除率提高情况如表3。
表3实施例和对比例中DPPH自由基清除率表
应用例2：酪氨酸酶抑制率
酪氨酸酶抑制活性试验方法
材料：酪氨酸酶(试剂：25ku、-20℃保存)、L-酪氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、恒温仪、紫外分光光度计、离心机。
试剂配制：
磷酸钠缓冲液(1/15mol/L，pH＝6.8)：
精确称取1.000g磷酸二氢钠，1.186g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500mL，4℃冰箱保存备用。
L-酪氨酸溶液(7.5mmol/L)：
精确称取L-酪氨酸0.136g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50mL，90℃加热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7左右，加去离子水定容至100mL棕色容量瓶中，避光保存。
酪氨酸酶液的制备：
试剂配置：将小包装瓶中的固体粉末酶试剂用蒸馏水溶解，然后用胶头吸管吸出，转移至250ml容量瓶中，不断重复溶解、转移过程，直到吸出的酶液从黄棕色变为澄清透明为止，最后于容量瓶中定容250ml，获得100u/ml的酶液。将250ml酶液用小离心管分装，-20℃保存。实验过程中按需取出解冻后再使用。
检测方法：
总反应体系为5mL。具体设计见表4。
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液、酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应40min时475nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液对酪氨酸酶的抑制率。
抑制率＝[(A-B)/A]×l00％
其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
表4酪氨酸酶抑制率中5mL试验体系设计
注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”调零。
表5实施例和对比例中酪氨酸酶抑制率表
应用例3：小鼠NK细胞活性
小鼠处理：小鼠18只只随机分为3组，每组6只，分别以实施例和对比例中使用的菌体样及相应的乳酸菌溶胞物按照10g/kg体重进行灌胃处理，空白对照组按照同剂量每日灌胃无菌水。连续灌胃给药20d后给药1h，取脾制备脾细胞悬液(效应细胞)，并细胞浓度为2.0*106个/ml。
每孔设三个平行样
表6应用例三中三个平行样设置表
96U孔U型板,混勾，37℃，CO2培养箱，4h。离心,1500r/min，离心5min
上清液(μL) 100 100 100
LDH基质液(μL) 100 100 100
96U孔U型板，反应5min。
1mol/L HCL(μL) 30 30 30
490nm处测定吸光度。
计算公式：
对NK细胞活力及HC50的影响(n＝6)
表7实施例和对比例中NK细胞活性表
空白培养基组NK细胞活性18.9±7.18％
实施例组细胞活性明显高于其对应菌体组且高对比例组。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (106)

1.一种乳酸菌溶胞物，其特征在于，按重量份折干计，含有蛋白类物质和肽聚糖，其中，所述蛋白类物质为40-70份，所述肽聚糖含量为30-60份，其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的50-90wt％；
该乳酸菌溶胞物的自由基清除率相比等量乳酸菌菌体提高100-200％，酪氨酸酶抑制率提升80％-200％，小鼠NK细胞活性提高40-100％；
所述的乳酸菌溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：乳酸菌原料经过扩大培养得到乳酸菌发酵液；
所述步骤1中的培养温度为32-40℃；所述步骤1中的培养为厌氧或兼性厌氧培养；其中，当OD值为15-30时结束，得到所述乳酸菌发酵液；
其中，所述步骤1中的乳酸菌原料为戊糖乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述戊糖乳杆菌为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RPC2B菌株，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)001菌株；
步骤2：步骤1得到的乳酸菌发酵液经过离心洗涤处理；
其中，所述洗涤步骤为生理盐水进行溶解菌体，所述菌体与生理盐水的质量体积比为10-50wt/mL％；
步骤3：步骤2经过离心洗涤处理后的乳酸菌发酵液进行破壁处理得到乳酸菌破壁液；
其中，所述步骤3中破壁处理中的步骤2得到的乳酸菌菌体与水的质量体积比为1:100-1:5；
步骤4：步骤3得到的乳酸菌破壁液进行酶解后处理，即得到乳酸菌溶胞物；
所述后处理为对乳酸菌破壁液进行酶解处理，酶解pH为3-9，酶解温度为20-70℃；
所述酶解使用的酶为蛋白酶，所述蛋白酶为肽酶；按乳酸菌破壁液的质量计，所述酶添加量为0.5-2wt％。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌溶胞物，其中，按重量份折干计算，含有蛋白类物质为45-65份，肽聚糖35-55份，其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的80wt％。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌溶胞物，其中，按重量份折干计算，含有蛋白质含量55份，肽聚糖含量40份；其中，蛋白类物质中含有多肽，所述多肽占蛋白类物质的80wt％。
4.权利要求1-3任一项所述的乳酸菌溶胞物的制备方法，其中，包括如下步骤：
步骤1：乳酸菌原料经过扩大培养得到乳酸菌发酵液；
所述步骤1中的培养温度为32-40℃；所述步骤1中的培养为厌氧或兼性厌氧培养；其中，当OD值为15-30时结束，得到所述乳酸菌发酵液；
其中，所述步骤1中的乳酸菌原料为戊糖乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述戊糖乳杆菌为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RPC2B菌株，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)001菌株；
步骤2：步骤1得到的乳酸菌发酵液经过离心洗涤处理；
其中，所述洗涤步骤为生理盐水进行溶解菌体，所述菌体与生理盐水的质量体积比为10-50wt/mL％；
步骤3：步骤2经过离心洗涤处理后的乳酸菌发酵液进行破壁处理得到乳酸菌破壁液；
其中，所述步骤3中破壁处理中的步骤2得到的乳酸菌菌体与水的质量体积比为1:100-1:5；
步骤4：步骤3得到的乳酸菌破壁液进行酶解后处理，即得到乳酸菌溶胞物；
所述后处理为对乳酸菌破壁液进行酶解处理，酶解pH为3-9，酶解温度为20-70℃；
