CN115368481B - 一种具有多功效的松露多糖的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有多功效的松露多糖的制备方法及应用，涉及生物多糖技术领域，包括步骤：松露粉碎，浸提，过滤浓缩，得松露多糖浓缩液；浓缩液干燥后得松露多糖水提物，或浓缩液与无水乙醇混合，静置醇沉，分离除去上清液，得到松露水提醇沉物；松露水提醇沉物加水复溶，分离不溶固体，得到上清液；无水乙醇和上清液混合，依次调节混合液中乙醇体积分数，静置醇沉，得到松露分级醇沉物；最后将上清液浓缩；得到多种松露多糖样品。本发明制备得到的松露多糖具有不同的抗氧化、抗炎和抗衰能力，可应用于制备抗氧化、抗衰老的食品、保健品、药物、化妆品及COX‑2抑制剂、抗炎药物中。
Description
技术领域
本发明属于生物多糖技术领域，具体涉及一种具有多功效的松露多糖的制备方法及应用。
背景技术
松露是非常珍贵和稀有的食用菌，它是与乔木和灌木共生的真菌，食用历史悠久，其经济价值和药用价值极高，也被称为“植物黄金”。松露营养丰富，富含多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、不饱和脂肪酸、矿物质等。其中松露多糖是松露中最重要的成分之一，具有较高的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂用于保健功能食品，以减少皱纹的生成，延缓衰老。松露多糖还具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、舒缓抗炎等作用。因此，将松露中的松露多糖提取出来，添加至保健食品或药剂中可充分发挥其功效。
一般植物的细胞壁比较牢固，需要在提取之前进行破细胞操作。目前植物多糖的提取方法主要有：热水浸提法，碱浸提法，酶解提取法、微波辅助法以及超声波法。其中，热水浸提法是一种国内外常用的提取多糖的传统方法，所需条件简单，适用于游离态多糖的提取，并且干扰物质少，但收率较低。酶法是采用酶与热水浸提相结合的方法，反应条件温和。效率高、杂质易除、工艺简便，但酶的价格较高，提取条件较苛刻。
目前公开号为CN105535033A的中国发明专利公开了一种从松露中提取松露多糖的方法，包括以下步骤，超声提取：黑松露干燥，粉碎筛分，水为提取溶剂，料液比1:40，提取温度为80℃，超声频率为100kHz，提取时间2h，提取后过滤，滤渣进行重复提取；精制处理：将提取液减压浓缩，加入无水乙醇液，摇匀，静置，分离沉淀物，沉淀物用丙酮洗涤后冷冻干燥，得白色粉末，并公开以松露多糖做成复方，在制备具有提高免疫力功效保健品中的应用。
公开号CN110256598A的中国发明专利公开了一种生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：粉碎，将香菇子实体干燥，粉碎后过筛网，得到香菇粉末；浸提，取香菇粉末加入水得到混合液，加热混合液在90-100℃浸提；过滤后得到第一浸提液，滤渣进行二次浸提，得到浸提滤液；浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，进行分级醇沉，得到多种不同组分含量的多糖沉淀；分别将多糖沉淀烘干，得到多种香菇多糖。本发明能够获得生物活性不同、多糖含量不同、分子量不同的香菇多糖，有利于香菇多糖的分类应用。
由于提取工艺和方法的不同，松露多糖的品质和活性也会出现一定的差异性，且提取出的松露多糖由于混合高活性和低活性成分而导致功能不均。本发明的目的是提供一种松露多糖的制备方法，松露经水提、分级醇沉得到抗氧化、抗炎、抗衰活性不同的多级松露多糖，应用于制备抗氧化、抗衰老的食品、保健品、药物、化妆品以及COX-2抑制剂、抗炎药物中；且不同级分的松露多糖其得率高，节约昂贵松露原料的使用量。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供了一种具有多功效的松露多糖的制备方法。松露经水提、分级醇沉得到抗氧化、抗炎活性不同的多种松露多糖，选择性利用不同级分松露多糖的功能，使其高效应用于制备抗氧化和抗衰老的食品、保健品、药物、化妆品及COX-2抑制剂、抗炎药物中。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
首先，本发明提供一种具有多功效的松露多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)水提：松露粉碎，浸提，过滤后浓缩，得到松露多糖浓缩液，干燥得松露多糖SLS；
(2)醇沉：将松露多糖浓缩液和醇类溶剂混合，醇沉，分离上清液，得到松露多糖SLC；
