CN110835378A - 灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物 - Google Patents

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Abstract

一种灵芝及酵母β‑葡聚糖复合多糖体组合物，以重量百分比计，包含3.2％至12.8％的一灵芝菌丝体及子实体萃取液、3％至12％的一酵母β‑葡聚糖萃取液、2.5％至10.0％的一云芝菌丝体萃取液、3.0％至12.0％的一白木耳萃取液、2.5％至10.0％的一黑木耳萃取液、0.5％至2.0％的一猴头菇萃取液以及水。

Description

灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物
技术领域
本发明属于多糖体组合物技术领域，具体涉及一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物。
背景技术
存在于菇蕈类的多糖体，具有提升免疫功能的功效，以灵芝为例，长久以来即广泛使用作为营养及保健食品的原料。β-葡聚糖(β-Glucan)为多糖体的一种，与多糖体的免疫功效极为相关。
以往多糖体保健产品有单一成分产品，也有复方产品，而复方产品具有更佳的免疫调节功效，更能获得消费者青睐。随着现代社会消费者对保健食品的需求提升，亟待开发兼具风味及保健功效的复方多糖体产品。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，可以提升免疫功能。
为了达到上述目的，本发明提供的一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，以重量百分比计，包含3.2％至12.8％的一灵芝菌丝体及子实体萃取液、3％至12％的一酵母β-葡聚糖萃取液、2.5％至10％的一云芝菌丝体萃取液、3％至12％的一白木耳萃取液、2.5％至10％的一黑木耳萃取液、0.5％至2％的一猴头菇萃取液以及水。
为了达到上述目的，本发明还提供一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制造方法，包括以下步骤：将一灵芝菌的菌体发酵产物及子实体粉末、一酵母菌的菌体发酵产物、一云芝菌的菌体发酵产物、一白木耳的子实体粉末、一黑木耳的子实体粉末及一猴头菇的子实体粉末，分别与水以重量比10：1至40：1的比例各别混合成一混合物，再分别将所述混合物在70至100℃搅拌2至6小时，进行压滤，去除固体，取其滤液进行浓缩并加热灭菌后分别获得一灵芝菌丝体及子实体萃取液、一酵母β-葡聚糖萃取液、一云芝菌丝体萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液及一猴头菇萃取液，再将所述所有的萃取液进行调和获得所述灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物。
本发明的有益效果在于，通过复方多糖体组合物的综合作用，有效提升特异性及非特异性的免疫功能。
附图说明
图1为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物每周平均体重变化图表；
图2为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞增生能力图表；
图3为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物自发性细胞激素IL-2、TNF-α以及IFN-γ分泌量图表；
图4为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物经OVA刺激后细胞激素IL-2分泌量图表；
图5为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物经OVA刺激后细胞激素TNF-α分泌量图表；
图6为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物经OVA刺激后细胞激素IFN-γ分泌量图表；
图7为特异性免疫调节功能评估试验的试验动物anti-OVA IgG2a抗体生成量图表；
图8为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物每周平均体重变化图表；
图9为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞增生能力图表；
图10为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物自然杀伤细胞活性图表；
图11为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物吞噬细胞活性图表；
图12为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物自发性细胞激素IL-2以及IFN-γ分泌量图表；
图13为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞经Con A刺激后细胞激素IL-2分泌量图表；
图14为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞经LPS刺激后细胞激素IL-2分泌量图表；
