CN111269290A - 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产品高值化利用领域，涉及一种鲟鱼抗炎肽的制备方法；该方法通过酶法水解鲟鱼肌肉得到酶解产物，以NO释放量为分离评价指标，采用膜分离、Sephadex G‑15凝胶柱及SP‑650M离子交换柱对鲟鱼蛋白酶解产物分离纯化，得到鲟鱼抗炎肽，包含三种具有抗炎潜能的多肽序列：Lys–Ile–Trp–His–His–Thr–Phe；Val–His–Tyr–Ala–Gly–Thr–Val–Asp–Tyr；His–Leu–Asp–Asp–Ala–Leu–Arg–Gly–Gln–Glu；其能有效抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中NO释放量，且该抗炎肽无细胞毒害作用，有助于实现鲟鱼高值化利用。

Description

一种鲟鱼抗炎肽的制备方法

技术领域

本发明属于水产品高值化利用领域，具体涉及一种鲟鱼抗炎肽的制备方法。

背景技术

鲟鱼(Acipenser)，隶属硬骨鱼纲、鲟形目，是一类具有生物和经济重要性的鱼类。2016年鲟鱼全国产量为89773吨，占世界鲟鱼总产量80％以上；2017年，鲟鱼被列入国家现代农业产业技术体系(特色淡水鱼体系)中。在鲟鱼产业蓬勃发展的大背景下，其利用主要是以速冻调理产品、开袋即食产品等形式出现。尽管鲟鱼卵制成的“鱼子酱”在一定程度上提高了其经济价值，但仍有90％的鲟鱼副产物没有得到充分利用，总的来说，鲟鱼综合利用率及附加值较低。鲟鱼肉具有最佳的膳食蛋白质和必需氨基酸，是生物活性肽的良好来源，并且，鲟鱼肉还具有免疫功能。

炎症是机体对各种炎症因子的防御反应，是许多疾病中最常见的病理过程。当机体的免疫平衡状态被打破，炎性细胞聚集，启动细胞趋化机制，释放大量炎症细胞因子，如：NO、IL-1β、IL-6等。迄今为止，不受控制的炎症与心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病密切相关。近年来，抑制炎症介质的合成或活性已成为治疗炎症的主流，而市售的抗炎药物常常伴有副作用，如降低组织修复能力和损伤胃肠粘膜。因而，寻找一种天然抗炎产物是一个有前景的策略。

食源性抗炎肽由于其安全性高、易吸收及来源广泛等优点而成为研究热点。目前，制备抗炎肽的方法主要有微生物发酵法、合成法及酶解法等。

微生物发酵法利用微生物自身的胞外蛋白酶降解食源性蛋白质获得生物活性肽；李红胜等利用芽孢杆菌发酵制备的大豆肽可显著提高小鼠免疫器官指数，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性；张奕等利用乳酸菌和酵母菌对新鲜驼乳进行混合发酵，从发酵驼乳中提取分离得到了能促进小鼠脾淋巴细胞增殖的生物活性肽组分。但是由于发酵工艺生产周期较长，容易杂菌污染，有很多产酶菌对机体有毒害作用，得到的产品质量不太稳定。

化学有机合成法是基于活性肽氨基酸序列已知的前提下，从C端开始添加目标氨基酸。Navab等发现口服化学合成肽(Lys-Arg-Glu-Ser)可以降低LDL过氧化物，减轻炎症，减少apoE-null小鼠的动脉粥样硬化；该法一直被用于批量合成靶肽，成本较高且主要是针对已知肽序进行制备。

酶解法因条件温和、安全性高、可控性高、成本低等特点已成为最常用制备生物活性肽的方法。Chalamaiah等用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶对rohu蛋白酶解，三种酶解产物在免疫应答方面存在差异；胡旭阳等采用Box-Behnken实验确定日本黄姑鱼鱼肉免疫活性肽的酶解最佳提取工艺。梁秋芳等通过超声预处理，利用碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白，并对其酶解产物进行模拟胃肠消化追踪其抗炎活性最终鉴定出三种抗炎序列。如何对蛋白肽键进行靶向性酶解仍是蛋白质酶解制备活性肽最难解决的核心技术，这涉及到蛋白质的来源、所用酶的种类及应用的水解条件等。

