CN116218940B - 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 - Google Patents

米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，针对现有米糠资源利用率低且抗氧化性效果不佳的现象，提供一种基于高峰α淀粉酶‑碱液‑胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉及其制备方法。本发明以米糠为原料经过脱脂处理后，采用高峰α淀粉酶‑碱法提取米糠蛋白质，之后用胃蛋白酶水解、离心、分离、冷冻干燥得到抗氧化肽复合粉。本发明制备方法简单、绿色环保、重现性好。本发明延长了稻米产业链，实现米糠辅料的高值化利用。复合粉可应用于食品、保健品、化妆品等领域，例如用于制备抗氧化产品、清除自由基产品、修复氧化损伤产品、延缓细胞衰老产品。

Description

米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用
本申请为申请号202111472065.2，申请日2021年12月06日，申请时发明名称为“一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物制品领域，尤其涉及1.米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用。
背景技术
米糠是稻谷脱壳后精碾稻米时产生的副产物，营养丰富。一般组成为：水分7％-14％、纤维33％-53％、淀粉20％-30％、蛋白质12％-16％。米糠蛋白是一种优质植物蛋白，具有氨基酸配比合理、低致敏性等特点。而目前我国对于米糠的利用率极低，除极少部分用于提取米糠油原料外，多数作为饲料和废弃物舍弃，因而大量的米糠蛋白未得到充分利用，造成巨大的资源浪费。如今，随着水稻种植及生产技术的快速发展和日趋成熟，米糠副产物的综合利用已成为亟待解决的问题。
自由基理论的提出，引领研究者不断探寻抗氧化、抗衰老的物质。目前的抗氧化物质以化学抗氧化剂为主，效果显著但其毒副作用导致使用受到限制。而低毒性、高活性的天然来源抗氧化剂越来越受到人们的青睐，其中抗氧化肽因其易吸收等特点成为研究的热点。相关研究表明肽中疏水性及芳香族氨基酸残基数量与抗氧化性强弱成正相关。而在酶解制备肽之前，蛋白质多以天然状态存在，疏水性基团位于蛋白质分子内部，致使形成的抗氧化肽疏水性、芳香族氨基酸残基较少，抗氧化效果不佳。为了提高产品的抗氧化性，研究者通过物理方法辅助蛋白质构象改变，促进疏水性基团的暴露进而提高产品抗氧化性。米糠原料中淀粉包裹于蛋白外围，阻碍米糠中蛋白质的制备，单一的物理辅助无法破坏蛋白质与淀粉之间的作用力。而除淀粉杂质与蛋白质解折叠的分步操作过于繁琐且蛋白损失严重，抗氧化效果不佳。因此，提供一种操作方便且高效的米糠抗氧化肽制备方法迫在眉睫。
高峰α-淀粉酶是由微生物米曲酶发酵生产的一种耐酸性淀粉酶，他的作用温度在90℃以上，目前主要用于退浆，酶法生产葡萄糖及发酵工业。未有报道将高峰α-淀粉酶用于米糠抗氧化肽的制备。
发明内容
鉴于现有技术所存在的稻米产业副产物-米糠资源利用率低且抗氧化效果不佳的问题，本发明提供米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，基于高峰α-淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理来制备米糠抗氧化肽复合物，具有提高米糠利用率、抗氧化效果好等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，包括以下步骤：将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白；将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解。
采取上述技术方案的有益效果：
米糠产量高但低利用率是目前稻米产业亟待解决的问题，本发明制备、分离得到米糠蛋白抗氧化肽复合物，可以提高米糠产品附加值，实现米糠资源高值利用，减少环境污染，延长稻米产业链。本发明制备方法具有简便、快捷、重现性好、米糠利用率高、抗氧化效果好等优点。
在制备过程中，本发明使用高峰α淀粉酶处理米糠，在去除米糠中淀粉杂质的同时，通过高温作用条件促使蛋白质结构改变，暴露疏水性区域，为后期抗氧化肽的制备奠定基础，本发明采用具有专一性切割疏水性-芳香族氨基酸间肽键的胃蛋白酶切割蛋白质制备抗氧化肽，增加疏水性、芳香族氨基酸残基数量，进一步提高产物抗氧化性，实现高抗氧化活性生物肽的制备。
进一步，将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白，包括以下步骤：将脱脂米糠粉溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即冷却至室温，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀，得到上清液；上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，得到沉淀即为米糠蛋白。