图15为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞经Con A刺激后细胞激素IFN-γ分泌量图表；
图16为非特异性免疫调节功能评估试验的试验动物脾脏免疫细胞经LPS刺激后细胞激素IFN-γ分泌量图表。
具体实施方式
为了能更清楚地说明本发明，现结合实施例并配合附图详细说明。
本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，取自多种菇菌类的萃取液，主要配方包含一灵芝菌丝体及子实体萃取液、一酵母β-葡聚糖萃取液、一云芝菌丝体萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液、一猴头菇萃取液以及水。
一、本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制备方法
1、在菌体发酵产物中取得多糖体的方式
1.1制备菌体发酵液
将菌种分别接种在碳源(例如葡萄糖或蔗糖)0.5至5.0重量百分比、氮源(例如酵母提取物、酵母蛋白胨或大豆蛋白胨)0.1至1.5重量百分比及其他微量物质(例如微量元素及无机物)、酸碱值介于5.0至6.5之间的一培养基中，在温度20℃至30℃通气搅拌培养2至7天后即可得到菌体发酵产物。
1.2取得多糖体萃取液
将菌体发酵产物与水以重量比10：1至40：1的比例各别混合成一混合物后，在70℃至100℃搅拌所述混合物2至6小时，将所述混合物进行压滤，去除固体，取其滤液进行浓缩，加热灭菌，获得多糖体萃取液。
2、在子实体中取得多糖体的方式
2.1制备子实体混合液
将子实体粉末与水以重量比10：1至40：1的比例各别混合成一混合物后，在70℃至100℃搅拌所述混合物2至6小时。
2.2取得多糖体萃取液
将前述混合物各别进行压滤，去除固体，取其滤液进行浓缩，加热灭菌，获得多糖体萃取液。
3、多糖规格的测定方式
3.1计算β-葡聚糖含量
将酵母β-葡聚糖萃取液加入适当体积的缓冲液混合均匀后，再依次加入α-淀粉酶(α-amylase)、蛋白水解酶(Protease)及淀粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase)三种酶处理后，以4倍体积的酒精进行沉淀，将β-葡聚糖自溶液中沉降分离出来，收集沉淀物以酒精清洗后干燥，干燥后的沉淀物以强酸和高温水解处理，经酸碱中和后测定葡萄糖，并计算β-葡聚糖含量。
3.2检测多糖体浓度
将灵芝菌丝体及子实体萃取液、酵母β-葡聚糖萃取液、云芝菌丝体萃取液、白木耳萃取液、黑木耳萃取液以及猴头菇萃取液分别稀释至适当浓度，注入透析膜(规格：MW6000～8000)内，以流动水进行48小时透析(流速：0.2L/min)，透析后的液体使用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)测定多糖体浓度。当糖类遇到强酸时，结构式上的羟基与酚结合，会产生橘黄色液体，因此可用比色法测定吸光值以检测其多糖体的浓度。
4、实例
本实例以灵芝菌、酵母菌及云芝菌的菌种，以及灵芝、白木耳、黑木耳及猴头菇的子实体依照前述方式制备多糖体萃取液。
品名 重量百分比例 多糖规格(g/L)
灵芝菌丝体及子实体萃取液 3.2～12.8％ 5～7
酵母β-葡聚糖萃取液 3.0～12％ 10～12
云芝菌丝体萃取液 2.5～10％ 5～7
白木耳萃取液 3.0～12％ 10～12
黑木耳萃取液 2.5～10％ 10～12
猴头菇萃取液 0.5～2％ 5～7
柠檬酸 0.13～0.52％ -
乙酰磺胺酸钾 0.035～0.14％ -
柳橙浓缩汁 3.4～13.6％ -
水 补水至100％ -
本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物还可以包含以柠檬酸为例的调味剂、以乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)为例的甜味剂，以及以柳橙浓缩汁为例的果汁浓缩汁。
本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，以重量百分比计，包含：3.2％至12.8％的灵芝菌丝体及子实体萃取液、3％至12％的酵母β-葡聚糖萃取液、2.5％至10％的云芝菌丝体萃取液、3％至12％的白木耳萃取液、2.5％至10％的黑木耳萃取液、0.5％至2％的猴头菇萃取液、0.13％至0.52％的柠檬酸、0.035％至0.14％的乙酰磺胺酸钾、3.4％至13.6％的柳橙浓缩汁以及水。
为评估本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物促进免疫细胞的增生能力，以下动物试验分别就特异性及非特异性免疫调节功效进行评估。
二、发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物效果评估
1、特异性免疫调节功效
1.1试验组别设计及试验物质加入剂量
