CN114107089B - 一株植物乳杆菌及其发酵提取β-葡聚糖的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株植物乳杆菌及其发酵提取β‑葡聚糖的方法及应用，涉及生物技术领域。所述植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22505，保藏日期为2021年5月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述的方法为将植物乳杆菌CGMCC No.22505接种于食用蘑菇粉末液体培养基中进行厌氧发酵，得到富含β‑葡聚糖的发酵液。所述应用为植物乳杆菌CGMCC No.22505在发酵提取β‑葡聚糖中的应用。本发明提供的方法能耗低、成本低、工艺简单，且β‑葡聚糖的得率高、水溶性好、稳定性强、生物活性高，具有良好的工业应用前景。

Description

一株植物乳杆菌及其发酵提取β-葡聚糖的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其发酵提取β-葡聚糖的方法及应用。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于《可用于食品的菌种名单》的菌种，因其具有丰富的蛋白水解酶、纤维素酶和半纤维素酶，经常能从酸菜、泡菜、青贮饲料等植物基发酵食品或发酵产品中发现并分离鉴定，其能够有效耐受人体消化系统，在肠道内大量存活，调节肠道菌群、促进人体消化吸收，还具有调节血脂功效。食用蘑菇(Ediblemushroom)中具有丰富的碳水化合物(包括单糖、双糖、糖醇、寡糖和聚糖)、蛋白质、游离氨基酸以及多种维生素和矿物质，适合多种益生乳酸菌的生长和繁殖。在东欧，常用植物乳杆菌发酵食用蘑菇来延长蘑菇的保质期，同时也增强了食用蘑菇的营养和风味。
数千年来，蘑菇(Mushroom)被视为一种药食两用资源。自然界中存在2000多种蘑菇，作为食物被广泛接受的不到25种。大多数食用蘑菇均属于担子菌类，极少数属子囊菌类，在担子菌中，β-葡聚糖(β-Glucans)是食用蘑菇中常见的多糖成分。
β-葡聚糖是一种非淀粉可溶性多糖，除食用蘑菇以外还广泛存在于酵母、细菌、藻类和谷物(大麦、燕麦和黑麦)中，不同来源的β-葡聚糖在结构上有差异。燕麦和大麦β-葡聚糖是线性结构，具有β-(1，4)和β-(1，3)糖苷键；食用蘑菇β-葡聚糖具有以β-(1，3)糖苷键为骨架，短β-(1，6)糖苷键连接分支；酵母β-葡聚糖具有β-(1，6)糖苷键分支，并带有额外的β-(1，3)区域。这些结构上差异会造成提取方式和生物活性的不同，其中，具有三重螺旋结构的复杂分支的食用蘑菇β-葡聚糖，是所有类型的β-葡聚糖中抗肿瘤活性和免疫调节活性最有效的。
β-葡聚糖作为病原体相关分子模式(PAMP)诱导细胞反应，是通过与几种模式识别受体(Dectin-1、补体受体3、Toll样受体、清道夫受体)特异性相互作用的结果。这些受体结合在单核吞噬细胞(如巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和自然杀伤细胞)和中性粒细胞中，触发下游信号转导。巨噬细胞Dectin-1对β-葡聚糖的识别，会触发巨噬细胞的吞噬作用、ROS产生、抗菌肽和细胞因子的生成，激活机体固有免疫，从而平衡机体免疫力、抑制肿瘤细胞快速增殖和抗氧化作用(多糖特异性免疫识别的分子机制及其免疫生物学意义，《中国免疫学杂志》2009年第一期，戴慧等)。
目前，食用蘑菇中β-葡聚糖的提取方法主要包括：热水提取法(碱性水提取法和酸性水提取法)、超声波提取法、微波提取法、酶解辅助提取法，以及这几种方法联合使用提取法等(灵芝子实体多糖提取方法优化及不同来源赤芝子实体的多糖分子质量比较，《食品与发酵工业》2014年，孙小梅等)。但上述方法中，热水提取法时间长、能耗高、得率较低；超声波提取法对设备和工艺要求较高，同时可能部分破坏β-葡聚糖的糖苷键，造成分子量降低，最终导致β-葡聚糖生物活性降低；微波提取法能耗高、得率低；酶解辅助提取法常用的是纤维素水解酶，对设备和工艺要求较高。
因此，急需开发一种低能耗，低成本，工艺简单的提取食用蘑菇中β-葡聚糖的新方法。
发明内容
本发明针对提取食用蘑菇中β-葡聚糖的现有方法能耗高、对设备和工艺要求高、成本高但β-葡聚糖得率低、生物活性低，提供了一株植物乳杆菌CGMCC No.22505及其发酵提取β-葡聚糖的方法及应用，该提取方法能耗低、成本低、工艺简单，且得到β-葡聚糖得率高、水溶性好且稳定性强。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一株植物乳杆菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22505，保藏日期为2021年5月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述植物乳杆菌CGMCC No.22505分离自四川省自贡市农村自制的传统泡菜，通过16S rRNA测序、测序结果在NCBI中BLAST比对分析、利用MEGA软件构建系统发育树、结合形态学观察及生理生化实验结果，最终确定菌株为植物乳杆菌，命名为Lactobacillusplantarum FM-40。
本发明还提供了上述的植物乳杆菌在发酵提取β-葡聚糖中的应用。
具体地，所述β-葡聚糖来源于食用蘑菇。
本发明还提供了上述植物乳杆菌发酵提取食用蘑菇中β-葡聚糖的方法，所述方法为将植物乳杆菌接种于食用蘑菇粉末液体培养基中进行厌氧发酵，得到富含β-葡聚糖的发酵液。
具体地，上述食用蘑菇粉末液体培养基包括食用蘑菇粉末和水，以质量百分比计，所述食用蘑菇粉末5-20％，水80-95％，进一步优选地，食用蘑菇粉末9-16％，水84-91％，更进一步优选地，食用蘑菇粉末12％，水88％。
在一些具体的实施方案中，上述食用蘑菇粉末液体培养基的制备方法包括：将食用蘑菇粉末和水混合，搅拌均匀后，95-125℃灭菌20-80min，冷却后，即得所述食用蘑菇粉末液体培养基。
优选地，上述食用蘑菇粉末是由猴头菇粉末、姬松茸粉末、杏鲍菇粉末和绣球菌粉末混合制得。
优选地，上述食用蘑菇粉末的制备方法为将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入50-65℃的烘箱中烘烤1-3d，进一步优选地，在60℃下烘烤1.5d，更进一步优选地，在55℃下烘烤2d；将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌分别粉碎后，过50-400目的筛子，优选地，过100目的筛子，进一步优选地，过200目的筛子；过筛后，密封避光保存。
进一步优选地，上述猴头菇粉末、姬松茸粉末、杏鲍菇粉末和绣球菌粉末的质量比为15-40：5-20：15-50：15-45，更进一步优选地，质量比为18-35：8-17：20-45：10-40，更进一步优选地，质量比为20-30：10-15：25-40：20-30。
具体地，上述植物乳杆菌CGMCC No.22505的接种量(即发酵开始时发酵体系中植物乳杆菌的活菌数)为3.0x106-3.0x107cfu/mL，进一步优选地，接种量为6.0x106-1.0x107cfu/mL，更进一步优选地，接种量为8.0x106cfu/mL。