(3)复溶：松露多糖SLC用水复溶，分离不溶固体，得到上清液；
(4)分级醇沉：醇和上清液混合，调节混合液中醇类溶剂体积分数为8-12％进行醇沉，分离得到松露多糖SL1和上清液，上清液重复前述醇沉步骤，依次调节上清液中醇的体积分数为18-22％、28-32％、38-42％、48-52％、58-62％、68-72％、78-82％，相应得到松露多糖SL2、SL3、SL4、SL5、SL6、SL7、SL8；
(5)将步骤(4)中最后分离得到的上清液浓缩，干燥得到松露多糖SL9。
优选地，步骤(1)中，所述粉碎具体为：干燥的松露用粉碎机粉碎，过80-100目筛。
优选地，步骤(1)中，所述浸提具体为：取松露和水混合，用1-3％的氢氧化钠溶液和柠檬酸溶液调节pH，100℃下进行回流提取，冷却过滤。
进一步优选地，所述松露和水的料液比为1:10-1:30，更一步优选为1:30。
进一步优选地，所述pH为5-8，更进一步优选为7。
进一步优选地，所述提取时间为1.5-3.5h，更进一步优选为1.5h。
优选地，步骤(1)和(5)中，所述浓缩为旋蒸浓缩，至无固体析出。
优选地，步骤(2)中，所述松露多糖浓缩液与醇类溶剂的体积比为1:3-1:5，进一步优选为1:4。
进一步优选地，所述醇类溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇的至少一种。
更进一步优选地，所述醇类溶剂为乙醇。
优选地，步骤(2)-(4)中，所述分离的操作为离心，离心转速为4000-5000r/min，离心时间为15-20min。
优选地，步骤(2)和(4)中，所述静置醇沉具体为：在4-6℃的环境中静置10-12h，进一步优选为在4℃的环境中静置12h。
优选地，步骤(3)中，所述复溶松露水提醇沉物与水的固液比为1:8-1:15，进一步优选为1:10。
优选地，步骤(4)中，所述分级醇沉的醇类溶剂的体积分数为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％。
优选地，步骤(2)和(5)中，所述干燥方法包括但不限于常压干燥，真空干燥，冷冻干燥等，进一步优选为冷冻干燥。
再者，本发明提供按照上述方法制备得到的松露多糖SLS、SLC、SL1-SL9。
最后，本发明提供上述松露多糖SLS、SLC、SL1-SL9在制备抗氧化和抗衰老的食品、保健品、药物、化妆品及COX-2抑制剂、抗炎药物中的应用。
优选地，所述抗氧化食品、保健品、药物、化妆品的制备选用松露多糖SLS、SLC、SL4-SL5、SL7-SL9。
进一步优选为松露多糖SLS、SLC、SL8-SL9。
更进一步优选为松露多糖SLS、SL8、SL9。
更进一步优选为松露多糖SLS、SL9。
优选地，所述COX-2抑制剂、抗炎药物的制备，选用松露多糖SLS、SLC、SL4-SL5、SL8-SL9。
进一步优选为松露多糖SLC、SL5、SL9。
优选地，所述抗衰老食品、保健品、药物、化妆品的制备，选用松露多糖SLS、SLC、SL8。
进一步优选为松露多糖SLS、SL8。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明制备松露多糖的过程简单，未进行脱蛋白，洗涤，分离纯化等步骤，可以保证较高的多糖得率和含量。
2.松露经水提、分级醇沉得到的松露多糖，表现出不同的抗氧化、抗炎、抗衰老等生物活性。
3.利用不同生物活性的松露多糖制备抗氧化和抗衰老的食品、保健品、药物、化妆品及COX-2抑制剂、抗炎药物。
4.同一份松露多糖浓缩液经过分级醇沉，可以同时得到多种性能的多糖，简化生产工艺，提高多糖的提取率，节约珍贵松露原料的使用量。
5.目前还没有关于对松露进行分级醇沉提取多糖的研究，且提取出的各组分多糖其生物活性各不相同。
附图说明
图1是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL4-9的DPPH自由基抑制率图；
图2是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL4-9的ABTS自由基抑制率图；
图3是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL4-9的COX-2抑制率图；
图4是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL8的免疫印迹试验条带图；
图5是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL8的MMP-1相对含量图，图中，**表示与UVB相比，p<0.01；