选用7周龄的BALB/c雌性小鼠进行动物试验，如表1所示，试验组别设计有负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组以及正常对照组，每组试验动物只数为10只，其中负对照组仅加入灭菌水、低剂量组的试验物质加入剂量为1倍人体建议剂量、中剂量组为2倍人体建议剂量、高剂量组为4倍人体建议剂量、正常对照组仅加入灭菌水。本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的人体建议剂量为180mL/day，根据2005年美国食品药物管理局所公告的方法，动物与人体的每公斤体重剂量折算数为12.3，依此法换算各组别小鼠加入剂量。将本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物以冷冻干燥方式制备成粉末，以灭菌水配置试验物质后，直接进行管喂加入。试验动物于每日经口管喂方式给予试验物质及负对照溶液(即灭菌水)一次，连续8周，加入体积为10mL/kg，每日加入1次。
表1、试验组别设计及试验物质加入剂量
Figure BDA0002159742950000061
1.2致敏小鼠
于加入试验物质4周后，以卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)做为免疫原致敏试验小鼠，以腹腔注射方式给予100μL的25μg OVA及佛氏完全辅剂(complete Freund’s adjuvant)混合液，2周后再次腹腔注射100μL的25μg OVA及佛氏不完全辅剂(incomplete Freund’sadjuvant)混合液为追加致敏。试验结束后牺牲小鼠，采取血液以及脾脏细胞进行免疫功能评估分析，包括测定免疫细胞增生、免疫细胞激素分泌、免疫细胞种类以及血清抗体浓度等，通过实验评估本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物特异性免疫调节的功效。
1.3试验动物观察
试验期间，试验动物的活动力、毛色及反应都没有异常，也无任何脱毛、异常临床症状或死亡等情形。试验开始时，各组平均体重约为17.3至17.8g，试验结束时，各组平均体重约为20.1至20.7g。试验期间各组别试验动物的体重皆无明显差异，如图1所示。此外，脾脏与体重的相对重量在OVA诱导各组别皆显著高于正常对照组，此乃OVA致敏所造成的现象。但在各OVA致敏组间(包含负对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组)脾脏与体重的相对重量均无差异，如表2所示。
表2、试验动物每周平均体重变化及脾脏与体重的相对重量比
Figure BDA0002159742950000071
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。脾脏与体重的相对重量比的计算方式为[脾脏重量(g)/体重(g)]×100％
1.4免疫细胞增生试验
于96孔盘中，加入定量为1.0×105cells/well的脾脏细胞，以OVA刺激细胞，经培养72小时后，进行反应(
Figure BDA0002159742950000072
Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay)，利用OD490nm测定吸光值，由此评估试验物质对于淋巴细胞增生的作用。试验结果以刺激指数(Stimulation index，S.I.)表示，计算方式如下：Stimulation index(S.I.)＝OVA刺激后OD490nm/无裂殖素刺激OD490nm。
如表3及图2所示，脾脏免疫细胞经OVA刺激后，经OVA致敏的各组别包含负对照组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组相较于正常对照组(也即无OVA致敏)皆呈现显著上升(p<0.05)。在OVA致敏的小鼠方面，加入试验物质的各个组别(包含低剂量组、中剂量组以及高剂量组)皆显著高于负对照组(p<0.05)。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进OVA诱导的免疫细胞增生的功效。
表3、脾脏免疫细胞增生能力
Figure BDA0002159742950000081
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分
析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。Stimulation index(S.I.)＝脾脏细胞经OVA
刺激后的吸光值/脾脏细胞无裂殖素刺激的吸光值。
1.5细胞激素分析
在24孔盘中，加入定量为0.5至2×106cells/well的脾脏细胞，加入25μg/mL OVA，并于37℃、5％CO2下培养48至72小时。收取细胞培养液，经离心(300×g、4℃、10分钟)后取上清液，以ELISA Cytokine assay kit测定细胞激素包含细胞白介素-2(Interleukin-2,IL-2)、细胞白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、细胞白介素-5(Interleukin-5,IL-5)、细胞白介素-10(Interleukin-10,IL-10)以及干扰素-γ(Interferonγ,IFN-γ)等的含量。另外，肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)则是于48小时OVA刺激后进行分析。由此评估试验物质对于淋巴细胞分泌细胞激素的影响。
1.5.1IL-2分泌量