采取上述技术方案的有益效果：米糠蛋白采用高峰α-淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，使用高峰α-淀粉酶-碱法在酶最适反应温度90℃下处理样品提取米糠中蛋白质，一方面可以去除米糠粉中淀粉杂质。另外，高温环境可以促使蛋白质解折叠，暴露内部的疏水性氨基酸。调节pH至5.0有利于蛋白质的沉淀，提高蛋白质提取率。
进一步，将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，包括以下步骤：将米糠蛋白配置浓度为5％的米糠蛋白质溶液；酶解条件为：采用胃蛋白酶，酶解时间为3h，酶解温度为37℃，酶解pH为1.5，沸水浴灭活时间为10mi n；将酶解液10000r/mi n离心或过滤，取上清为米糠抗氧化肽复合物酶解液。
采取上述技术方案的有益效果：采用胃蛋白酶酶解，胃蛋白酶具有专一性作用位点，专一性切割疏水性与芳香族氨基酸之间的肽键(酶切位点)，可以提高米糠抗氧化肽复合粉中疏水性、芳香族氨基酸残基数量，进而提高米糠抗氧化肽复合粉的抗氧化性。
进一步，在将米糠蛋白粉用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离的步骤；或在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将米糠抗氧化肽复合物酶解液冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物，使用时再将米糠抗氧化肽复合物复溶于水后进行超滤分离的步骤。
进一步，超滤分离的方法包括以下步骤：将米糠抗氧化肽复合物复溶于超纯水，依次经过截留分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，收集洗脱组分，冷冻干燥。
采取上述技术方案的有益效果：不同分子量的组分作用效果也有差异，发明人在进一步研究中发现，分子量小于3kDa，更易被机体吸收，清除DPPH自由基、羟基(OH-)自由基、延缓衰老、修复损伤、抗氧化的效果更好。
进一步，脱脂米糠的制备方法包括以下步骤：将粉碎、过筛的米糠加入4倍体积的正己烷，恒温震荡；真空抽滤，收集残渣，重复脱脂，得到脱脂米糠。
本发明提供一种米糠抗氧化肽复合物，抗氧化肽复合物可以采用上述方法制备。优选地，米糠抗氧化肽复合物的分子量小于3kDa。
采取上述技术方案的有益效果：
本发明提供的米糠抗氧化肽复合粉对人体结肠癌细胞(Caco-2)没有毒害作用，对过氧化氢诱导的氧化损伤具有修复功能。米糠抗氧化肽复合物具有延缓衰老的作用。
所述的米糠抗氧化肽复合物分子量小于3kDa，更易被机体吸收，作用于相关作用位点。能有效的清除DPPH自由基、羟基(OH-)自由基。IC50值分别为4.585、1.283，优于对比例1和对比例2。
本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在修复氧化损伤中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在延缓细胞衰老中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在清除自由基中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在制备抗氧化食品、保健品或者化妆品中的应用。
上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物可以用于制备修复氧化损伤、延缓细胞衰老、清除自由基和/或抗氧化的产品中进行应用。
上述米糠抗氧化肽复合物可以是粉状的，例如抗氧化肽复合粉，也可以是其他状态的，例如米糠抗氧化肽复合液等等。
采取上述技术方案的有益效果：
本发明分离得到的米糠抗氧化肽复合物能有效的清除DPPH、羟自由基(OH-)中的一种或多种。清除能力I C50值分别为4.585、1.283，显著优于对比例1和对比例2的I C50值，本发明制备的米糠抗氧化肽复合物还能有效的修复氧化损伤和延缓细胞衰老(对过氧化氢诱导的细胞氧化损伤具有显著修复作用)，对细胞无毒性，具有较高的应用开发价值，可作为功能性成分应用于食品、保健品、化妆品等领域。
附图说明
图1为米糠蛋白表面疏水性测定结果。横坐标为不同提取方法制备的米糠蛋白，纵坐标为表面疏水性；图中，1表示使用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品，2表示使用淀粉酶-碱法提取的蛋白样品，3表示使用碱法提取的蛋白样品。
图2为米糠抗氧化肽复合物酶解液电泳图；泳道1为超低分子量Marker，泳道2为对比例2酶解液、泳道3为对比例1酶解液，泳道4为实施例1酶解液，泳道5为米糠蛋白。
图3为经过不同超滤分离纯化后各组分的抗氧化活性测定结果；横坐标分别为分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa，纵坐标为各组分对DPPH自由基清除率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品。
图4为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞增殖活性影响。横坐标为米糠抗氧化肽复合粉浓度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL)，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品。