图6是本发明实施例1-3制备得到的松露多糖样品SLS、SLC、SL8的COL-1相对含量图，图中，**表示与UVB相比，p<0.01。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
实施例1松露水提物的制备
称取5.0g松露，按照料液比1:30加入去离子水，调溶液pH至7.0，100℃加热回流提取1.5h，冷却沉淀，定性滤纸过滤，旋蒸浓缩，冷冻干燥得到松露水提物冻干粉(SLS)，837.23mg，得率为16.74％(得率％＝SLS的质量/松露质量)。
水提工艺的条件筛选：
提取时间：称取松露2g并粉碎，按料液比1:20加入去离子水。100℃加热回流，提取1.5、2.5、3.5h，回流结束后自然冷却至室温，抽滤后将溶液体积补至40mL。使用硫酸-苯酚法测定提取出的松露多糖浓度，如表1所示，提取时间为1.5h时提取液中松露多糖浓度最高。
表1
| 提取时间(h) | 1.5h | 2.5h | 3.5h |
| 提取液多糖浓度(mg/mL) | 1.12±0.03 | 1.09±0.02 | 1.10±0.02 |
提取料液比：称取松露2g并粉碎，按料液比1:10、1:20、1:30加入去离子水。100℃加热回流，提取2.5h，回流结束后自然冷却至室温，抽滤后将溶液体积分别补至20、40、60mL。使用硫酸-苯酚法测定提取出的松露多糖浓度，如表2所示，料液比为1:30时提取液中松露多糖浓度最高。
表2
| 料液比 | 1:10 | 1:20 | 1:30 |
| 提取液多糖浓度(mg/mL) | 1.84±0.04 | 0.98±0.01 | 1.34±0.03 |
提取pH：称取松露2g并粉碎，按料液比1:30加入去离子水，用2％氢氧化钠溶液和2％柠檬酸溶液调节其pH值为5.0、6.0、7.0、8.0。100℃加热回流提取1.5h，回流结束后自然冷却至室温，抽滤后将溶液体积补至60mL。使用硫酸-苯酚法测定提取出的松露多糖浓度，如表3所示，pH为7.0时提取液中松露多糖浓度最高。
表3
| 提取pH | pH＝5.0 | pH＝6.0 | pH＝7.0 | pH＝8.0 |
| 提取液多糖浓度(mg/mL) | 0.56±0.02 | 0.38±0.05 | 0.76±0.02 | 0.48±0.01 |
结合单因素实验结果，提取松露多糖的最佳工艺为提取时间1.5h，料液比1:30，提取pH7.0。
实施例2松露水提醇沉物的制备
称取20.0g松露，按照料液比1:30加入去离子水，调溶液pH至7.0，100℃加热回流提取1.5h，冷却沉淀，定性滤纸过滤，旋蒸浓缩至无固体析出，加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥得松露水提醇沉物(SLC)，SLC固体质量1.42g，得率为7.10％(得率％＝SLC固体质量/松露质量)。
实施例3松露分级醇沉物的制备
将SLC样品进行分级醇沉，得到SL0-9样品：
取1.0g松露水提醇沉物(SLC)加入10mL去离子水复溶，离心除去不溶固体(SL0)，向上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为10％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后得上清液和沉淀，将沉淀冷冻干燥得SL1；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为20％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL2；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为30％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL3；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为40％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL4；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为50％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL5；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为60％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL6；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为70％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL7；