如表4及图3所示，在无OVA刺激下，各组别自发性IL-2的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA致敏的各组别中，经OVA刺激后与负对照组相比，IL-2均有显著上升(p<0.05)，如图4所示。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进OVA诱导的IL-2分泌量的功效。
表4、细胞激素分泌含量
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
1.5.2IL-4分泌量
再参照表4，在无OVA刺激下，各组别自发性IL-4的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA诱导后，IL-4分泌量在OVA致敏的动物中不论负对照组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组之间均无明显差异(p>0.05)。
1.5.3IL-5分泌量
再参照表4，在无OVA刺激下，各组别自发性IL-5的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA诱导后，IL-5分泌量在OVA致敏的动物中不论负对照组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组之间均无明显差异(p>0.05)。
1.5.4IL-10分泌量
再参照表4，在无OVA刺激下，各组别自发性IL-10的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA诱导后，IL-10分泌量在OVA致敏的动物中不论负对照组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组之间均无明显差异(p>0.05)。
1.5.5TNF-α分泌量
再参照表4及图3，在无OVA刺激下，各组别自发性TNF-α的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA诱导后，与负对照组相比，TNF-α分泌量在OVA致敏的动物中随着剂量增加而有升高的趋势，在高剂量组达到显著性差异(p<0.05)，如图5所示。
1.5.6IFN-γ分泌量
再参照表4及图3，在无OVA刺激下，各组别自发性IFN-γ的分泌量均无显著性差异(p>0.05)。而在OVA诱导下，OVA致敏的各组别(包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)均显著高于正常对照组(无OVA致敏)显示OVA致敏模式成功。经OVA诱导后，加入试验物质的各组别与负对照组相比，IFN-γ均有显著上升(p<0.05)，如图6所示。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进OVA诱导的IFN-γ分泌量的功效。
1.6血液中抗体含量试验
将全血离心后，收取血清，并保存于-80℃以供进一步分析OVA特异性抗体anti-OVA IgG2a、OVA特异性抗体anti-OVA IgG1以及OVA特异性抗体anti-OVA IgE的浓度。于4℃下被覆OVA 24小时，经清洗后，将血清检体加入盘中(三重复)，于37℃下放置1小时。经含Tween 20的磷酸盐缓冲食盐水(Phosphate buffered saline with Tween 20,PBST)清洗后与标示有过氧化酶(Horseradish peroxidase,HRP)的二级抗体作用，并以SureBlueReserve TMB Microwell Peroxidase Substrate呈色。通过检测OD450nm来定量血清中的抗体。OVA特异性抗体的结果以ELISA unit(EU)呈现，计算公式如下：ELISA Unit(EU)＝(Asample–Ablank)/(Apositive-Ablank)。
如表5所示，因OVA致敏的关系，经OVA致敏的各组别包含负对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，其血清中anti-OVA IgG2a、anti-OVA IgG1以及anti-OVA IgE抗体均较正常对照组(无OVA致敏)高(p<0.05)，显示OVA致敏模式成功。其中anti-OVA IgG2a在低剂量组、中剂量组以及高剂量组相较于其负对照组有显著增加(p<0.05)，如图7所示。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进OVA致敏小鼠体内anti-OVAIgG2a抗体的生成。
表5、OVA特异性血清抗体生成
Figure BDA0002159742950000111
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
1.7淋巴细胞表面标记分析试验
取定量为5×105cells/well的脾脏细胞，分别以标示有荧光的抗体进行免疫荧光染色，再以流式细胞仪分析T细胞(CD3+/CD45+)、B细胞(CD19+/CD45+)、T4细胞(CD4+/CD3+)、T8细胞(CD8+/CD3+)以及NK细胞(PanNK+/CD45+)等淋巴细胞的比例，以观察淋巴细胞次族群的变化。如表6所示，试验动物的脾脏免疫细胞族群包含T细胞、B细胞、T4细胞、T8细胞以及NK细胞，于各试验组别间均无差异。
表6、脾脏免疫细胞表面抗原标记分析
Figure BDA0002159742950000121