图5为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对200μmo l/L过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞的修复作用；横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，4表示谷胱甘肽。
图6为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞衰老延缓作用。横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，4表示谷胱甘肽。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)粉碎、过筛的米糠进行脱脂处理，得到脱脂米糠；
(2)采用高峰α淀粉酶-碱法处理步骤(1)中的米糠，取沉淀干燥，得到米糠蛋白粉；
(3)采用胃蛋白酶酶解步骤(2)所得粉末的溶解液，过滤或者离心得到米糠抗氧化肽复合物酶解液；
(4)将步骤(3)获得的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离，截留＜3kDa的分子量，冷冻干燥得到米糠抗氧化肽复合粉。
具体的，米糠抗氧化肽复合粉的制备方法，可以包括以下步骤：
(1)制备脱脂米糠：称取米糠粉加入4倍体积的正己烷，置于摇床上水浴恒温振荡。真空抽滤，收集残渣再重复进行脱脂，共3次，最后于通风橱过夜，得到脱脂米糠粉，4℃保存备用；
(2)提取米糠蛋白：
采用高峰α淀粉酶处理，包括以下步骤：准确称量脱脂米糠粉，溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后，立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液，取沉淀备用；
采用碱溶酸沉法提取，包括以下步骤：沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，磁力搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀即为米糠蛋白；
(3)制备米糠抗氧化肽复合物：称取步骤(2)中的米糠蛋白，配置浓度为5％的蛋白质溶液。酶解条件为：蛋白酶为胃蛋白酶、酶解时间为3h、酶解温度为37℃、酶解pH为1.5、沸水浴灭活时间为10mi n。酶解液10000r/mi n离心，上清液为米糠抗氧化肽复合物酶解液，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物；
(4)分离米糠抗氧化肽：采用的分离方法为超滤。将米糠抗氧化肽复合物复溶于超纯水，依次经过截留分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，分别测定分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa水解物各个组分的DPPH自由基清除能力，收集抗氧化性最强的洗脱组分，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合粉。
本发明针对现有米糠资源利用率低且抗氧化性效果不佳的现象，提供一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉及其制备方法。本发明以米糠为原料经过脱脂处理后，采用高峰α淀粉酶-碱法提取米糠蛋白质，之后用胃蛋白酶水解、离心、分离、冷冻干燥得到抗氧化肽复合粉。本发明制备方法简单、绿色环保、重现性好。所述米糠抗氧化肽复合粉中米糠蛋白质利用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取。高峰α淀粉酶可以去除米糠中淀粉杂质，此外热处理可以促使米糠蛋白解折叠、内部疏水区域暴露。所述米糠蛋白抗氧化肽复合粉中米糠肽的制备使用胃蛋白酶，专一性切割疏水性氨基酸与芳香族氨基酸间的肽键，增加疏水性氨基酸、芳香族氨基酸残基数量以提高抗氧化性。所述米糠蛋白抗氧化肽复合粉的分子量＜3kDa。所述米糠抗氧化肽复合粉能够有效清除DPPH、羟基(OH-)自由基，清除能力优于对比例1、对比例2；所述米糠抗氧化肽复合物对Caco-2细胞没有毒害作用。对过氧化氢诱导的Caco-2氧化损伤细胞具有修复功能。对于Caco-2细胞衰老具有延缓作用。
本发明延长了稻米产业链，实现米糠辅料的高值化利用。同时，提供了一种高效、便捷的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，复合粉可应用于食品、保健品、化妆品等领域，例如用于制备抗氧化产品、清除自由基产品、修复氧化损伤产品、延缓细胞衰老产品。
下面通过具体实施例来进行介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1
一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脱脂米糠，包括以下步骤：