蛋白水解产物由于其成分的复杂多样，且目标活性肽纯度较低，活性较弱，分离纯化是制备抗炎肽必不可少的环节。传统的分离技术(如：溶媒、沉淀及萃取等)操作过程复杂，易失活及消耗原料多等缺限并不实用。因而需要采用现代生物技术(如：色谱、层析及电泳等)有针对性的对目标产物进行分离；吴晖等通过酶解、阴离子柱层析、凝胶柱层析及半制备RP-HPLC分离纯化出桑叶免疫活性肽；管多数研究已经通过酶解法或者超声、加压等加工技术结合酶解法获得多种食源性抗炎肽，但只是基于酶解产物或初步分离纯化得到的有效组分进行活性阐述。当然，少部分研究对有效活性组分进行肽序鉴定，却忽略了这些肽序的活性验证。

目前鲟鱼多肽的抗炎活性研究国内外未有文献报道。而由于蛋白质的来源不同、酶的专一性及目标活性肽的筛选方法不同。所以现有关于食源性抗炎肽的制备方法并不完全适用于鲟鱼活性肽的研究。此外，初步制备得到活性产物的生物活性水平通常较低。因此，开发或选择最优纯化路线是制备抗炎肽至关重要的环节。而关于鲟鱼肉的功能性食品还没有相关的研究报道，以鲟鱼蛋白水解物为基料的功能食品也相对较少。所以，鲟鱼抗炎肽的研究具有广阔的市场前景，有助于解决鲟鱼高值化利用的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明从酶法水解鲟鱼肌肉获得鲟鱼活性肽角度切入，根据炎症介质NO释放量为筛选指标，确定最佳蛋白酶且对鲟鱼酶解产物进行初步分离纯化，提供一种简单高效的鲟鱼抗炎肽制备方法。本发明首次利用鲟鱼蛋白酶解产物进行抗炎活性的分离纯化，其次对有效活性肽组分进行鉴定及肽序的活性验证，最终得到三种具有抗炎潜能的新型多肽序列。

本发明首先提供一种鲟鱼抗炎活性肽，包括具有抗炎潜能的三种多肽，其氨基酸序列为：

Lys–Ile–Trp–His–His–Thr–Phe；

Val–His–Tyr–Ala–Gly–Thr–Val–Asp–Tyr；

His–Leu–Asp–Asp–Ala–Leu–Arg–Gly–Gln–Glu；

本发明还提供一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)前处理步骤：鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取肌肉部位绞成肉糜，并通过凯氏定氮法测定鲟鱼肉糜中粗蛋白含量；

(2)酶解：取步骤(1)中鲟鱼肉糜加蒸馏水均质，得到混合液，并调整混合液的底物蛋白浓度，再加入蛋白酶，进行单酶酶解，反应结束后，经振荡，得到酶解液，酶解液置于沸水浴中反应一段时间，冷却至室温；然后再离心，收集上清液、抽滤，得到鲟鱼酶解产物；

(3)超滤：采用超滤膜对(2)中得到的鲟鱼酶解产物进行分级分离，获得组分，冻干，得到冻干后的组分；

(4)Sephadex G-15凝胶柱：对(3)中冻干后的组分进行纯化，蒸馏水洗脱，紫外检测波长为280nm，收集洗脱液，将同一分离峰合并，冻干，得到冻干后的组分；

(5)SP-650M离子交换柱：对(4)中冻干后的组分进一步纯化，纯化后，利用洗脱液线性梯度洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干，得到鲟鱼抗炎活性肽。

优选的，步骤(2)中，所述底物蛋白浓度为10％-20％。

优选的，步骤(2)中，所述蛋白酶为胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一种；胃蛋白酶为最优酶，加酶量为4000U/g-6000U/g；

优选的，步骤(2)中，所述不同蛋白酶的酶解条件不同；胃蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 2.0；中性蛋白酶的酶解条件为50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶的酶解条件为50℃，pH8.0；胰蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶的酶解条件为55℃，pH 8.0。

优选的，步骤(2)中，所述振荡的条件为：120rpm，6h；所述沸水浴中反应一段时间为20～30min；所述离心的条件为：4℃温度条件下以10000rpm离心15min。

优选的，步骤(3)中，所述超滤膜的分子量为10kDa及3kDa；

优选的，步骤(4)中，所述纯化是使用Sephadex G-15凝胶柱，柱规格1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为2-5mL，样品浓度为10-20mg/mL。

优选的，步骤(5)中，所述纯化是使用SP-650M离子交换柱，柱规格1.2cm×50cm，流速为0.8-1.5mL/min。

优选的，步骤(5)中，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；洗脱液A为20-25mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5-5.0)，洗脱液B为洗脱液A中再加入0.5-1.0M NaCl。

