CN114015739A - 一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括：A、将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻密封，备用；B、将鱼皮解冻，灭菌，加入灭菌蒸馏水并调节pH，得发酵培养基；C、接入含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，恒温静置发酵，并每隔5h搅拌1次；D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入缓冲溶液，过滤，灭酶，离心，收集上清液，过滤，收集滤液，浓缩，即得。本发明采用微生物发酵法，可以同步完成杂蛋白的去除、脂肪的去除、胶原蛋白的提取和酶解胶原蛋白四道工序，工艺简单；目标产物浓度高、质量好，制备方法能耗低，生产成本低，对环境友好。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法。
背景技术
胶原蛋白是动物体内重要的蛋白质，约占总蛋白含量的25％。胶原蛋白肽，是胶原蛋白适度降解后形成的一种多肽，具有抗氧化、抑菌、免疫调节和降血糖等多种生理活性。陆生生物组织曾是获取天然胶原肽的主要来源，但由于禽流感、疯牛病等疾病的潜在威胁和宗教习俗等原因，使得陆源性胶原肽无法大范围应用，开发水产胶原蛋白活性肽成为国内外热门课题之一。罗非鱼是我国重要的养殖鱼类，其鱼皮中氨基酸组成合理且胶原蛋白含量较高，但在粗加工中通常被当作下脚料丢弃或制成廉价饲料，造成严重的环境污染和资源浪费。充分利用现有的水产资源，最大限度地提高产品附加值，是水产品综合开发利用的一个重要方向，因此寻找新型加工技术突破产业发展瓶颈，对于罗非鱼和胶原蛋白肽产业具有极大的现实意义。
中国专利(授权公告号CN102533914B)公开了一种高纯度无腥异味的鱼胶原蛋白肽及制备方法，该方法包括步骤：将鱼皮洗净后切块、绞碎，NaCl溶液搅拌处理，离心脱脂去异蛋白，加水调节初始浆液pH值至8.0～8.5，碱性蛋白酶和中性蛋白酶组合梯度酶解，酶解结束后灭酶、活性炭吸附脱色，再经粗滤和精滤、蒸发浓缩、喷雾干燥制得产品。该方法采用酶解法制备鱼胶原蛋白肽，成本高，工序多，在液相状态下进行，易被杂菌污染。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，本发明采用微生物发酵法制备胶原蛋白肽，可以同步完成杂蛋白的去除、脂肪的去除、胶原蛋白的提取和酶解胶原蛋白四道工序，大大简化了工艺；目标产物浓度高、质量好，制备方法能耗低，生产成本低，对环境友好，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻密封，备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌15～20min，加入灭菌蒸馏水并调节pH，得发酵培养基；
C、发酵：接入含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，恒温静置发酵，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入缓冲溶液，过滤，然后在90℃下灭酶8～12min，离心10～20min，收集上清液，过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
进一步，步骤A中，冷冻至-20℃。
进一步，步骤B中，灭菌蒸馏水按料液比为1:0.8～1.2加入。
进一步，步骤B中，调节pH值至6.5～7.5。
进一步，步骤C中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的质量比为3:2.1:0.7:0.2。
进一步，步骤C中，发酵种子液的接种量为50g/L，菌龄为14～18h。
进一步，步骤C中，发酵温度为32～37℃，发酵时间为20～24h。
进一步，步骤D中，缓冲溶液为浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠溶液。
进一步，步骤D中，离心转速为5000～8000r/min。
进一步，步骤D中，第一次过滤用纱布，第二次过滤用0.45μm滤膜。
本发明相比于现有技术的有益效果为：
1、本发明采用微生物发酵法制备胶原蛋白肽，可以同步完成杂蛋白的去除、脂肪的去除、胶原蛋白的提取和酶解胶原蛋白四道工序，大大简化了工艺；无需使用化学试剂和昂贵的酶制剂，并且能够去除鱼皮中的腥臭味，提高样品感官质量，极大节约生产成本，提高生产效率。本发明采用固态发酵，能耗低，对生产设备要求不高，不易被杂菌污染，目标产物浓度高、质量好，对环境友好，具有大规模生产活性肽的优势。
2、本发明发酵种子液中同时包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类；地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，能够促进营养素降解；纳豆芽孢杆菌能生成多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解某些复杂的碳水化合物；三者有共同之处，也有自身的独特之处，进行合理的搭配，能够提高发酵效率，获得更多胶原蛋白肽。本发明发酵种子液中还加入了维生素C磷酸酯镁，维生素C磷酸酯镁是维生素C的衍生物，它具有维生素C所有的功能，又克服了维生素C稳定性差的缺陷，且极易被吸收，能够清除自由基，对延缓皮肤衰老起到重要作用；同时，维生素C磷酸酯镁中镁元素的存在，能够加强酶促反应，进一步提高反应速率，并提高胶原蛋白肽的得率。
3、本发明提取方法工艺简单，能耗低，科学合理的选择生物制剂进行发酵，整体耗时短，产品得率高，有很好的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻至-20℃，密封备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌15min，按料液比为1:0.8加入灭菌蒸馏水并调节pH至6.5，得发酵培养基；
C、发酵：按接种量为50g/L接入含有质量比为3:2.1:0.7:0.2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，菌龄为14h；在32℃下恒温静置发酵20h，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠缓冲溶液，用纱布过滤，然后在90℃下灭酶8min，在5000r/min下离心10min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
实施例2
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻至-20℃，密封备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌18min，按料液比为1:1加入灭菌蒸馏水并调节pH至7，得发酵培养基；
C、发酵：按接种量为50g/L接入含有质量比为3:2.1:0.7:0.2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，菌龄为16h；在35℃下恒温静置发酵22h，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠缓冲溶液，用纱布过滤，然后在90℃下灭酶10min，在6000r/min下离心15min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
