CN116218940A - 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 - Google Patents
米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116218940A CN116218940A CN202310436117.3A CN202310436117A CN116218940A CN 116218940 A CN116218940 A CN 116218940A CN 202310436117 A CN202310436117 A CN 202310436117A CN 116218940 A CN116218940 A CN 116218940A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rice bran
- antioxidant peptide
- protein
- peptide complex
- enzymolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 228
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 228
- 101800000068 Antioxidant peptide Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 227
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 49
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 18
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract description 46
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 abstract description 9
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 64
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 15
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 14
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 14
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 8
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 7
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 7
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 7
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 3
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019774 Rice Bran oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000008165 rice bran oil Substances 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009990 desizing Methods 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000550 effect on aging Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/645—Proteins of vegetable origin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
- Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Birds (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明涉及米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，针对现有米糠资源利用率低且抗氧化性效果不佳的现象，提供一种基于高峰α淀粉酶‑碱液‑胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉及其制备方法。本发明以米糠为原料经过脱脂处理后，采用高峰α淀粉酶‑碱法提取米糠蛋白质，之后用胃蛋白酶水解、离心、分离、冷冻干燥得到抗氧化肽复合粉。本发明制备方法简单、绿色环保、重现性好。本发明延长了稻米产业链，实现米糠辅料的高值化利用。复合粉可应用于食品、保健品、化妆品等领域，例如用于制备抗氧化产品、清除自由基产品、修复氧化损伤产品、延缓细胞衰老产品。
Description
本申请为申请号202111472065.2，申请日2021年12月06日，申请时发明名称为“一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物制品领域，尤其涉及1.米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用。
背景技术
米糠是稻谷脱壳后精碾稻米时产生的副产物，营养丰富。一般组成为：水分7％-14％、纤维33％-53％、淀粉20％-30％、蛋白质12％-16％。米糠蛋白是一种优质植物蛋白，具有氨基酸配比合理、低致敏性等特点。而目前我国对于米糠的利用率极低，除极少部分用于提取米糠油原料外，多数作为饲料和废弃物舍弃，因而大量的米糠蛋白未得到充分利用，造成巨大的资源浪费。如今，随着水稻种植及生产技术的快速发展和日趋成熟，米糠副产物的综合利用已成为亟待解决的问题。
