CN117624328A - 一种高抗氧活性的羊胎盘多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高抗氧活性的羊胎盘多肽及其制备方法和应用。本发明首次以羊胎盘下脚料为原料，采用超声辅助酶解法经纯化鉴定后得到3种水溶性活性肽，均具备优越的DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率，且总抗氧化能力最高可达到0.63±0.02mmol/g。本发明的方法能够获得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化剂使用，毒副作用小。
Description
技术领域
本发明涉及羊胎盘多肽技术领域，更具体地，涉及一种高抗氧活性的羊胎盘多肽及其制备方法和应用。
背景技术
活性生物多肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收、分子量小等优点，同时具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等多种生物活性，不仅能够促进皮肤细胞的增殖，还可以为皮肤提供营养，延缓皮肤老化，促进皮肤创伤修复。其中，胎盘肽，又称为胎盘免疫活细胞素、胎盘免疫调节肽、胎盘转移因子、胎盘免疫调节因子，胎盘免疫调节肽是目前研究较深入的胎盘提取物，其成分和稳定性与提取时所采取的工艺有关。胎盘免疫调节肽属于小分子物质，是小分子量核苷酸以及肽类物质的混合物，分子量小于5000Da，含有多种氨基酸。周国华等报道，胎盘肽为无色或微黄透明液体，含有多种氨基酸，具有可透性，可超滤性，蛋白质反应阴性，无抗原性等多种特性，冻干品通常为白色疏松状粉末，且极易溶于水。
然而，目前关于羊胎盘多肽的制备与鉴定方面的研究工作很少，仅有少部分现有技术中公开了羊胎盘多肽的制备，但是未能实现鉴定具体哪些多肽具备高抗氧活性。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种高抗氧活性的羊胎盘多肽及其制备方法和应用。本发明首次以羊胎盘下脚料为原料，采用超声辅助酶解法经纯化鉴定后得到3种水溶性活性肽，均具备优越的DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率，且总抗氧化能力最高可达到0.63±0.02mmol/g。本发明的方法能够获得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化剂使用，毒副作用小。
具体而言，本发明首先是提供了一种高抗氧活性的羊胎盘多肽，其特征在于，所述肽的序列可选自活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种高抗氧活性的羊胎盘多肽，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)取羊胎盘的下脚料制备羊胎盘匀浆；
2)利用超声辅助酶解法羊胎盘匀浆；
3)对酶解液采用酿酒酵母发酵脱腥；
4)对脱腥后的酶解液采用超滤膜过滤；
5)对过滤液进行分离和鉴定，并获得高抗氧活性的水溶性多肽。
优选地，步骤1)包括：羊胎盘下脚料室温解冻，清水冲洗后用75％的乙醇浸泡约30-60min，剪碎，沥干水分，倒入破壁机中，加入2-5倍体积的生理盐水进行捣碎得到羊胎盘匀浆；
优选地，步骤2)包括：羊胎盘匀浆加入5-10‰质量比的木瓜蛋白酶，55-60℃后置于振荡培养箱并辅以超声辅助酶解6-8小时，10000rpm离心20-40min得到上清液；
优选地，步骤3)包括：向步骤2)中的羊胎盘酶解液加入5％质量比的酿酒酵母，28-35℃振荡培养箱培养；
优选地，步骤4)包括：对步骤3)发酵脱腥后的羊胎盘酶解液进行超滤膜过滤，截留分子量在4000-5500Da多肽分子；
优选地，步骤5)包括：将截留的多肽分子进行Obitrap Fusion Lumos质谱仪测序，经鉴定分析共计获得3种水溶性活性肽，序列依次为活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)。
本发明另一方面提供了一种高抗氧活性的羊胎盘多肽在制备药品、保健食品和食品的添加剂中的用途。
进一步地，本发明还提供了一种药品、保健食品或食品的添加剂，其特征在于，所述药品、保健食品或食品的添加剂包括可选自活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)中的一种或多种作为主要的活性成分。
优选地，所述活性肽的使用浓度为10-1000μg/mL。
优选地，所述活性肽可用于高效率清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和/或羟自由基。
本发明的优点如下：本发明首次以羊胎盘下脚料为原料，采用超声辅助酶解法制备得到高抗氧化活性的羊胎盘多肽，采用酿酒酵母对羊胎盘酶解液进行脱腥处理后，经超滤膜过滤，截留分子量在4000-5500Da多肽分子，共计获得3种水溶性活性肽。对所述活性多肽进行抗氧化活性测定分析，结果显示，3种水溶性活性肽具备优越的DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率，且总抗氧化能力最高可达到0.63±0.02mmol/g，远高于对比例的抗氧化效果。进一步证实经本发明所述方法能有效利用羊胎盘的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，通过本发明的方法能够获得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化剂使用，毒副作用小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种高抗氧活性的羊胎盘多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)羊胎盘下脚料的处理：羊胎盘下脚料室温解冻，清水冲洗后用75％的乙醇浸泡约30-60min，剪碎，沥干水分，倒入破壁机中，加入2-5倍体积的生理盐水进行捣碎得到羊胎盘匀浆；
2)超声辅助酶解法羊胎盘匀浆：羊胎盘匀浆加入5-10‰质量比的木瓜蛋白酶，55-60℃后置于振荡培养箱并辅以超声辅助酶解6-8小时，10000rpm离心20-40min得到上清液；
3)酿酒酵母发酵脱腥：向步骤2)中的羊胎盘酶解液加入5％质量比的酿酒酵母，28-35℃振荡培养箱培养；