具体地，上述发酵温度为30-40℃，进一步优选地，发酵温度为33-37℃，更进一步优选地，发酵温度为35℃。
具体地，所述发酵时间为24-96h，进一步优选地，发酵时间为48-72h，更进一步优选地，发酵时间为60h。
优选地，上述富含β-葡聚糖的发酵液制备方法为：发酵结束后，将发酵液在90-100℃水浴中加热1-4h，进一步优选地，93℃加热1.5h，更进一步优选地，95℃加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液。
本发明还公开了一种富含β-葡聚糖的食品，所述食品包括上述的植物乳杆菌的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵液、改造菌、突变菌和/或诱变菌。
具体地，上述改造菌、突变菌和/或诱变菌是在植物乳杆菌CGMCC No.22505的基础上，通过自发突变、诱变、基因重组或遗传工程等手段改造原菌株的遗传型，获得的新菌株。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过16S rRNA测序结合传统微生物学以及生化与分子生物学和遗传学的方法，分离、培养和鉴定出了一株植物乳杆菌CGMCC No.22505，首次公开了其在发酵提取β-葡聚糖中的应用，由于发酵过程中不存在生化试剂对产物分子结构的破坏，因此得到的β-葡聚糖稳定性强，水溶性好，生物活性高。
本发明提供了一种利用植物乳杆菌发酵提取食用蘑菇中β-葡聚糖的方法，该方法能耗低、成本低、工艺简单，β-葡聚糖的得率高(发酵液中β-葡聚糖的浓度可达39.8g/100g干重)。与其他常规食用蘑菇中β-葡聚糖提取方法相比，极大简化了食用蘑菇中β-葡聚糖提取工艺，节省了生产成本，提高了生产效率，具有良好的工业应用前景。
保藏说明
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年5月12日
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：FM-40
保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22505
附图说明
图1为本发明的植物乳杆菌CGMCC No.22505厌氧培养后的菌落形态图；
图2为本发明的植物乳杆菌CGMCC No.2250516S rRNA基因全长序列的进化树。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所有食品原料均为市售，并均符合食品安全相关的卫生标准和质量标准，对其来源不做具体限定。
实施例1-15一种利用植物乳杆菌CGMCC No.22505发酵提取食用蘑菇中β-葡聚糖的方法及制得的富含β-葡聚糖的发酵液。
实施例1
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将植物乳杆菌CGMCC No.22505的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，徳国)，37℃厌氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入5mL MRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养24h取出，以2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)接种量接种于50mL MRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养16h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用的种子。
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入50℃的烘箱中烘烤3d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过50目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为15：15：50：20进行混合，即得食用蘑菇粉末。
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为5％(w/w，食用蘑菇粉末占食用蘑菇粉末液体发酵培养基的质量百分比，下同)的食用蘑菇粉末液体培养基，在95℃下灭菌80min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC No.22505种子以终浓度为3.0x106cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，30℃培养96h，发酵结束后，在90℃水浴中加热4h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S1。
实施例2
本实施例与实施例1的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入60℃的烘箱中烘烤1.5d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过100目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为40：10：35：15进行混合，即得食用蘑菇粉末。
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为20％的食用蘑菇粉末液体培养基，在110℃下灭菌60min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC No.22505种子以终浓度为3.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，40℃培养24h，发酵结束后，在98℃水浴中加热1h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S2。
其余同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入50℃的烘箱中烘烤3d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为15：15：50：20进行混合，即得食用蘑菇粉末。
制得的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S3。
其余同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入55℃的烘箱中烘烤2d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为20：5：40：35进行混合，即得食用蘑菇粉末。