自由基理论的提出，引领研究者不断探寻抗氧化、抗衰老的物质。目前的抗氧化物质以化学抗氧化剂为主，效果显著但其毒副作用导致使用受到限制。而低毒性、高活性的天然来源抗氧化剂越来越受到人们的青睐，其中抗氧化肽因其易吸收等特点成为研究的热点。相关研究表明肽中疏水性及芳香族氨基酸残基数量与抗氧化性强弱成正相关。而在酶解制备肽之前，蛋白质多以天然状态存在，疏水性基团位于蛋白质分子内部，致使形成的抗氧化肽疏水性、芳香族氨基酸残基较少，抗氧化效果不佳。为了提高产品的抗氧化性，研究者通过物理方法辅助蛋白质构象改变，促进疏水性基团的暴露进而提高产品抗氧化性。米糠原料中淀粉包裹于蛋白外围，阻碍米糠中蛋白质的制备，单一的物理辅助无法破坏蛋白质与淀粉之间的作用力。而除淀粉杂质与蛋白质解折叠的分步操作过于繁琐且蛋白损失严重，抗氧化效果不佳。因此，提供一种操作方便且高效的米糠抗氧化肽制备方法迫在眉睫。
高峰α-淀粉酶是由微生物米曲酶发酵生产的一种耐酸性淀粉酶，他的作用温度在90℃以上，目前主要用于退浆，酶法生产葡萄糖及发酵工业。未有报道将高峰α-淀粉酶用于米糠抗氧化肽的制备。
发明内容
鉴于现有技术所存在的稻米产业副产物-米糠资源利用率低且抗氧化效果不佳的问题，本发明提供米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，基于高峰α-淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理来制备米糠抗氧化肽复合物，具有提高米糠利用率、抗氧化效果好等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用，包括以下步骤：将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白；将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解。
采取上述技术方案的有益效果：
米糠产量高但低利用率是目前稻米产业亟待解决的问题，本发明制备、分离得到米糠蛋白抗氧化肽复合物，可以提高米糠产品附加值，实现米糠资源高值利用，减少环境污染，延长稻米产业链。本发明制备方法具有简便、快捷、重现性好、米糠利用率高、抗氧化效果好等优点。
在制备过程中，本发明使用高峰α淀粉酶处理米糠，在去除米糠中淀粉杂质的同时，通过高温作用条件促使蛋白质结构改变，暴露疏水性区域，为后期抗氧化肽的制备奠定基础，本发明采用具有专一性切割疏水性-芳香族氨基酸间肽键的胃蛋白酶切割蛋白质制备抗氧化肽，增加疏水性、芳香族氨基酸残基数量，进一步提高产物抗氧化性，实现高抗氧化活性生物肽的制备。
进一步，将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白，包括以下步骤：将脱脂米糠粉溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即冷却至室温，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀，得到上清液；上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，得到沉淀即为米糠蛋白。
采取上述技术方案的有益效果：米糠蛋白采用高峰α-淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，使用高峰α-淀粉酶-碱法在酶最适反应温度90℃下处理样品提取米糠中蛋白质，一方面可以去除米糠粉中淀粉杂质。另外，高温环境可以促使蛋白质解折叠，暴露内部的疏水性氨基酸。调节pH至5.0有利于蛋白质的沉淀，提高蛋白质提取率。
进一步，将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，包括以下步骤：将米糠蛋白配置浓度为5％的米糠蛋白质溶液；酶解条件为：采用胃蛋白酶，酶解时间为3h，酶解温度为37℃，酶解pH为1.5，沸水浴灭活时间为10mi n；将酶解液10000r/mi n离心或过滤，取上清为米糠抗氧化肽复合物酶解液。
采取上述技术方案的有益效果：采用胃蛋白酶酶解，胃蛋白酶具有专一性作用位点，专一性切割疏水性与芳香族氨基酸之间的肽键(酶切位点)，可以提高米糠抗氧化肽复合粉中疏水性、芳香族氨基酸残基数量，进而提高米糠抗氧化肽复合粉的抗氧化性。
进一步，在将米糠蛋白粉用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离的步骤；或在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将米糠抗氧化肽复合物酶解液冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物，使用时再将米糠抗氧化肽复合物复溶于水后进行超滤分离的步骤。
进一步，超滤分离的方法包括以下步骤：将米糠抗氧化肽复合物复溶于超纯水，依次经过截留分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，收集洗脱组分，冷冻干燥。
采取上述技术方案的有益效果：不同分子量的组分作用效果也有差异，发明人在进一步研究中发现，分子量小于3kDa，更易被机体吸收，清除DPPH自由基、羟基(OH-)自由基、延缓衰老、修复损伤、抗氧化的效果更好。
进一步，脱脂米糠的制备方法包括以下步骤：将粉碎、过筛的米糠加入4倍体积的正己烷，恒温震荡；真空抽滤，收集残渣，重复脱脂，得到脱脂米糠。
本发明提供一种米糠抗氧化肽复合物，抗氧化肽复合物可以采用上述方法制备。优选地，米糠抗氧化肽复合物的分子量小于3kDa。
采取上述技术方案的有益效果：
本发明提供的米糠抗氧化肽复合粉对人体结肠癌细胞(Caco-2)没有毒害作用，对过氧化氢诱导的氧化损伤具有修复功能。米糠抗氧化肽复合物具有延缓衰老的作用。