继续向离心后上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为80％(v/v)，置于4℃冰箱中醇沉12h，离心后取沉淀，冷冻干燥，得SL8；
最后将上清液浓缩，蒸干得样品SL9。
得率％＝SLn质量/复溶的SLC的质量×100％，得率如表4所示：
表4
结果检测
1.抗氧化效果验证
1.1DPPH自由基抑制实验
测试方法：先配置DPPH乙醇溶液：称取20mgDPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，加入无水乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中，DPPH浓度为2×10-4mol/L，0-4℃下避光保存，现配现用，4h内有效。然后取松露多糖样品配制成浓度为3mg/ml，1mg/ml的待测溶液。阳性对照选用1mg/mL维生素C，0-4℃下避光保存，现配现用。再按表5加入各试剂。最后，避光反应30min，在517nm下测A、B、C管吸光度值。DPPH自由基抑制率计算公式：DPPH抑制率(％)＝(B+C-A)/B×100％。
表5
| 编号 | DPPH溶液 | 溶剂(无水乙醇) | 待测液 | 总体积 |
| A | 1mL | 0ml | 1mL | 2mL |
| B | 1mL | 1mL | 0ml | 2mL |
| C | 0ml | 1mL | 1ml | 2mL |
测试结果如图1所示。
从图1中可以看出，松露多糖浓度为3mg/ml时，对DPPH自由基的抑制率均高于浓度为1mg/ml时，表明在一定浓度范围内，高浓度的松露多糖对自由基的抑制率更强；SL8、SL9、SLC、SLS在浓度为3mg/mL时DPPH抑制率可达到80％以上，其中SLS的DPPH抑制率可达到90％以上。松露多糖各组分的抑制率各不相同：浓度为3mg/ml时，对DPPH自由基的抑制率SLS＞SL8＞SLC＞SL9＞SL7＞SL4＞SL5＞SL6。浓度为1mg/ml时，对DPPH自由基的抑制率SLS＞SL9＞SL5＞SL8＞SLC＞SL6＞SL7＞SL4。
1.2ABTS自由基抑制试验测试
测试方法：先配置ABTS水溶液，准确称取0.03841gABTS(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，溶解定容于10mL水中。然后配置K2S2O8水溶液，准确称取0.0662gK2S2O8溶解定容于100mL水中。然后配置母液，将ABTS水溶液和K2S2O8水溶液等体积混合，低温避光反应12-16h。然后配置ABTS工作液，将母液用无水乙醇稀释至在734nm处的OD值为0.90±0.02，现用现配。然后配置待测液：取松露样品配制成3mg/mL浓度的待测溶液。阳性对照选用1mg/mLVC，0-4℃下避光保存，现配现用。再按照表6加入各试剂。最后，室温条件下避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值。ABTS自由基抑制率计算公式：ABTS抑制率(％)＝(B+C-A)/B×100％。
表6
| 编号 | ABTS工作液 | 溶剂(无水乙醇) | 待测液 | 总体积 |
| A | 1.5mL | 0ml | 0.5mL | 2mL |
| B | 1.5mL | 0.5mL | 0ml | 2mL |
| C | 0ml | 1.5mL | 0.5mL | 2mL |
测试结果如图2所示。
从图2中可以看出，SLC、SLS、SL8、SL9在浓度为3mg/mL时，ABTS抑制率较高可达到85％以上。其中SLS、SL9可达到96％以上，具有明显的抗氧化性能。
2.抗炎效果测试：COX-2体外抑制实验
按照环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒说明操作，检测松露多糖样品在3mg/mL的浓度条件下对COX-2的抑制能力。
测试结果如图3所示。
从图3中可以看出，SLS、SLC、SL4、SL5、SL8、SL9在浓度为3mg/mL时，对COX-2抑制率可达到60％以上，对COX-2抑制率均较好，有良好的抗炎作用。
3.抗衰效果测试：COL-1、MMP-1免疫印迹试验(Western Blot)
3.1细胞培养
人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts，HSF)分组：UVB照射组，样品组；