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为9％的食用蘑菇粉末液体培养基，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC No.22505种子以终浓度为6.0x106cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，33℃培养65h，发酵结束后，在95℃水浴中加热3h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S4。
其余同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入65℃的烘箱中烘烤1d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过400目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为25：20：15：40进行混合，即得食用蘑菇粉末。
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为16％的食用蘑菇粉末液体培养基，在125℃下灭菌20min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC No.22505种子以终浓度为1.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，37℃培养55h，发酵结束后，在90℃水浴中加热1h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S5。
其余同实施例1。
实施例6
本实施例与实施例1的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入55℃的烘箱中烘烤2d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为30：10：20：40进行混合，即得食用蘑菇粉末。
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为12％的食用蘑菇粉末液体培养基，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC No.22505种子以终浓度为8.0x106cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，35℃培养60h，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S6。
其余同实施例1。
实施例7
本实施例与实施例6的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入40℃的烘箱中烘烤4d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为30：10：20：40进行混合，即得食用蘑菇粉末。
得到的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S7。
其余同实施例6。
实施例8
本实施例与实施例6的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入70℃的烘箱中烘烤0.5d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为30：10：20：40进行混合，即得食用蘑菇粉末。
得到的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S8。
其余同实施例6。
实施例9
本实施例与实施例6的不同在于:
1.材料与方法
(2)食用蘑菇粉末制备方法和组成：将新鲜的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌放入55℃的烘箱中烘烤2d，将烘干的猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌粉碎后，分别过200目的筛子，将猴头菇、姬松茸、杏鲍菇和绣球菌的粉末按质量比为10：30：50：10进行混合，即得食用蘑菇粉末。
得到的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S9。
其余同实施例6。
实施例10
本实施例与实施例6的不同在于:
1.材料与方法
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为3％的食用蘑菇粉末液体培养基，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
得到的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S10。
其余同实施例6。
实施例11
本实施例与实施例6的不同在于:
1.材料与方法
(3)食用蘑菇粉末液体发酵培养基的制备：将质量百分数为25％的食用蘑菇粉末液体培养基，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，即得食用蘑菇粉末液体发酵培养基。
得到的富含β-葡聚糖的发酵液，记为S11。
其余同实施例6。
实施例12
本实施例与实施例6的不同在于:
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCCNo.22505种子以终浓度为3.0x105cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，35℃培养60h，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S12。
其余同实施例6。
实施例13
本实施例与实施例6的不同在于:
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCCNo.22505种子以终浓度为8.0x106cfu/ml接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，35℃培养60h，发酵结束后，在55℃水浴中加热3h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S13。
其余同实施例6。
实施例14
本实施例与实施例6的不同在于:
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCCNo.22505种子以终浓度为8.0x106cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，25℃培养110h，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S14。
其余同实施例6。
实施例15
本实施例与实施例6的不同在于:
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCCNo.22505种子以终浓度为8.0x106cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，45℃培养20h，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为S15。