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
Figure BDA0002159742950000122
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
综上所述，如表7所示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进OVA诱发的免疫细胞增生能力、增加血清anti-OVA IgG2a抗体的含量，此外，在OVA刺激作用下，可增加免疫细胞分泌IL-2、IFN-γ以及TNF-α的分泌，具有提升特异性免疫功能的功效。
表7、特异性免疫调节试验结果总表
Figure BDA0002159742950000131
－：表示与负对照组比无显著差异；+：有OVA刺激
p<0.05↑：表示与负对照组比具显著差异增加
p<0.05↓：表示与负对照组比具显著差异减少
2、非特异性免疫调节功效
2.1试验组别设计及试验物质加入剂量
选用7周龄的BALB/c雌性小鼠进行动物试验，如表8所示，试验组别设计有负对照组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组，每组试验动物只数为10只，其中负对照组仅加入灭菌水、低剂量组的试验物质加入剂量为1倍人体建议剂量、中剂量组为2倍人体建议剂量、高剂量组为4倍人体建议剂量。本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的人体建议剂量为180mL/day，依动物与人体的每公斤体重剂量折算数12.3换算各组别小鼠加入剂量。将本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物以冷冻干燥方式制备成粉末，以灭菌水配置试验物质后，直接进行管喂加入。试验动物于每日经口管喂方式给予试验物质及负对照溶液(即灭菌水)一次，连续6周，加入体积为10mL/kg，每日加入1次。
表8、试验组别设计及试验物质加入剂量
Figure BDA0002159742950000141
在加入试验物质6周后牺牲小鼠，采取血液、脾脏细胞以及腹腔吞噬细胞进行免疫功能评估分析，包括测定免疫细胞增生、吞噬细胞活性、自然杀伤细胞活性、免疫细胞激素分泌、免疫细胞种类以及血清抗体浓度等，由此评估本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物非特异性免疫调节的功效。
2.2试验动物观察
试验期间，试验动物的活动力、毛色及反应皆无异常，也无任何脱毛、异常临床症状或死亡等情形。试验开始时，各组平均体重约为17.7至17.9g，试验结束时，各组平均体重约为19.8至20.6g。试验期间各组的动物体重皆有稳定上升，且各组别试验动物的体重皆无明显差异(p>0.05)，如图8所示。此外，脾脏与体重的相对重量于各组间均无显著差异，如表9所示。
表9、试验动物每周平均体重变化及脾脏与体重的相对重量比
Figure BDA0002159742950000142
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。脾脏与体重的相对重量比的计算方式为[脾脏重量(g)/体重(g)]×100％
2.3免疫细胞增生试验
将定量为2.0×105cells/well的脾脏细胞，分别以细胞裂殖素Concanavalin A(Con A)、lipopolysaccharide(LPS)刺激T细胞与B细胞的生长，经培养72小时后，进行反应(CellTiter
Figure BDA0002159742950000152
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)，利用OD490nm测定吸光值，由此评估试验物质对于淋巴细胞增生的作用。试验结果以刺激指数(Stimulationindex,S.I.)表示，计算方式如下：Stimulation index(S.I.)＝OD490nm裂殖素刺激后/OD490nm无裂殖素刺激。
如表10及图9所示，脾脏免疫细胞经Con A刺激后，低剂量组、中剂量组以及高剂量各组相较于负对照组皆呈现显著上升(p<0.05)；另外，脾脏免疫细胞经LPS刺激后，仅有高剂量组显著高于负对照组。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进免疫细胞增生的功效。
表10、脾脏免疫细胞增生能力
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
Stimulation index(S.I.)＝脾脏细胞经Con A或LPS刺激后的吸光值/脾脏细胞无裂殖素刺激的吸光值。
2.4自然杀伤细胞活性试验
利用YAC-1细胞株(即小鼠淋巴瘤细胞)作为自然杀伤细胞的目标，以PKH67kit将YAC-1细胞标示上荧光，再以定量的脾脏细胞(含自然杀伤细胞)与已标示荧光的YAC-1细胞依10：1及25：1的比例在37℃下共同培养4小时，最后加入50μL的Propidium iodine(PI)solution(0.1mg/mL)，再利用流式细胞仪进行分析，由此分析自然杀伤细胞的毒杀能力。
如表11及图10所示，在自然杀伤细胞与小鼠淋巴瘤YAC-1细胞比例(E/T ratio)为10：1及25：1的比例下，低剂量组、中剂量组以及高剂量组相较于负对照组皆显著增高(p<0.05)。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物有助于增强自然杀伤细胞活性。