肽序鉴定、多肽合成及活性验证；

S1、LC-MS/MS鉴定肽序：利用LC-MS/MS对(5)中鲟鱼抗炎活性肽进行鉴定，获得的质谱数据使用软件MAXQUANT进行分析；并将获得多肽序列与Uniprot-Acipenser数据库进行比对，得出肽序列的蛋白来源；

S2、多肽合成及活性验证：对(6)中鉴定得到的多肽序列进行合成，并通过NO释放量初步验证其抗炎潜能；得到具有抗炎潜能的三种多肽。

优选的，步骤S2中，所述NO释放量具体操作为：建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型，当肽处理组的NO释放量低于模型组(LPS组)NO释放量时，认为该肽具有抗炎潜能；而当肽处理组的NO释放量高于或者等于模型组(LPS组)NO释放量时，认为该肽不具有抗炎潜能。

优选的，步骤S2中，所述具有抗炎潜能的三种多肽其氨基酸序列为：

Lys–Ile–Trp–His–His–Thr–Phe；

Val–His–Tyr–Ala–Gly–Thr–Val–Asp–Tyr；

His–Leu–Asp–Asp–Ala–Leu–Arg–Gly–Gln–Glu；

上述步骤中抗炎活性测定包括：建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型，MTT法测定细胞活力，Griess法测定NO释放量为筛选指标；

MTT法及Griess法具体为：

MTT法测定细胞活力：将RAW264.7巨噬细胞置于96孔板，细胞密度调整为5×10⁴个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养使之完全贴壁。加样，对照组只加培养基，同时设置调零组为不含细胞只加培养基，每个浓度设6个复孔。培养24h后，吸弃上清，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)。孵育4h后，吸弃上清，每孔加入150μL DMSO摇匀，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解，于540nm测定吸光值。

Griess法测定NO释放量：将RAW264.7巨噬细胞置于96孔板，细胞密度调整为5×10⁴个/孔，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养使之完全贴壁。加样预处理8h后，加LPS(终浓度为2μg/mL)培养24h。收集上清，NO试剂盒(碧云天公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据亚硝酸盐标准曲线计算样本NO浓度。

本发明具有如下优点和有益效果：

(1)制备工艺简单，成本低，条件温和，有效的保持了鲟鱼肽的抗炎活性，且制备方法过程不涉及任何有机溶剂，污染少，保证了产品的安全性；

(2)本发明结果显示，胃蛋白酶酶解产物抗炎效果显著高于其他四种酶解产物，同时无细胞毒害作用，且经过Sephadex G-15凝胶柱，SP-650M离子交换柱纯化得到的低分子量肽与胃蛋白酶酶解产物相比，具有更强的抗炎活性；

(3)本发明首次鉴定并初步活性验证得到三种新型具有抗炎潜能的多肽序列；

(4)本发明扩大了鲟鱼的应用范围，既可以解决鲟鱼的高值化利用问题，又能作为一种功能性因子应用于功能性产品当中，对食品、医药、保健品等行业的发展具有重要意义。

附图说明

图1中A为实施例3中五种酶解产物对RAW264.7细胞活力测定结果图；B为实施例3中五种酶解产物处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；B中a为不加酶解产物，b为不加酶解产物，c为碱性蛋白酶酶解产物，d为木瓜蛋白酶酶解产物，e为中性蛋白酶酶解产物，f为胃蛋白酶酶解产物，g为胰蛋白酶酶解产物。

图2为实施例4中超滤后的各组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；a为不加肽处理，b为不加肽处理，c为胃蛋白酶酶解产物，d为＞10kDa组分，e为3-10kDa组分，f为＜3kDa组分。

图3中A图为实施例2中Sephadex G-15柱层析结果图；B图为实施例2中经SephadexG-15柱层析后组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；其中a为不加肽处理，b为不加肽处理，c为胃蛋白酶酶解产物，F1为Sephadex G-15柱层析后第一个吸收峰所得组分，F2为Sephadex G-15柱层析后第二个吸收峰所得组分，F3为Sephadex G-15柱层析后第三个吸收峰所得组分。

图4中A图为实施例1中SP-650M柱层析结果图；B为实施例1中经SP-650M后组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；其中a为不加肽处理，b为不加肽处理，f1为SP-650M柱层析后第一个吸收峰所得组分，f2为SP-650M柱层析后第二个吸收峰所得组分，f3为SP-650M柱层析后第三个吸收峰所得组分，f4为SP-650M柱层析后第四个吸收峰所得组分，f5为SP-650M柱层析后第五个吸收峰所得组分，f6为SP-650M柱层析后第六个吸收峰所得组分。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明:

实验方法：

抗炎活性测定包括：建立LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型，MTT法测定细胞活力，Griess法测定NO释放量；