所述的米糠抗氧化肽复合物分子量小于3kDa，更易被机体吸收，作用于相关作用位点。能有效的清除DPPH自由基、羟基(OH-)自由基。IC50值分别为4.585、1.283，优于对比例1和对比例2。
本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在修复氧化损伤中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在延缓细胞衰老中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在清除自由基中的应用。本发明提供上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物在制备抗氧化食品、保健品或者化妆品中的应用。
上述方法制备的米糠抗氧化肽复合物可以用于制备修复氧化损伤、延缓细胞衰老、清除自由基和/或抗氧化的产品中进行应用。
上述米糠抗氧化肽复合物可以是粉状的，例如抗氧化肽复合粉，也可以是其他状态的，例如米糠抗氧化肽复合液等等。
采取上述技术方案的有益效果：
本发明分离得到的米糠抗氧化肽复合物能有效的清除DPPH、羟自由基(OH-)中的一种或多种。清除能力I C50值分别为4.585、1.283，显著优于对比例1和对比例2的I C50值，本发明制备的米糠抗氧化肽复合物还能有效的修复氧化损伤和延缓细胞衰老(对过氧化氢诱导的细胞氧化损伤具有显著修复作用)，对细胞无毒性，具有较高的应用开发价值，可作为功能性成分应用于食品、保健品、化妆品等领域。
附图说明
图1为米糠蛋白表面疏水性测定结果。横坐标为不同提取方法制备的米糠蛋白，纵坐标为表面疏水性；图中，1表示使用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品，2表示使用淀粉酶-碱法提取的蛋白样品，3表示使用碱法提取的蛋白样品。
图2为米糠抗氧化肽复合物酶解液电泳图；泳道1为超低分子量Marker，泳道2为对比例2酶解液、泳道3为对比例1酶解液，泳道4为实施例1酶解液，泳道5为米糠蛋白。
图3为经过不同超滤分离纯化后各组分的抗氧化活性测定结果；横坐标分别为分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa，纵坐标为各组分对DPPH自由基清除率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品。
图4为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞增殖活性影响。横坐标为米糠抗氧化肽复合粉浓度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL)，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品。
图5为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对200μmo l/L过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞的修复作用；横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，4表示谷胱甘肽。
图6为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞衰老延缓作用。横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，4表示谷胱甘肽。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)粉碎、过筛的米糠进行脱脂处理，得到脱脂米糠；
(2)采用高峰α淀粉酶-碱法处理步骤(1)中的米糠，取沉淀干燥，得到米糠蛋白粉；
(3)采用胃蛋白酶酶解步骤(2)所得粉末的溶解液，过滤或者离心得到米糠抗氧化肽复合物酶解液；
(4)将步骤(3)获得的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离，截留＜3kDa的分子量，冷冻干燥得到米糠抗氧化肽复合粉。
具体的，米糠抗氧化肽复合粉的制备方法，可以包括以下步骤：
(1)制备脱脂米糠：称取米糠粉加入4倍体积的正己烷，置于摇床上水浴恒温振荡。真空抽滤，收集残渣再重复进行脱脂，共3次，最后于通风橱过夜，得到脱脂米糠粉，4℃保存备用；
(2)提取米糠蛋白：
采用高峰α淀粉酶处理，包括以下步骤：准确称量脱脂米糠粉，溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后，立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液，取沉淀备用；
采用碱溶酸沉法提取，包括以下步骤：沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，磁力搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀即为米糠蛋白；
(3)制备米糠抗氧化肽复合物：称取步骤(2)中的米糠蛋白，配置浓度为5％的蛋白质溶液。酶解条件为：蛋白酶为胃蛋白酶、酶解时间为3h、酶解温度为37℃、酶解pH为1.5、沸水浴灭活时间为10mi n。酶解液10000r/mi n离心，上清液为米糠抗氧化肽复合物酶解液，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物；
(4)分离米糠抗氧化肽：采用的分离方法为超滤。将米糠抗氧化肽复合物复溶于超纯水，依次经过截留分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，分别测定分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa水解物各个组分的DPPH自由基清除能力，收集抗氧化性最强的洗脱组分，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合粉。