其余同实施例6。
对比例1
本对比例与实施例6的不同在于：
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393(购自ATCC)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，徳国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入5mLMRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养24h取出，以2％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)接种量接种于50mlMRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养24h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用的种子。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
干酪乳杆菌ATCC393种子以终浓度为1.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，37℃培养24h(最佳发酵时间和最佳发酵温度)，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为D1。
其余同实施例6。
对比例2
本对比例与实施例6的不同在于：
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将保加利亚乳杆菌LB340(丹尼斯科公司)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，徳国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入5mLMRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养24h取出，以2％接种量接种于50mlMRS液体培养基(Merck，徳国)，37℃培养24h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用的种子。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
保加利亚乳杆菌LB340种子以终浓度为1.0x107cfu/mL的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，37℃培养24h(最佳发酵时间和最佳发酵温度)，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为D2。
其余同实施例6。
对比例3
本对比例与实施例6的不同在于：
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3(科汉森公司)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(Merck，德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入5mLM17液体(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用种子。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
嗜热链球菌ST-BODY-3种子以终浓度为1.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，40℃培养24h(最佳发酵时间和最佳发酵温度)，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为D3。
其余同实施例6。
对比例4
本对比例与实施例6的不同在于：
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将副干酪乳杆菌ATCC 334(购自ATCC)冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入5mL MRS液体培养基(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体培养基，37℃培养24h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用种子。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
副干酪乳杆菌ATCC 334种子以终浓度为1.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，37℃培养48h(最佳发酵时间和最佳发酵温度)，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为D4。
其余同实施例6。
对比例5
本对比例与实施例6的不同在于：
1.材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：将植物乳杆菌ATCC14917(购自ATCC)冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck，德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入5mL MRS液体培养基(Merck，德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体培养基，37℃培养24h后，培养物3,000g离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用无菌生理盐水悬浮，得到发酵用种子。
2.富含β-葡聚糖的发酵液的制备
植物乳杆菌ATCC14917种子以终浓度为1.0x107cfu/ml的接种量，在无菌条件下，接种于上述食用蘑菇粉末液体发酵培养基中，37℃培养48h(最佳发酵时间和最佳发酵温度)，发酵结束后，在95℃水浴中加热2.5h，冷却至室温，即得富含β-葡聚糖的发酵液，记为D5。
其余同实施例6。
实验例1发酵液中β-葡聚糖浓度的检测
实施例1-15和对比例1-5中富含β-葡聚糖的发酵液中β-葡聚糖浓度的测定：使用Megazyme公司的β-葡聚糖(酵母和蘑菇)检测试剂盒，测定样品中(1，3；1，6)β-葡聚糖的浓度，换算成使用100g食用蘑菇干重粉末作为原料，所得的β-葡聚糖质量，单位为g/100g干重。(测定方法参考：Megazyme公司的β-葡聚糖(酵母和蘑菇)检测试剂盒说明书)
结果如下表1
表1
实施例16植物乳杆菌CGMCC No.22505