所述酶解使用的酶为蛋白酶，所述蛋白酶为肽酶；按乳酸菌破壁液的质量计，所述酶添加量为0.5-2wt％。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤1中将挑取乳酸菌原料于MRS液体培养基中进行培养。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤1中的培养温度为35℃。
7.据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤1中的培养温度为35℃。
8.根据权利要求4中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为5000-10000r/min。
9.据权利要求5中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为5000-10000r/min。
10.据权利要求6中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为5000-10000r/min。
11.根据权利要求4中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为10000r/min。
12.权利要求5中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为10000r/min。
13.权利要求6中所述的方法，其中，所述步骤2中离心处理的转速为10000r/min。
14.根据权利要求4所述的方法,其中，所述步骤2中洗涤温度为0-25℃。
15.根据权利要求5所述的方法,其中，所述步骤2中洗涤温度为0-25℃。
16.根据权利要求6所述的方法,其中，所述步骤2中洗涤温度为0-25℃。
17.根据权利要求8所述的方法,其中，所述步骤2中洗涤温度为0-25℃。
18.根据权利要求11所述的方法,其中，所述步骤2中洗涤温度为0-25℃。
19.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤温度为10℃。
20.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤温度为10℃。
21.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤温度为10℃。
22.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤温度为10℃。
23.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤温度为10℃。
24.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
25.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
26.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
27.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
28.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
29.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
30.根据权利要求19所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为1-5次。
31.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
32.权利要求5所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
33.权利要求6所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
34.权利要求8所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
35.权利要求11所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
36.权利要求14所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
37.权利要求19所述的方法，其中，所述步骤2中洗涤次数为3次。
38.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
39.据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
40.据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
41.据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
42.据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
43.据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
44.据权利要求19所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
45.据权利要求24所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
46.据权利要求31所述的方法，其中，所述步骤3中，乳酸菌和水调配后进行加热灭活，加热灭活的温度为70-130℃，时间为3s-120min。
47.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
48.据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
49.据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
50.据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
51.据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
52.据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
53.据权利要求19所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
54.据权利要求24所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
55.据权利要求31所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
56.据权利要求38所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括超声破碎，高压均质和酶解破壁中的一种或两种以上。
57.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