细胞铺板：细胞计数,以2.0×105cells/孔的密度将细胞接种于6孔板中。置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；进行UVB照射，加样，在37℃，5％CO2条件中培养24h，将细胞收集起来。
3.2制备蛋白样品
(1)蛋白裂解液的制备
取适当量的总蛋白裂解液混匀，总蛋白裂解液与磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF三联按照体积比为100:1:1:1的比例配制裂解液。
(2)蛋白裂解及浓度测定
在收集的细胞中加入200μL预冷的配置好的蛋白裂解缓冲液。用移液枪吹打把细胞吹散，旋涡震荡5min以充分裂解细胞，以没有明显的沉淀作为充分裂解的标志。然后在4℃1000rcf的条件下，离心10min，取上清，便收获蛋白样品。根据BCA试剂盒的说明书，对提取的蛋白浓度进行测定。
3.3蛋白变性
以各蛋白样品上样量为35μg、上样体积30-40μL为准，根据各蛋白样品的浓度计算所需的体积。
按照蛋白样品：5×loading buffer体积比为4：1，冰上配制混合液。在100℃预热好的金属浴中预热5min，完成蛋白的变性处理。
3.4SDS-PAGE电泳分离
(1)制胶
按照试剂盒说明书制备电泳所用胶。
(2)上样及电泳
将预染蛋白分子量标准和一定量的蛋白样品加入对应的胶孔中。
连通电泳仪，在300V恒压条件下电泳17min，当溴酚蓝指示带电泳至胶板底部，或实验预定位置时，即可结束电泳。
3.5转膜及封闭
(1)根据伯乐转印试剂盒组装加厚滤纸-PVDF膜-胶条带-加厚滤纸，轻轻赶走气泡，在25mA恒流条件下转膜3min。
(2)使用TBST洗膜3次洗脱颜色，每次洗膜10min。配制5％的封闭液，封闭1h。封闭完成后，使用TBST进行3次洗膜，每次10min。
3.6一抗孵育
按照1：1000稀释一抗，β-actin、MMP-1及COL-1抗体用TBST溶液稀释，将封闭后的膜转移至塑料盒中，向其中加入稀释好的一抗溶液，在4℃冰箱中孵育12h，使用β-actin来作内参蛋白。
3.7二抗孵育
(1)完成孵育一抗后，使用TBST洗膜3次，每次10min。洗膜后，向其中加入用TBST溶液按照1：2000稀释的二抗，室温孵育1h即可。
(2)完成二抗孵育以后，使用TBST洗膜3次，每次10min。
3.8蛋白检测
制好ECL超敏显色工作液，滴加到膜上，避光反应2-3min，用凝胶显色仪曝光拍照。之后用Image J分析膜上条带浓度，以计算相对目标蛋白表达量。
3.9免疫印迹试验(Western Blot)结果
实验内参β-actin条带较为均一，结果有一定的参考价值(图4)。从条带及Image J灰度分析可以看出(图5，图6)，相比于UVB对照，UVB辐射后添加SLC及SLS，可以显著抑制MMP-1的分泌(p<0.01)；UVB辐射后添加SL8及SLS，可以显著促进COL-1分泌(p<0.01)。说明SLS和SL8具有抗衰老、除皱、紧致的功效。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种松露多糖SLC、SL1-SL9在制备COX-2抑制剂中的应用，其特征在于，所述应用中的松露多糖SLC、SL1-SL9通过以下步骤得到：
(1)水提：松露粉碎，浸提，过滤后浓缩，得到松露多糖浓缩液，干燥得松露多糖SLS；所述浸提的条件为：pH为7.0，提取温度100℃，提取时间为2.5h，松露和水的料液比为1:30；
(2)醇沉：将松露多糖浓缩液和醇类溶剂混合，醇沉，分离上清液，得到松露多糖SLC；
(3)复溶：松露多糖SLC用水复溶，分离不溶固体，得到上清液；
(4)分级醇沉：醇和上清液混合，调节混合液中醇类溶剂体积分数为10%进行醇沉，分离得到松露多糖SL1和上清液，上清液重复前述醇沉步骤，依次调节上清液中醇的体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，相应得到松露多糖SL2、SL3、SL4、SL5、SL6、SL7、SL8；
(5)将步骤(4)中最后分离得到的上清液浓缩，干燥得到松露多糖SL9。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中松露多糖浓缩液与醇类溶剂的体积比为1:3-1:5。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中的松露多糖为松露多糖SLC、SL4-SL5、SL8-SL9。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用中的松露多糖为松露多糖SLC、SL5、SL9。
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