保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22505，保藏日期为2021年5月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实验例2植物乳杆菌CGMCC No.22505的分离、培养和鉴定
1、分离培养和鉴定：植物乳杆菌CGMCC No.22505分离自四川省自贡市农村自制的传统泡菜，取5g泡菜浸泡于45mL无菌生理盐水中，并震荡30-50s，随后取1mL加入9mL无菌水中，再采用逐级稀释法涂布于含碳酸钙(浓度为20g/L)的MRS培养基(CaCO3-MRS)中，37℃厌氧培养48h，挑取能产生溶钙圈、形态较大并凸起的单菌落，在MRS平板上划线反复分离纯化后，最后挑取单菌落送至基因测序公司进行16S rRNA测定。测序结果在NCBI进行BLAST分析，利用MEGA软件构建系统发育树。结合形态学观察及生理生化实验结果，最终确定菌株为植物乳杆菌，菌株号为FM-40。
2、菌落特征分析：在MRS培养基平板上37℃厌氧培养48h后，呈现规则的凸起状态，见附图1。
3、植物乳杆菌CGMCC No.22505 16S rRNA基因全长核酸序列(SEQ ID NO:1)如下：
CGCTGGTTCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCCGGATGCAAGCATCACTCAATCCCAGAG
利用NCBI数据库对上述所得菌株的16S rRNA基因全长序列进行比对分析，并利用MEGA软件构建系统发育树(如附图2所示)。结果显示该菌株与植物乳杆菌3304的16S rRNA基因相似度达到99.65％，从系统进化树也可以看出，与该菌株相邻的菌株均属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，因此，可以确定，该菌株为一株新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，我们将该菌株命名为Lactobacillus plantarumFM-40。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<InventionTitle>一株植物乳杆菌及其发酵提取-葡聚糖的方法及应用</InventionTitle>
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cgattccgac ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa tggctttaag 180
agattagctt actctcgcga gttcgcaact cgttgtacca tccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtctc accagagtgc ccaacttaat gctggcaact gataataagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta 420
tccatgtccc cgaagggaac gtctaatctc ttagatttgc atagtatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcggaatgct taatgcgtta 600
gctgcagcac tgaagggcgg aaaccctcca acacttagca ttcatcgttt acggtatgga 660
ctaccagggt atctaatcct gtttgctacc catactttcg agcctcagcg tcagttacag 720
accagacagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattt caccgctaca 780
catggagttc cactgtcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg cacttcttcg 840
gttgagccga aggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct ttacgcccaa 900
taaatccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960
tggctttctg gttaaatacc gtcaatacct gaacagttac tctcagatat gttcttcttt1020
aacaacagag ttttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggcgttgc tccatcagac1080
tttcgtccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg gccgtgtctc1140
agtcccaatg tggccgatta ccctctcagg tcggctacgt atcattgcca tggtgagccg1200
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Claims (10)

1.一株植物乳杆菌，其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22505，保藏日期为2021年5月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种权利要求1所述的植物乳杆菌在发酵提取β-葡聚糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述β-葡聚糖来源于食用蘑菇。
4.一种权利要求1所述的植物乳杆菌发酵提取食用蘑菇中β-葡聚糖的方法，其特征在于，将植物乳杆菌接种于食用蘑菇粉末液体培养基中进行厌氧发酵，得到富含β-葡聚糖的发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述食用蘑菇粉末是由猴头菇粉末、姬松茸粉末、杏鲍菇粉末和绣球菌粉末混合制得。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述食用蘑菇粉末液体培养基包括食用蘑菇粉末和水；以质量百分比计，所述食用蘑菇粉末5-20％，水80-95％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌CGMCC No.22505的接种量为3.0x106-3.0x107cfu/mL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为30-40℃；所述发酵时间为24-96h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述富含β-葡聚糖的发酵液的制备方法为发酵结束后，将发酵液在90-100℃水浴中加热1-4h，即得富含β-葡聚糖的发酵液。
10.一种富含β-葡聚糖的食品，其特征在于，所述食品包括权利要求1所述的植物乳杆菌的发酵液。
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