称取米糠粉加入4倍体积的正己烷，置于摇床上水浴恒温振荡。真空抽滤，收集残渣再重复进行脱脂，共3次，最后于通风橱过夜，得到脱脂米糠粉，4℃保存备用；
(2)提取米糠蛋白，包括以下步骤：
将脱脂米糠粉与去离子水以1:4料液比进行混合，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，磁力搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀冷冻干燥即为米糠蛋白。
(3)制备米糠抗氧化肽复合物，包括以下步骤：
将冻干后的米糠蛋白分别配置为5％的蛋白质溶液。加入蛋白酶为胃蛋白酶，37℃、pH＝1.5条件下酶解3h后沸水浴灭酶10mi n，10000r/mi n离心，上清液为米糠抗氧化肽复合物酶解液，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合粉。
(4)分离米糠抗氧化肽，包括以下步骤：
将步骤(3)得到的米糠抗氧化肽复合粉复溶于超纯水中，依次经过分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，分别得到分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa的组分，测定不同组分的DPPH自由基清除能力。
对比例1
在实施例1的基础上，对比例1在步骤(2)提取米糠蛋白时，使用淀粉酶替换实施例1中的高峰α淀粉酶。
对比例1中具体操作为，调节pH为6.2，加入淀粉酶于55℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液。其余步骤均与实施例1相同。
对比例2
在实施例1的基础上，对比例2在步骤(2)提取米糠蛋白时取消高峰α淀粉酶预处理，直接使用碱溶法提取米糠蛋白。
对比例2中具体操作为：将脱脂米糠粉与去离子水以1:4料液比进行混合溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mol/L HC l调节pH，磁力搅拌30mi n，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀冷冻干燥，即为米糠蛋白。其余步骤均与实施例1相同。
实施例以及对比例实验效果的验证
一、测定实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠蛋白的纯度、提取率及表面疏水性
测定对实施例1、对比例1、对比例2的各实施例中的步骤(2)制备米糠蛋白的纯度、提取率及表面疏水性，结果见表1和图1。
表1纯度、提取率的检测结果
纯度、提取率的检测结果如表1所示，从表1可以看出，采用本发明实施例1的方法制备的米糠蛋白纯度更好，虽然提取率略低于单一碱法提取但无显著差异。
表面疏水性的检测结果如图1所示，横坐标为不同提取方法制备的米糠蛋白，纵坐标为表面疏水性；图中，1表示使用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品(即实施例1制备的米糠蛋白)，2表示使用淀粉酶-碱法提取的蛋白样品(即对比例1制备的米糠蛋白)，3表示使用碱法提取的蛋白样品(即对比例2制备的米糠蛋白)。从图1可以看出采用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品表面疏水性优于其他方法制备的蛋白样品表面疏水性。
二、检测蛋白质是否被酶解为肽
将各实施例及对比例(实施例1、对比例1、对比例2)的步骤(3)制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行电泳检测。
图2为米糠抗氧化肽复合物酶解液电泳图；泳道1为超低分子量Marker，泳道2为对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液、泳道3为对比例1制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，泳道4为实施例1的步骤(3)制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，泳道5为米糠蛋白由采用常规方法(碱溶酸沉方法)提取的蛋白质(即对比例2提取的米糠蛋白)。
从图2可以看出，米糠蛋白(泳道5)在14.4kDa处有明显条带，泳道3和泳道4经过蛋白酶酶解后条带消失，表明蛋白酶将米糠蛋白酶解为肽且所得米糠肽分子量小于3.3kDa。泳道2表示的是对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，蛋白质在14.4KDa处有明显条带，该方法使用碱溶酸沉法提取蛋白质，蛋白质结构为天然的球状，疏水基团位于分子内部；酶解后14.4KDa处条带依然存在，主要是由于胃蛋白酶酶切位点相较于实施例1和对比例1较少，蛋白质与底物接触不充分，进而说明酶解后生成的肽数量少，14.4KDa亚基未被充分酶解，因此依然存在条带。
三、检测各实施例1、对比例1、对比例2分离的米糠抗氧化肽各组分的自由基清除能力
对实施例1、对比例1、对比例2的各实施例中的步骤(4)经超滤分离的米糠抗氧化肽各组分(分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa)检测DPPH自由基清除能力。