58.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
59.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
60.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
61.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
62.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
63.根据权利要求19所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
64.根据权利要求24所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
65.根据权利要求31所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
66.根据权利要求38所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法为超声破碎。
67.根据权利要求47所述的方法，其中，所述超声破碎的功率为60-200W，时间为15-60min。
68.根据权利要求47所述的方法，其中，所述超声破碎的功率为150w，时间45min。
69.根据权利要求47所述的方法，其中，所述高压均质的压力为20-100MPa，流速为0.1-100m3/h，均质次数为1-5次。
70.根据权利要求47所述的方法，其中，所述高压均质的压力为80MPa，流速10m3/h，均质3次。
71.根据权利要求47所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括酶解破壁，所述酶解破壁的酶解温度为20-70℃，和/或pH为5-10和/或酶解时间为0.5-16h。
72.根据权利要求47所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括酶解破壁，所述酶解破壁的酶解温度为30-60℃，和/或pH为4-9，和/或酶解时间为4-12h。
73.根据权利要求47所述的方法，其中，所述步骤3中破壁处理的方法包括酶解破壁，所述酶解破壁的酶解温度为35℃，和/或pH为6.5，和/或酶解时间为8h。
74.根据权利要求71所述的方法，其中，酶解破壁所使用的酶包括β-葡聚糖酶，溶菌酶，α-葡聚糖酶，α-甘露聚糖酶，纤维素酶和木质素酶中的一种或两种以上。
75.根据权利要求72所述的方法，其中，酶解破壁所使用的酶包括β-葡聚糖酶，溶菌酶，α-葡聚糖酶，α-甘露聚糖酶，纤维素酶和木质素酶中的一种或两种以上。
76.根据权利要求74所述的方法，其中，酶解破壁所使用的酶为溶菌酶：β-葡聚糖酶＝1:1。
77.根据权利要求75所述的方法，其中，酶解破壁所使用的酶为溶菌酶：β-葡聚糖酶＝1:1。
78.根据权利要求47所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
79.根据权利要求71所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
80.根据权利要求74所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
81.根据权利要求75所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
82.根据权利要求76所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
83.根据权利要求77所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为0.05-5wt％。
84.根据权利要求47所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为1.0wt％。
85.根据权利要求71所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶酶添加量为1.0wt％。
86.根据权利要求74所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为1.0wt％。
87.根据权利要求75所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为1.0wt％。
88.根据权利要求76所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为1.0wt％。
89.根据权利要求77所述的方法，其中步骤3中，按步骤2得到的产物的质量计，所述酶解破壁所使用的酶添加量为1.0wt％。
90.根据权利要求4-89任一项所述的方法，其中，步骤4中，所述后处理为对乳酸菌破壁液进行酶解处理，在所述PH和酶解温度下，酶解时间为1-24h。
91.根据权利要求4-89任一项所述的方法，其中，步骤4中，所述后处理为对乳酸菌破壁液进行酶解处理，酶解pH为4-6，和/或酶解温度为30-60℃，和/或酶解时间为6h。
92.根据权利要求4-89任一项所述的方法，其中，步骤4后还包括酶灭活的过程。
93.根据权利要求90所述的方法，其中，步骤4后还包括酶灭活的过程。
94.根据权利要求91所述的方法，其中，步骤4后还包括酶灭活的过程。
95.根据权利要求92所述的方法，其中，灭活温度为80-130℃，灭活时间为3s-120min。
96.根据权利要求93所述的方法，其中，灭活温度为80-130℃，灭活时间为3s-120min。
97.根据权利要求94所述的方法，其中，灭活温度为80-130℃，灭活时间为3s-120min。
98.根据权利要求4-89任一项所述的方法，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
99.根据权利要求90所述的方法，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
100.根据权利要求91所述的方法，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
101.根据权利要求92所述的方法，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
102.根据权利要求95中所述的方法，其中，所述的乳酸菌溶胞物还可以进一步处理得到冻干粉和/或喷粉产品。
103.权利要求1-3中任一项所述的乳酸菌溶胞物或权利要求4-102任一项所述的方法制得的乳酸菌溶胞物在食品，饲料和/或保健品中的应用。
104.权利要求1-3中任一项所述的乳酸菌溶胞物或权利要求4-102任一项所述的方法制得的乳酸菌溶胞物在食品和/或保健食品中的应用。
105.根据权利要求103所述的应用，其中，所述应用为乳酸菌溶胞物在抗氧化，抑制酪氨酸酶活性和/或提高免疫力中的作用。
106.根据权利要求104所述的应用，其中，所述应用为乳酸菌溶胞物在抗氧化，抑制酪氨酸酶活性和/或提高免疫力中的作用。
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