本发明针对现有米糠资源利用率低且抗氧化性效果不佳的现象，提供一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉及其制备方法。本发明以米糠为原料经过脱脂处理后，采用高峰α淀粉酶-碱法提取米糠蛋白质，之后用胃蛋白酶水解、离心、分离、冷冻干燥得到抗氧化肽复合粉。本发明制备方法简单、绿色环保、重现性好。所述米糠抗氧化肽复合粉中米糠蛋白质利用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取。高峰α淀粉酶可以去除米糠中淀粉杂质，此外热处理可以促使米糠蛋白解折叠、内部疏水区域暴露。所述米糠蛋白抗氧化肽复合粉中米糠肽的制备使用胃蛋白酶，专一性切割疏水性氨基酸与芳香族氨基酸间的肽键，增加疏水性氨基酸、芳香族氨基酸残基数量以提高抗氧化性。所述米糠蛋白抗氧化肽复合粉的分子量＜3kDa。所述米糠抗氧化肽复合粉能够有效清除DPPH、羟基(OH-)自由基，清除能力优于对比例1、对比例2；所述米糠抗氧化肽复合物对Caco-2细胞没有毒害作用。对过氧化氢诱导的Caco-2氧化损伤细胞具有修复功能。对于Caco-2细胞衰老具有延缓作用。
本发明延长了稻米产业链，实现米糠辅料的高值化利用。同时，提供了一种高效、便捷的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，复合粉可应用于食品、保健品、化妆品等领域，例如用于制备抗氧化产品、清除自由基产品、修复氧化损伤产品、延缓细胞衰老产品。
下面通过具体实施例来进行介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1
一种基于高峰α淀粉酶-碱液-胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合粉制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脱脂米糠，包括以下步骤：
称取米糠粉加入4倍体积的正己烷，置于摇床上水浴恒温振荡。真空抽滤，收集残渣再重复进行脱脂，共3次，最后于通风橱过夜，得到脱脂米糠粉，4℃保存备用；
(2)提取米糠蛋白，包括以下步骤：
将脱脂米糠粉与去离子水以1:4料液比进行混合，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mo l/L HC l调节pH至5.0，磁力搅拌30mi n使蛋白质分子与酸溶液充分接触，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀冷冻干燥即为米糠蛋白。
(3)制备米糠抗氧化肽复合物，包括以下步骤：
将冻干后的米糠蛋白分别配置为5％的蛋白质溶液。加入蛋白酶为胃蛋白酶，37℃、pH＝1.5条件下酶解3h后沸水浴灭酶10mi n，10000r/mi n离心，上清液为米糠抗氧化肽复合物酶解液，冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合粉。
(4)分离米糠抗氧化肽，包括以下步骤：
将步骤(3)得到的米糠抗氧化肽复合粉复溶于超纯水中，依次经过分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级，分别得到分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa的组分，测定不同组分的DPPH自由基清除能力。
对比例1
在实施例1的基础上，对比例1在步骤(2)提取米糠蛋白时，使用淀粉酶替换实施例1中的高峰α淀粉酶。
对比例1中具体操作为，调节pH为6.2，加入淀粉酶于55℃搅拌反应15mi n，沸水浴加热10mi n灭酶后立即在冰水中冷却至室温，防止进一步变性，4000r/mi n离心15mi n，弃上清液。其余步骤均与实施例1相同。
对比例2
在实施例1的基础上，对比例2在步骤(2)提取米糠蛋白时取消高峰α淀粉酶预处理，直接使用碱溶法提取米糠蛋白。
对比例2中具体操作为：将脱脂米糠粉与去离子水以1:4料液比进行混合溶于NaOH溶液中，25℃下磁力搅拌浸提120mi n后，4000r/mi n离心15mi n，除去沉淀。上清液用1mol/L HC l调节pH，磁力搅拌30mi n，静置沉淀12h后，4000r/mi n离心15mi n，所得沉淀冷冻干燥，即为米糠蛋白。其余步骤均与实施例1相同。
实施例以及对比例实验效果的验证
一、测定实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠蛋白的纯度、提取率及表面疏水性
测定对实施例1、对比例1、对比例2的各实施例中的步骤(2)制备米糠蛋白的纯度、提取率及表面疏水性，结果见表1和图1。
表1纯度、提取率的检测结果
纯度、提取率的检测结果如表1所示，从表1可以看出，采用本发明实施例1的方法制备的米糠蛋白纯度更好，虽然提取率略低于单一碱法提取但无显著差异。
表面疏水性的检测结果如图1所示，横坐标为不同提取方法制备的米糠蛋白，纵坐标为表面疏水性；图中，1表示使用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品(即实施例1制备的米糠蛋白)，2表示使用淀粉酶-碱法提取的蛋白样品(即对比例1制备的米糠蛋白)，3表示使用碱法提取的蛋白样品(即对比例2制备的米糠蛋白)。从图1可以看出采用高峰α淀粉酶-碱法提取的蛋白样品表面疏水性优于其他方法制备的蛋白样品表面疏水性。
二、检测蛋白质是否被酶解为肽
将各实施例及对比例(实施例1、对比例1、对比例2)的步骤(3)制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行电泳检测。
图2为米糠抗氧化肽复合物酶解液电泳图；泳道1为超低分子量Marker，泳道2为对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液、泳道3为对比例1制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，泳道4为实施例1的步骤(3)制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，泳道5为米糠蛋白由采用常规方法(碱溶酸沉方法)提取的蛋白质(即对比例2提取的米糠蛋白)。