图3为米糠抗氧化肽复合物溶于水后依次经过分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级得到的各组分的抗氧化活性测定结果；横坐标分别为分子量＜3kDa、3-10kDa和＞10kDa的各组分，纵坐标为各组分对DPPH自由基清除率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品，即实施例1步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品，即对比例1步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分。
结果如图3所示，分子量＜3kDa组分相对其他分子量的组分具有较高的自由基清除能力。在分子量＜3kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分；在分子量3-10kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分；在分子量＞10kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分。
四、检测米糠抗氧化肽复合物的化学抗氧化活性
因确定了超滤后分子量＜3KDa组分抗氧化性最强，后面的所有操作中，米糠抗氧化肽复合粉均指的是分子量＜3KDa组分。
对实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物分子量＜3kDa组分的化学抗氧化活性研究
4.1对DPPH自由基清除能力
取1mL不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉溶液与1mL 0.1mmo l/L的DPPH溶液混合均匀，反应30mi n，在517nm处测其吸光值为A样品；另取1mL米糠抗氧化肽复合粉溶液于试管中，分别加入无水乙醇1mL，反应30mi n，在517nm处测其吸光值记为A对照；以1mL 0.1mmo l/LDPPH和1mL无水乙醇反应液做为空白对照，其吸光值记为A空白按照下式计算米糠蛋白水解物对DPPH自由基的清除率及I C50值：
4.2对OH-清除能力
取0.5mL米糠抗氧化肽复合粉溶液，依次加入0.5mL 1.8mmo l/L的FeSO4、0.5mL1.8mmo l/L的H2O2，混匀后静置10mi n，再加入0.5mL 1.8mmo l/L水杨酸，混匀，静置30min，于510nm处测其吸光值记为A样品，当用蒸馏水代替水杨酸时测得的吸光值记为A对照。空白对照组以蒸馏水代替米糠蛋白水解物测得的吸光值记为A空白。按照下式计算大米蛋白水解物对羟自由基·OH的清除率及I C50值：
对系列浓度的DPPH及OH-清除率进行测定后，使用SPSS进行拟合分析，得到I C50。
自由基清除能力检测结果如表2所示，相比对比例1和对比例2，本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合物具有较强的DPPH及OH-清除能力(表2中，以I C50值体现，I C50值越低表示抗氧化性强自由基清除能力强，因I C50值相对单一浓度下清除率值更为准确，所以此处提供的是I C50)。
表2自由基清除能力检测结果
样品 DPPH自由基清除能力 .OH自由基清除能力
高峰α淀粉酶-碱法 4.585 1.283
淀粉酶-碱法 6.062 3.565
碱法 8.793 7.058
五、对实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉分子量＜3KDa组分的细胞抗氧化活性研究
因确定了超滤后分子量＜3KDa组分抗氧化性最强，后面的所有操作中，米糠抗氧化肽复合粉均指的是分子量＜3KDa组分。
5.1米糠抗氧化复合物对Caco-2细胞的影响
取处于对数期的Caco-2细胞，按照2×103/孔接种于96孔板中。设置不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL，使用不含血清的培养金配置)孵育24h。24h后吸出样品加入100μL含10％ CCK-8的基础培养基，37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后检测450nm波长下各组OD值。
图4为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞增殖活性影响。横坐标为米糠抗氧化肽复合粉浓度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL)，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品，即本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉。
结果如图4所示，低浓度下，相同处理组不同浓度间无显著性差异。不同处理组之间，实施例1处理细胞后，细胞增值率显著优于对比例1处理组、对比例2处理组。说明本发明制备物对Caco-2细胞没有毒害作用。