实施例3
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻至-20℃，密封备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌20min，按料液比为1:1.2加入灭菌蒸馏水并调节pH至7.5，得发酵培养基；
C、发酵：按接种量为50g/L接入含有质量比为3:2.1:0.7:0.2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，菌龄为18h；在37℃下恒温静置发酵24h，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠缓冲溶液，用纱布过滤，然后在90℃下灭酶12min，在8000r/min下离心20min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
实施例4
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻至-20℃，密封备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌16min，按料液比为1:0.9加入灭菌蒸馏水并调节pH至7.2，得发酵培养基；
C、发酵：按接种量为50g/L接入含有质量比为3:2.1:0.7:0.2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，菌龄为15h；在34℃下恒温静置发酵21h，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠缓冲溶液，用纱布过滤，然后在90℃下灭酶9min，在6000r/min下离心18min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
实施例5
一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻至-20℃，密封备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌18min，按料液比为1:1.1加入灭菌蒸馏水并调节pH至6.8，得发酵培养基；
C、发酵：按接种量为50g/L接入含有质量比为3:2.1:0.7:0.2的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，菌龄为17h；在33℃下恒温静置发酵23h，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠缓冲溶液，用纱布过滤，然后在90℃下灭酶11min，在7000r/min下离心12min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
对比例1
与实施例2基本相同，唯有不同的是，发酵种子液中未添加维生素C磷酸酯镁。
对比例2
与实施例2基本相同，唯有不同的是，发酵种子液中只含有枯草芽孢杆菌，其他成分含量不变。
对比例3
与实施例2基本相同，唯有不同的是，发酵种子液中只含有地衣芽孢杆菌，其他成分含量不变。
对比例4
与实施例2基本相同，唯有不同的是，发酵种子液中只含有纳豆芽孢杆菌，其他成分含量不变。
对比实验
1、酶活力的测定
将甘氨酸作为标准氨基酸，以Ⅰ型胶原蛋白为底物，采用茚三酮显色法测定分别测定实施例1～5和对比例1～4中酶活力。酶活力定义为：在37℃，pH 7.5的条件下，每分钟水解胶原蛋白产生1μg甘氨酸所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
2、多肽含量的测定
参考OYAIZU的方法，以谷胱甘肽(glutathione，GSH)作为阳性对照。分别称取实施例1～5和对比例1～4样品2g，加入10mL、150g/L三氯乙酸溶液，混合均匀，静置5min，在3000r/min下离心10min后，取全部上清液，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定上清液中多肽含量。
3、测定结果
由上表可知，本发明实施例1～5的制备方法多肽含量均在91％以上，酶活力高达95.95U·mL-1以上。可见，采用本发明的方法制备胶原蛋白肽，能够提高酶活性，并提高胶原蛋白肽得率。
相比于实施例2，对比例1中未添加维生素C磷酸酯镁，酶活力下降了4.88％，多肽含量下降了1.5％；可见，维生素C磷酸酯镁对于酶活力的提高具有较大的促进作用，从而能够获得更多的胶原蛋白肽。而对比例2～4的发酵种子液中只含有单一菌种，酶活力和多肽含量均有较大幅度下降。可见，本发明采用复合菌种进行发酵，能够协同提高产酶量，并且在维生素C磷酸酯镁的作用下能够进一步提高酶活性，从而提高胶原蛋白肽的得率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、鱼皮预处理：将罗非鱼鱼皮带鳞洗净后充分沥干，切块、搅碎，速冻密封，备用；
B、制备发酵培养基：将鱼皮解冻，在121℃下灭菌15～20min，加入灭菌蒸馏水并调节pH，得发酵培养基；
C、发酵：接入含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的发酵种子液，恒温静置发酵，并每隔5h搅拌1次；
D、发酵结束后，向鱼皮培养基中加入缓冲溶液，过滤，然后在90℃下灭酶8～12min，离心10～20min，收集上清液，过滤，收集滤液，浓缩，即得液体胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤A中，冷冻至-20℃。
3.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤B中，灭菌蒸馏水按料液比为1:0.8～1.2加入。
4.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤B中，调节pH值至6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤C中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、维生素C磷酸酯镁的质量比为3:2.1:0.7:0.2。
6.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤C中，发酵种子液的接种量为50g/L，菌龄为14～18h。
7.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤C中，发酵温度为32～37℃，发酵时间为20～24h。
8.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤D中，缓冲溶液为浓度为0.1mol/L、pH为6.2的柠檬酸钠溶液。
9.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤D中，离心转速为5000～8000r/min。
10.根据权利要求1所述的用罗非鱼鱼皮制备液体胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤D中，第一次过滤使用纱布，第二次过滤使用0.45μm滤膜。
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