(1)细胞活力测定：将RAW264.7巨噬细胞置于96孔板，细胞密度调整为5×10⁴个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO₂、37℃培养箱中过夜培养使之完全贴壁。加样(终浓度为0.125、0.25、0.50、1.0、2.0mg/mL)，对照组只加培养基，同时设置调零组为不含细胞只加培养基，每个浓度设6个复孔。培养24h后，吸弃上清，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)。孵育4h后，吸弃上清，每孔加入150μLDMSO摇匀，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解，于540nm测定吸光值。

(2)NO释放量测定：将RAW264.7巨噬细胞置于96孔板，细胞密度调整为5×10⁴个/孔，每孔体积为150μL，在5％CO₂、37℃培养箱中过夜培养使之完全贴壁。加样(终浓度为0.5mg/mL)预处理8h后，加LPS(终浓度为2μg/mL)培养24h。收集上清，NO试剂盒(碧云天公司)测定NO释放量，即50μL上清与50μL Griess试剂Ⅰ、Griess试剂Ⅱ混合，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算样本NO浓度。

2.LC-MS/MS鉴定多肽序列：

液相色谱分析柱为Acclaim PepMap C₁₈(75μm×150mm，3μm)，流动相包括：A：0.1％甲酸，2％ACN；B：0.1％甲酸，80％ACN；梯度洗脱：0–8min,6–9％B；8–24min,9–14％B；24–60min,14–30％B；60–75min,30–40％B；75–78min,40–95％B。质谱条件为m/z:100–1500；AGCtarget：3e6；分辨率：70000等。用MAXQUANT检索Uniprot-Acipenser数据库并分析。对得到的肽序进行合成，HPLC分析合成肽的纯度(＞95％)。

实施例1:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物蛋白浓度为10％,加酶量为4000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量2mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为4.5的20mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入0.5M NaCl，线性梯度洗脱，流速为0.8mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽；

实施例2:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物浓度为15％,加酶量为4000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量4mL(上样浓度为15mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定(如图3)；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为5.0的20mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入0.8M NaCl，线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽。

实施例3:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物浓度为20％,加酶量为4000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定(如图1)；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为15mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为4.8的20mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入0.5M NaCl，线性梯度洗脱，流速为1.0mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽；

实施例4:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物浓度为20％,加酶量为5000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定(如图2)；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为20mg/mL)，流速为1.2mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为4.8的23mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入0.8M NaCl，线性梯度洗脱，流速为1.0mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽.

实施例5:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物浓度为10％,加酶量为6000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为4.8的25mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入0.5M NaCl，线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽。

实施例6:

(1)鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取背部肌肉绞成肉糜；

(2)称取鲟鱼肉糜50g(蛋白含量为19％)，加入蒸馏水，调整底物浓度为20％,加酶量为6000U/g，加入五种蛋白酶在各自最适条件进行酶解，蛋白酶酶解条件：胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶50℃，pH 8.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶55℃，pH 8.0。120rpm振荡6h反应结束后，酶解液沸水浴20min，快速冷却至室温。4℃，10000rpm离心15min，收集上清，抽滤冻干，得鲟鱼酶解产物，抗炎活性测定；

(3)采用截留分子量为10、3kDa超滤膜对(2)中抗炎活性较高的酶解产物分级分离，获得各组分，冻干，抗炎活性测定；

(4)使用Sephadex G-15凝胶柱对(3)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×70cm，上样量2mL(上样浓度为15mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，抗炎活性测定；

(5)使用SP-650M离子交换柱对(4)中抗炎活性较高的肽组分进一步纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为5.0的25mM醋酸钠缓冲液，洗脱液B为A基础上加入1.0M NaCl，线性梯度洗脱，流速为1.5mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗炎组分即为鲟鱼抗炎活性肽。

抗炎活性验证:

以实施例3为例，进行肽序鉴定、多肽合成及活性验证；

采用LC-MS/MS鉴定并分析实施例3中活性最高抗炎组分的肽序列，用MAXQUANT检索Uniprot-Acipenser数据库并分析；对得到的肽序进行合成，HPLC分析合成肽的纯度(＞95％)，验证合成肽的抗炎活性。

表1为合成肽对LPS诱导RAW264.7细胞中NO释放量的表达

表1显示对实施例3中活性最高抗炎组分进行肽序鉴定，分析，合成及抗炎活性验证。最终得到三种新型具有抗炎潜能的多肽序列，其结构为Lys–Ile–Trp–His–His–Thr–Phe、Val–His–Tyr–Ala–Gly–Thr–Val–Asp–Tyr、His–Leu–Asp–Asp–Ala–Leu–Arg–Gly–Gln–Glu，且依次来源于Actin、Myosin及Myosin。