未处理的样品(对照)自动设定为100，各处理组(实施例1、对比例1、对比例2)是相对值。低浓度下，样品中的肽含量较少，随着处理时间的延长，细胞增殖率会下降。随着浓度的上升，抗氧化肽浓度增大，会减少H2O2对细胞的损伤，因而细胞增值率上升。浓度过大时，细胞外侧形成高渗透压，会导致水分流失，因而细胞增值率下降。
5.2米糠抗氧化复合物对过氧化氢诱导的Caco-2细胞修复影响
按照2×103/孔的细胞数将Caco-2细胞铺板于96孔板中，培养24h待其贴壁完全后，使用含有200μM的H2O2培养基(不含胎牛血清)处理细胞1h，构造衰老模型。空白对照组加入不含血清的基础培养基处理1h。然后吸取并弃去培养基，实验组分别加入含有不同浓度样品的培养基(不含胎牛血清)，空白组和模型组各加入不含胎牛血清的基础培养基继续培养24h后，以CCK-8法评估细胞增殖率变化。
图5为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对200μmo l/L过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞的修复作用；横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉；4表示谷胱甘肽。
结果如图5所示，不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.05、0.25、1mg/mL)对过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞呈现出一定的修复作用。且随着浓度的升高，细胞增殖率上升。相对对比例1、对比例2，采用本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉细胞增殖率更高，说明细胞修复的效果更好。
5.3米糠抗氧化复合物对Caco-2细胞衰老作用
按照2×103/孔的细胞数将Caco-2细胞铺板于96孔板中，培养24h待其贴壁完全后。分别加入含有不同浓度米糠抗氧化复合粉的DMEM培养基孵育24h。模型组和对照组分别加入等量的DMEM培养基(不含胎牛血清)进行孵育。弃去培养基向实验组和模型组加入200μM的H2O2培养基(不含胎牛血清)，空白组加入DMEM培养基继续孵育1h后利用CCK-8法测定细胞增殖率。
图6为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞衰老延缓作用。横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉；4表示谷胱甘肽。
结果如图6所示，可知不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.05、0.25、1mg/mL)对Caco-2细胞的衰老呈现出一定的延缓作用。且随着浓度的升高，细胞增殖率上升。相对对比例1、对比例2，采用本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉细胞增殖率更高，说明延缓衰老的效果更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.米糠抗氧化肽复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白；将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物，米糠抗氧化肽复合物的分子量小于3 kDa；
将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白，包括以下步骤：将脱脂米糠粉溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15 min，沸水浴加热10 min灭酶后立即冷却至室温，4000 r/min离心15 min，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下搅拌浸提120 min后，4000 r/min 离心15 min，除去沉淀，得到上清液；上清液用1 mol/L HCl调节pH，搅拌30 min，静置沉淀12 h后，4000 r/min 离心15 min，得到沉淀即为米糠蛋白；
将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，包括以下步骤：将米糠蛋白配置浓度为5%的米糠蛋白质溶液；酶解条件为：采用胃蛋白酶，酶解时间为3 h，酶解温度为37℃，酶解pH 为1.5，沸水浴灭活时间为10 min；将酶解液10000 r/min 离心或过滤，取上清得到米糠抗氧化肽复合物酶解液；
在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离的步骤；或在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物，使用时再将米糠抗氧化肽复合物复溶于水后进行超滤分离的步骤；
脱脂米糠的制备方法包括以下步骤：将粉碎、过筛的米糠加入4倍体积的正己烷，恒温震荡；真空抽滤，收集残渣，重复脱脂，得到脱脂米糠。
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