从图2可以看出，米糠蛋白(泳道5)在14.4kDa处有明显条带，泳道3和泳道4经过蛋白酶酶解后条带消失，表明蛋白酶将米糠蛋白酶解为肽且所得米糠肽分子量小于3.3kDa。泳道2表示的是对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物酶解液，蛋白质在14.4KDa处有明显条带，该方法使用碱溶酸沉法提取蛋白质，蛋白质结构为天然的球状，疏水基团位于分子内部；酶解后14.4KDa处条带依然存在，主要是由于胃蛋白酶酶切位点相较于实施例1和对比例1较少，蛋白质与底物接触不充分，进而说明酶解后生成的肽数量少，14.4KDa亚基未被充分酶解，因此依然存在条带。
三、检测各实施例1、对比例1、对比例2分离的米糠抗氧化肽各组分的自由基清除能力
对实施例1、对比例1、对比例2的各实施例中的步骤(4)经超滤分离的米糠抗氧化肽各组分(分子量＜3kDa，3-10kDa和＞10kDa)检测DPPH自由基清除能力。
图3为米糠抗氧化肽复合物溶于水后依次经过分子量为10kDa、3kDa的超滤膜进行分级得到的各组分的抗氧化活性测定结果；横坐标分别为分子量＜3kDa、3-10kDa和＞10kDa的各组分，纵坐标为各组分对DPPH自由基清除率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品，即实施例1步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品，即对比例1步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2步骤(4)分离的米糠抗氧化肽各组分。
结果如图3所示，分子量＜3kDa组分相对其他分子量的组分具有较高的自由基清除能力。在分子量＜3kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分；在分子量3-10kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分；在分子量＞10kDa的组分中，采用实施例1分离得到组分的DPPH自由基清除能力均优于对比例1、对比例2的组分。
四、检测米糠抗氧化肽复合物的化学抗氧化活性
因确定了超滤后分子量＜3KDa组分抗氧化性最强，后面的所有操作中，米糠抗氧化肽复合粉均指的是分子量＜3KDa组分。
对实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠抗氧化肽复合物分子量＜3kDa组分的化学抗氧化活性研究
4.1对DPPH自由基清除能力
取1mL不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉溶液与1mL 0.1mmo l/L的DPPH溶液混合均匀，反应30mi n，在517nm处测其吸光值为A样品；另取1mL米糠抗氧化肽复合粉溶液于试管中，分别加入无水乙醇1mL，反应30mi n，在517nm处测其吸光值记为A对照；以1mL 0.1mmo l/LDPPH和1mL无水乙醇反应液做为空白对照，其吸光值记为A空白按照下式计算米糠蛋白水解物对DPPH自由基的清除率及I C50值：
4.2对OH-清除能力
取0.5mL米糠抗氧化肽复合粉溶液，依次加入0.5mL 1.8mmo l/L的FeSO4、0.5mL1.8mmo l/L的H2O2，混匀后静置10mi n，再加入0.5mL 1.8mmo l/L水杨酸，混匀，静置30min，于510nm处测其吸光值记为A样品，当用蒸馏水代替水杨酸时测得的吸光值记为A对照。空白对照组以蒸馏水代替米糠蛋白水解物测得的吸光值记为A空白。按照下式计算大米蛋白水解物对羟自由基·OH的清除率及I C50值：
对系列浓度的DPPH及OH-清除率进行测定后，使用SPSS进行拟合分析，得到I C50。
自由基清除能力检测结果如表2所示，相比对比例1和对比例2，本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合物具有较强的DPPH及OH-清除能力(表2中，以I C50值体现，I C50值越低表示抗氧化性强自由基清除能力强，因I C50值相对单一浓度下清除率值更为准确，所以此处提供的是I C50)。
表2自由基清除能力检测结果
| 样品 | DPPH自由基清除能力 | .OH自由基清除能力 |
| 高峰α淀粉酶-碱法 | 4.585 | 1.283 |
| 淀粉酶-碱法 | 6.062 | 3.565 |
| 碱法 | 8.793 | 7.058 |
五、对实施例1、对比例1、对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉分子量＜3KDa组分的细胞抗氧化活性研究
因确定了超滤后分子量＜3KDa组分抗氧化性最强，后面的所有操作中，米糠抗氧化肽复合粉均指的是分子量＜3KDa组分。
5.1米糠抗氧化复合物对Caco-2细胞的影响
取处于对数期的Caco-2细胞，按照2×103/孔接种于96孔板中。设置不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL，使用不含血清的培养金配置)孵育24h。24h后吸出样品加入100μL含10％ CCK-8的基础培养基，37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后检测450nm波长下各组OD值。
图4为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞增殖活性影响。横坐标为米糠抗氧化肽复合粉浓度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、10、20mg/mL)，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备样品，即本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-酶法-胃蛋白酶制备样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉。