表11、自然杀伤细胞活性
Figure BDA0002159742950000161
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
E(Effector)为自然杀伤细胞(NK cell)；T(Target)为YAC-1细胞，E/T ratio即为自然杀伤细胞与YAC-1细胞作用的比例。
2.5吞噬细胞活性试验
将定量的试验动物腹腔吞噬细胞与标示荧光的E.coli在感染剂量(Multiplicityof infection,M.O.I.)为12.5、25以及50的比例下，于37℃下共同培养2小时，使吞噬细胞进行吞噬E.coli。作用完毕后，利用流式细胞仪侦测带有荧光的吞噬细胞量，由此评估吞噬细胞的吞噬活性。
如表12及图11所示，在M.O.I.为12.5时，吞噬细胞活性在中剂量组以及高剂量组相较于负对照组均有显著增加(p<0.05)；在M.O.I.为25及50比例下，低剂量组、中剂量组以及高剂量组皆显著高于负对照组(p<0.05)。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物有助于增加吞噬细胞活性。
表12、吞噬细胞活性
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
细胞的吞噬能力即为带有荧光E.coli的吞噬细胞百分比。
2.6细胞激素分析试验
取定量为0.5至1×106cells/well的脾脏细胞分别加入Con A及LPS，并于37℃下培养。经72小时Con A或LPS刺激后，收取细胞培养液，经离心(300×g、4℃、10分钟)后取上清液，以ELISA Cytokine assay kit测定细胞激素IL-2、IL-4、IL-5、IL-10以及IFN-γ含量。另外，TNF-α则是于48小时Con A或LPS刺激后进行分析。由此评估试验物质对于淋巴细胞分泌细胞激素的影响。
2.6.1IL-2分泌量
如表13及图12所示，在自发性IL-2分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。脾脏免疫细胞经Con A刺激后，相较于负对照组，各试验组的IL-2量皆有显著性增加(p<0.05)，如图13所示；而脾脏免疫细胞在LPS刺激下，高剂量组的IL-2分泌显著高于负对照组(p<0.05)，如图14所示。此结果表示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有使脾脏免疫细胞在细胞裂殖素刺激下有助于促进IL-2的分泌的功效。
表13、细胞激素分泌含量
Figure BDA0002159742950000181
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
2.6.2IL-4分泌量
再参照表13，在自发性IL-4分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。在Con A及LPS的刺激下，各试验组的IL-4分泌情形相较于负对照组均无明显差异(p>0.05)。
2.6.3IL-5分泌量
再参照表13，在自发性IL-5分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。在Con A及LPS的刺激下，各试验组的IL-5分泌情形相较于负对照组均无明显差异(p>0.05)。
2.6.4IL-10分泌量
再参照表13，在自发性IL-10分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。在Con A及LPS的刺激下，各试验组的IL-10分泌情形相较于负对照组均无明显差异(p>0.05)。
2.6.5TNF-α分泌量
再参照表13，在自发性TNF-α分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。在经Con A及LPS刺激后，各试验组的TNF-α量虽随着剂量的增高有上升的趋势，但相较于负对照组均无明显差异(p>0.05)。
2.6.6IFN-γ分泌量
再参照表13及图12，在自发性IFN-γ分泌表现上(未加入细胞裂殖素)，各试验组与负对照组相比没有明显差异。经Con A刺激后，各试验组的IFN-γ量皆显著高于负对照组(p<0.05)，如图15所示；另外，在LPS刺激下，虽各试验组有上升的趋势，但相较于负对照组均未达显著差异(p>0.05)，如图16所示。
2.7血液中抗体含量试验
将血液离心(2200×g、15分钟)后，收取血清，并利用Mouse IgM、IgE、IgA及IgGELISA Quantitation Set测定血清中抗体浓度。如表14所示，在血清抗体方面，IgM、IgE、IgA及IgG在各试验组间均无显著性差异(p>0.05)。
表14、血清抗体生成
Figure BDA0002159742950000201
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
2.8淋巴细胞表面标记分析试验
取定量为5×105cells/well的脾脏细胞，分别以标示有荧光的抗体进行免疫荧光染色，再以流式细胞仪分析T细胞(CD3+/CD45+)、B细胞(CD19+/CD45+)、T4细胞(CD4+/CD3+)、T8细胞(CD8+/CD3+)以及NK细胞(PanNK+/CD45+)等淋巴细胞的比例，以观察淋巴细胞次族群的变化。如表15所示，试验动物的脾脏免疫细胞族群包含T细胞、B细胞、T4细胞、T8细胞以及NK细胞，于各试验组别间均无差异。