4)对步骤3)发酵脱腥后的羊胎盘酶解液进行超滤膜过滤，截留分子量在4000-5500Da多肽分子；
5)将截留的多肽分子进行Obitrap Fusion Lumos质谱仪测序，经鉴定分析共计获得3种水溶性活性肽，序列依次为活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ IDNO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)。
对比例1
方法步骤同实施例1，区别在于省略步骤4)-5)。
对比例2
方法步骤同实施例1，区别在于截留分子量在2000-3500Da多肽分子。
实施例2
羊胎盘多肽抗氧化活性测定分析：
2.1DPPH自由基清除能力测定
根据DPPH自由基清除能力试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其A517nm吸光度，80％甲醇作空白对照，维生素C乙基醚作阳性对照。
DPPH自由基清除率(％)＝{1-(A测定-A对照)/A空白}×100％
2.2清除超氧阴离子自由基测试
根据抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其A550 nm吸光度，超纯水作空白对照，维生素C乙基醚作阳性对照。
清除率(％)＝{(A对照管-A测定管)/A对照管}×100％
2.3羟自由基清除实验
根据羟基自由基测定试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其A550 nm吸光度，超纯水作空白对照，维生素C乙基醚作阳性对照。
清除率(％)＝{(A对照-A测定)/A对照}×100％
2.4总抗氧化能力测试
根据总抗氧化能力测定试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其A593 nm吸光度，蒸馏水作空白对照，维生素C乙基醚作阳性对照。
总抗氧化能力(mmol/g)＝(3.654x-0.4109)×蛋白浓度(mg/mL)
式中x表示样品于酶标仪测得其A593 nm吸光度。
2.5统计分析
本文所有试验数据均为三次重复试验，试验结果以平均值加减标准差(x±S)来表示，采用软件SPSS22.0，采用LSD法对实验结果进行统计分析。
结果如下表所示：
本发明以羊胎盘下脚料为原料，采用超声辅助酶解法制备得到高抗氧化活性的羊胎盘多肽，采用酿酒酵母对羊胎盘酶解液进行脱腥处理后，经超滤膜过滤，截留分子量在4000-5500Da多肽分子，共计获得3种水溶性活性肽。对所述活性多肽进行抗氧化活性测定分析，结果显示，3种水溶性活性肽具备优越的DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率，且总抗氧化能力最高可达到0.63±0.02mmol/g，远高于对比例的抗氧化效果。进一步证实经本发明所述方法能有效利用羊胎盘的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，通过本发明的方法能够获得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化剂使用，毒副作用小。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高抗氧活性的羊胎盘多肽，其特征在于，所述肽的序列可选自活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)中的一种或多种。
2.权利要求1所述高抗氧活性的羊胎盘多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)取羊胎盘的下脚料制备羊胎盘匀浆；
2)利用超声辅助酶解法羊胎盘匀浆；
3)对酶解液采用酿酒酵母发酵脱腥；
4)对脱腥后的酶解液采用超滤膜过滤；
5)对过滤液进行分离和鉴定，并获得高抗氧活性的水溶性多肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：羊胎盘下脚料室温解冻，清水冲洗后用75％的乙醇浸泡约30-60min，剪碎，沥干水分，倒入破壁机中，加入2-5倍体积的生理盐水进行捣碎得到羊胎盘匀浆。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：羊胎盘匀浆加入5-10‰质量比的木瓜蛋白酶，55-60℃后置于振荡培养箱并辅以超声辅助酶解6-8小时，10000rpm离心20-40min得到上清液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：向步骤2)中的羊胎盘酶解液加入5％质量比的酿酒酵母，28-35℃振荡培养箱培养。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)包括：对步骤3)发酵脱腥后的羊胎盘酶解液进行超滤膜过滤，截留分子量在4000-5500Da多肽分子。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)包括：将截留的多肽分子进行ObitrapFusion Lumos质谱仪测序，经鉴定分析共计获得3种水溶性活性肽，序列依次为活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)。
8.权利要求1所述的高抗氧活性的羊胎盘多肽在制备药品、保健食品和食品的添加剂中的用途。
9.一种药品、保健食品或食品的添加剂，其特征在于，所述药品、保健食品或食品的添加剂包括可选自活性肽1：QHSEVHNGHCCHIWMFLFRHIGEEFRPPMI(SEQ ID NO.1)、活性肽2：LIEEVWRVNRCVDYEDQPCIKCMSIWDV(SEQ ID NO.2)和活性肽：AFSHWWLGSDMEMLHCCWYLIRVF(SEQ ID NO.3)中的一种或多种作为主要的活性成分。
10.如权利要求9所述的药品、保健食品或食品的添加剂，其特征在于，所述活性肽的使用浓度为10-1000μg/mL，所述活性肽可高效率清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和/或羟自由基。
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