结果如图4所示，低浓度下，相同处理组不同浓度间无显著性差异。不同处理组之间，实施例1处理细胞后，细胞增值率显著优于对比例1处理组、对比例2处理组。说明本发明制备物对Caco-2细胞没有毒害作用。
未处理的样品(对照)自动设定为100，各处理组(实施例1、对比例1、对比例2)是相对值。低浓度下，样品中的肽含量较少，随着处理时间的延长，细胞增殖率会下降。随着浓度的上升，抗氧化肽浓度增大，会减少H2O2对细胞的损伤，因而细胞增值率上升。浓度过大时，细胞外侧形成高渗透压，会导致水分流失，因而细胞增值率下降。
5.2米糠抗氧化复合物对过氧化氢诱导的Caco-2细胞修复影响
按照2×103/孔的细胞数将Caco-2细胞铺板于96孔板中，培养24h待其贴壁完全后，使用含有200μM的H2O2培养基(不含胎牛血清)处理细胞1h，构造衰老模型。空白对照组加入不含血清的基础培养基处理1h。然后吸取并弃去培养基，实验组分别加入含有不同浓度样品的培养基(不含胎牛血清)，空白组和模型组各加入不含胎牛血清的基础培养基继续培养24h后，以CCK-8法评估细胞增殖率变化。
图5为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对200μmo l/L过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞的修复作用；横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉；4表示谷胱甘肽。
结果如图5所示，不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.05、0.25、1mg/mL)对过氧化氢诱导的氧化损伤Caco-2细胞呈现出一定的修复作用。且随着浓度的升高，细胞增殖率上升。相对对比例1、对比例2，采用本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉细胞增殖率更高，说明细胞修复的效果更好。
5.3米糠抗氧化复合物对Caco-2细胞衰老作用
按照2×103/孔的细胞数将Caco-2细胞铺板于96孔板中，培养24h待其贴壁完全后。分别加入含有不同浓度米糠抗氧化复合粉的DMEM培养基孵育24h。模型组和对照组分别加入等量的DMEM培养基(不含胎牛血清)进行孵育。弃去培养基向实验组和模型组加入200μM的H2O2培养基(不含胎牛血清)，空白组加入DMEM培养基继续孵育1h后利用CCK-8法测定细胞增殖率。
图6为本发明制备的米糠抗氧化肽复合粉对Caco-2细胞衰老延缓作用。横坐标为样品分组，纵坐标为细胞增殖率；图中，1表示基于高峰α淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；2表示基于淀粉酶-碱法-胃蛋白酶制备的样品，即对比例1制备的米糠抗氧化肽复合粉；3表示基于碱法-胃蛋白酶制备样品，即对比例2制备的米糠抗氧化肽复合粉；4表示谷胱甘肽。
结果如图6所示，可知不同浓度的米糠抗氧化肽复合粉(0.05、0.25、1mg/mL)对Caco-2细胞的衰老呈现出一定的延缓作用。且随着浓度的升高，细胞增殖率上升。相对对比例1、对比例2，采用本发明实施例1制备的米糠抗氧化肽复合粉细胞增殖率更高，说明延缓衰老的效果更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.米糠抗氧化肽复合物制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白；将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物，米糠抗氧化肽复合物的分子量小于3kDa。
2.根据权利要求1所述制备工艺，其特征在于，将脱脂米糠采用高峰α淀粉酶结合碱溶酸沉法提取，得到米糠蛋白，包括以下步骤：将脱脂米糠粉溶于4倍体积的去离子水中，调节pH为6.2，加入高峰α-淀粉酶于90℃搅拌反应15min，沸水浴加热10min灭酶后立即冷却至室温，4000r/min离心15min，弃上清液；沉淀复溶于NaOH溶液中，25℃下搅拌浸提120min后，4000r/min离心15min，除去沉淀，得到上清液；上清液用1mol/L HCl调节pH，搅拌30min，静置沉淀12h后，4000r/min离心15min，得到沉淀即为米糠蛋白。
3.根据权利要求1所述制备工艺，其特征在于，将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解，包括以下步骤：将米糠蛋白配置浓度为5％的米糠蛋白质溶液；酶解条件为：采用胃蛋白酶，酶解时间为3h，酶解温度为37℃，酶解pH为1.5，沸水浴灭活时间为10min；将酶解液10000r/min离心或过滤，取上清得到米糠抗氧化肽复合物酶解液。
4.根据权利要求1-3任一项所述制备工艺，其特征在于，在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液进行超滤分离的步骤；或在将米糠蛋白用胃蛋白酶酶解之后，还包括将酶解后得到的米糠抗氧化肽复合物酶解液冷冻干燥，得到米糠抗氧化肽复合物，使用时再将米糠抗氧化肽复合物复溶于水后进行超滤分离的步骤。
5.根据权利要求1-3任一项所述制备工艺，其特征在于，脱脂米糠的制备工艺包括以下步骤：将粉碎、过筛的米糠加入4倍体积的正己烷，恒温震荡；真空抽滤，收集残渣，重复脱脂，得到脱脂米糠。
6.米糠抗氧化肽复合物在修复氧化损伤中的应用，其特征在于，米糠抗氧化肽复合物采用权利要求1-5任一项所述方法制备。
7.米糠抗氧化肽复合物在延缓细胞衰老中的应用，其特征在于，米糠抗氧化肽复合物采用权利要求1-5任一项所述方法制备。