表15、脾脏免疫细胞表面抗原标记分析
Figure BDA0002159742950000202
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，
并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
Figure BDA0002159742950000203
结果以平均值±标准偏差表示，每组10只试验动物。数据以One-way ANOVA进行分析，并采用Duncan进行事后检定，分析组间差异。
综上所述，如表16所示，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物具有促进免疫细胞增生能力、提升吞噬细胞及自然杀伤细胞活性，在细胞裂殖素刺激作用下，也可增加细胞激素IL-2及IFN-γ的分泌，具有提升非特异性免疫功能的功效。
表16、非特异性免疫调节试验结果总表
Figure BDA0002159742950000211
－：表示与负对照组比无显著差异
p<0.05↑：表示与负对照组比具显著差异增加
p<0.05↓：表示与负对照组比具显著差异减少
据上所述，本发明的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物在服用后可提升特异性及非特异性的免疫功能。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，其特征在于，以重量百分比计，包含3.2％至12.8％的一灵芝菌丝体及子实体萃取液、3％至12％的一酵母β-葡聚糖萃取液、2.5％至10％的一云芝菌丝体萃取液、3％至12％的一白木耳萃取液、2.5％至10％的一黑木耳萃取液、0.5％至2％的一猴头菇萃取液以及水。
2.根据权利要求1所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，其特征在于，包含一调味剂，其中所述调味剂包含柠檬酸。
3.根据权利要求1所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，其特征在于，包含一甜味剂，其中所述甜味剂包含乙酰磺胺酸钾。
4.根据权利要求1所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，其特征在于，包含一果汁浓缩汁，其中所述果汁浓缩汁包含柳橙浓缩汁。
5.根据权利要求1所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物，其特征在于，所述灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物包含粉末、饮品或胶囊形式。
6.一种灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：将一灵芝菌的菌体发酵产物及子实体粉末、一酵母菌的菌体发酵产物、一云芝菌的菌体发酵产物、一白木耳的子实体粉末、一黑木耳的子实体粉末及一猴头菇的子实体粉末，分别与水以重量比10：1至40：1的比例各别混合成一混合物，再分别将所述混合物在70℃至100℃搅拌2至6小时，进行压滤，去除固体，取其滤液进行浓缩并加热灭菌后分别获得一灵芝菌丝体及子实体萃取液、一酵母β-葡聚糖萃取液、一云芝菌丝体萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液及一猴头菇萃取液，再将所述所有的萃取液进行调和获得所述灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物。
7.根据权利要求6所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制造方法，其特征在于，所述灵芝菌的菌体发酵产物、所述酵母菌的菌体发酵产物或所述云芝菌的菌体发酵产物的制备步骤包含分别将一灵芝菌的菌种、一酵母菌的菌种或一云芝菌的菌种接种在碳源的重量百分比为0.5至5.0、氮源的重量百分比为0.1至1.5及其他微量物质、酸碱值介于5.0至6.5之间的一培养基中，在温度20℃至30℃通气搅拌培养2至7天。
8.根据权利要求6所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制造方法，其特征在于，还包含以重量百分比计，3.2％至12.8％的所述灵芝菌丝体及子实体萃取液、3％至12％的所述酵母β-葡聚糖萃取液、2.5％至10％的所述云芝菌丝体萃取液、3％至12％的所述白木耳萃取液、2.5％至10％的所述黑木耳萃取液以及0.5％至2％的所述猴头菇萃取液的一比例进行调和的步骤。
9.根据权利要求6所述的灵芝及酵母β-葡聚糖复合多糖体组合物的制造方法，其特征在于，所述灵芝菌丝体及子实体萃取液的多糖规格为5～7g/L、所述酵母β-葡聚糖萃取液的多糖规格为10～12g/L、所述云芝菌丝体萃取液的多糖规格为5～7g/L、所述白木耳萃取液的多糖规格为10～12g/L、所述黑木耳萃取液的多糖规格为10～12g/L、所述猴头菇萃取液的多糖规格为5～7g/L。
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