三种合成肽在无细胞毒害作用的基础上，对NO释放量具有很好的抑制效果，在12.5-50μM浓度下，三种合成肽对LPS诱导RAW264.7细胞中NO抑制效果随剂量增加而提高。在50μM浓度下，KIWHHTF、VHYAGTVDY、HLDDALRGQE对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO抑制率为30.10％、28.8％及25.04％。

图1中A为实施例3中五种酶解产物对RAW264.7细胞活力测定结果图；B为实施例3中五种酶解产物处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；结果提示：胃蛋白酶酶解产物(0.5mg/mL)显著降低LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量，相较于其他酶解产物，抗炎效果更好，且在浓度0.125-2.0mg/mL范围内无细胞毒害作用。

图2为实施例步骤(3)中超滤后各组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；其中，＜3kDa组分(0.5mg/mL)显著降低LPS诱导RAW264.7细胞后NO的释放量，相较于胃蛋白酶酶解产物，NO释放量抑制率更高。

图3中A为实施例2步骤(4)中Sephadex G-15柱层析结果图；B为实施例2步骤(4)中经Sephadex G-15柱层析后组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；其中，F2(0.5mg/mL)显著降低NO释放量，相较于＜3kDa组分，NO释放量抑制率更高，即分子量较小的肽具有更强的抗炎作用。

图4中A为实施例1步骤(5)中SP-650M柱层析结果图；B为实施例1步骤(5)中经SP-650M后组分处理LPS诱导RAW264.7细胞后NO释放量测定结果图；其中，f1(0.5mg/mL)较于其他组分有更高的NO释放量抑制率，具有较好的抗炎效果，即为本发明所述的鲟鱼抗炎活性肽。

以上实施例仅用以说明本发明，而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种鲟鱼抗炎活性肽，其特征在于，包括具有抗炎潜能的三种多肽，其氨基酸序列为：

Lys–Ile–Trp–His–His–Thr–Phe；

Val–His–Tyr–Ala–Gly–Thr–Val–Asp–Tyr；

His–Leu–Asp–Asp–Ala–Leu–Arg–Gly–Gln–Glu。

2.一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将鲟鱼去皮去骨，洗净沥干，取肌肉部位绞成肉糜，并通过凯氏定氮法测定鲟鱼肉糜中粗蛋白含量；

(2)取步骤(1)中鲟鱼肉糜加蒸馏水均质，得到混合液，并调整混合液的底物蛋白浓度，再加入蛋白酶，进行单酶酶解，反应结束后，经振荡，得到酶解液，酶解液置于沸水浴中反应一段时间，然后冷却至室温；再离心，收集上清液、抽滤，得到鲟鱼酶解产物；

(3)采用超滤膜对(2)中得到的鲟鱼酶解产物进行分级分离，获得组分，冻干，得到冻干后的组分；

(4)对(3)中冻干后的组分进行纯化，蒸馏水洗脱，紫外检测波长为280nm，收集洗脱液，将同一分离峰合并，冻干，得到冻干后的组分；

(5)对(4)中冻干后的组分进一步纯化，纯化后，利用洗脱液线性梯度洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干，得到鲟鱼抗炎活性肽。

3.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述底物蛋白浓度为10％-20％。

4.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述蛋白酶为胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一种；胃蛋白酶为最优酶，加酶量为4000U/g-6000U/g。

5.根据权利要求2或4所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，所述不同蛋白酶的酶解条件不同；胃蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 2.0；中性蛋白酶的酶解条件为50℃，pH 7.0；碱性蛋白酶的酶解条件为50℃，pH 8.0；胰蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 8.0；木瓜蛋白酶的酶解条件为55℃，pH 8.0。

6.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述振荡的条件为：120rpm，6h；所述沸水浴中反应一段时间为20～30min；所述离心的条件为：4℃温度条件下以10000rpm离心15min。

7.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超滤膜的分子量为10kDa和3kDa。

8.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述纯化是使用Sephadex G-15凝胶柱，柱规格1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为2-5mL，样品浓度为10-20mg/mL。

9.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述纯化是使用SP-650M离子交换柱，柱规格1.2cm×50cm，流速为0.8-1.5mL/min。

10.根据权利要求2所述的一种鲟鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；洗脱液A为20-25mM的醋酸钠缓冲液，pH为4.5-5.0；洗脱液B为洗脱液A中再加入0.5-1.0M NaCl。

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