8.米糠抗氧化肽复合物在清除自由基中的应用，其特征在于，米糠抗氧化肽复合物采用权利要求1-5任一项所述方法制备。
9.米糠抗氧化肽复合物在制备抗氧化食品、保健品或者化妆品中的应用，其特征在于，米糠抗氧化肽复合物采用权利要求1-5任一项所述方法制备。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310436117.3A CN116218940B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310436117.3A CN116218940B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 |
| CN202111472065.2A CN114150033B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111472065.2A Division CN114150033B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116218940A true CN116218940A (zh) | 2023-06-06 |
| CN116218940B CN116218940B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=80452673
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310436093.1A Active CN116218939B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 高峰α淀粉酶和胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合物及其应用 |
| CN202111472065.2A Active CN114150033B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法 |
| CN202310436117.3A Active CN116218940B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310436093.1A Active CN116218939B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 高峰α淀粉酶和胃蛋白酶处理的米糠抗氧化肽复合物及其应用 |
| CN202111472065.2A Active CN114150033B (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种高峰α淀粉酶处理的米糠抗氧化肽复合物制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN116218939B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103689741A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-04-02 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种酶法结合乳酸发酵制备米糠饮料的方法 |
| CN106749701A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 无锡甜丰食品有限公司 | 稻谷加工副产品高效联产麦芽糊精和米蛋白的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102080118A (zh) * | 2010-06-23 | 2011-06-01 | 东北农业大学 | 一种米糠抗氧化活性蛋白肽的制作 |
| CN104450839B (zh) * | 2014-11-05 | 2017-06-13 | 哈尔滨商业大学 | 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法 |
| CN104957359A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-07 | 肇庆焕发生物科技有限公司 | 用玉米蛋白粉生产食品级抗氧化肽的方法 |
| CN105039481B (zh) * | 2015-08-03 | 2018-05-22 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种提高多肽品质的米糠多肽的制备方法 |
| CN106636274B (zh) * | 2016-11-29 | 2021-06-11 | 中南林业科技大学 | 一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法 |
| US11371070B2 (en) * | 2018-11-01 | 2022-06-28 | Kansas State University Research Foundation | Antioxidant protein hydrolysates and peptides from cereal grain crops |
| CN112970933A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-18 | 江西恒顶食品有限公司 | 一种米糠蛋白提取方法 |
-
2021
- 2021-12-06 CN CN202310436093.1A patent/CN116218939B/zh active Active
- 2021-12-06 CN CN202111472065.2A patent/CN114150033B/zh active Active
- 2021-12-06 CN CN202310436117.3A patent/CN116218940B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103689741A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-04-02 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种酶法结合乳酸发酵制备米糠饮料的方法 |
| CN106749701A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 无锡甜丰食品有限公司 | 稻谷加工副产品高效联产麦芽糊精和米蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| ADEBIYI, A.P.等: "purification and charaterisation of antioxidative peptides from unfractionated rice bran protein hydrolysates", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 43 * |
| 何莉媛;吴伟;吴晓娟;付旭恒;林亲录;: "米糠贮藏时间对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质及其消化产物抗氧化性的影响", 中国油脂, no. 11, pages 71 * |
| 刘春莉, 张文学, 杨瑞: "特殊α-淀粉酶的应用研究现状和前景展望", 四川食品与发酵, no. 04 * |
| 刘静怡;丁城;周梦舟;阳雁;吴茜;关亚飞;: "双酶法分离提取米糠膳食纤维的研究", 食品科技, no. 10 * |
| 周梅;张敏;: "米糠蛋白抗氧化活性肽的制备", 天然产物研究与开发, no. 06, pages 793 * |
| 李佳南;王静;张慧娟;李莹莹;刘英丽;庞小一;姜国庆;: "大米蛋白抗氧化肽的活性以及组成鉴定研究", 食品工业科技, no. 23 * |
| 池爱平等: "脱脂米糠酶法水解制备米糠营养素工艺研究", 食品科学, vol. 27, no. 12, pages 340 * |
| 王良东;杜风光;史吉平;董青山;: "大米蛋白制备研究进展", 食品科技, no. 02, pages 59 - 60 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116218940B (zh) | 2023-10-13 |
| CN114150033B (zh) | 2023-05-19 |
| CN114150033A (zh) | 2022-03-08 |
| CN116218939B (zh) | 2023-09-15 |
| CN116218939A (zh) | 2023-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108823273B (zh) | 一种具有抗氧化活性的牡丹籽粕多肽及其制备方法和应用 | |
| CN111892644B (zh) | 一种保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽及其制备方法 | |
| CN109251954B (zh) | 一种海参多肽的生产方法 | |
| CN110734948A (zh) | 一种从大豆中提取硒多肽的提取装置及工艺 | |
| CN109957595A (zh) | 一种猪肝肽粉的制备工艺 | |
| CN111269290A (zh) | 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法 | |
| CN108342439B (zh) | 一种能提高酿酒酵母乙醇耐受性的小麦面筋蛋白肽的制备方法及应用 | |
| CN114015739A (zh) | 一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法 | |
| CN115418383A (zh) | 一种酵母发酵产物提取物及其制备方法和应用 | |
| CN110117632B (zh) | 一种超声联合双酶解提高西瓜籽多肽抗氧化稳定性的方法 | |
| CN116514912A (zh) | 抗皮肤氧化损伤的草菇多肽及其应用 | |
| CN117327205B (zh) | 一种从猪肺中提取肝素的方法 | |
| CN116218940B (zh) | 米糠抗氧化肽复合物制备工艺及其应用 | |
| CN102952841A (zh) | 一种三角帆蚌肉酶解蛋白液的制备方法 | |
| CN116621934B (zh) | 来源于草菇的抗皮肤氧化和抑制氧化应激的多肽及其应用 | |
| CN110196333B (zh) | 一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用 | |
| CN114592024A (zh) | 一种羊胎盘多肽及其制备方法和应用 | |
| CN113481270B (zh) | 一种从扇贝裙边中提取糖肽的方法 | |
| CN110527705B (zh) | 一种酶解兔血发酵液制备抗氧化低聚肽的方法 | |
| CN108866133B (zh) | 压差预处理协同高密度发酵小麦麦麸生产麦麸低聚肽方法 | |
| CN107674898A (zh) | 一种由维生素k2发酵液中提取蛋白质的方法 | |
| CN117343132B (zh) | 一种三文鱼鱼皮来源的ace抑制肽及制备方法 | |
| CN117778504A (zh) | 一种抗氧化鹿心肽的制备方法 | |
| CN115161212B (zh) | 特基拉芽孢杆菌菌株 | |
| CN108299569A (zh) | 牡蛎多糖的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |