CN111635919A - 利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法，通过对枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到枯草芽孢杆菌发酵液，然后利用枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，制得了分子量小、纯度高、易于被人体吸收的胶原寡肽。本发明提供的方法中，动物皮的预处理仅需要进行简单的去除表面杂质的机械处理而不需要进行利用盐、碱、酸等化学试剂进行脱脂和除杂蛋白的化学预处理，避免了制备胶原寡肽的过程中使用化学试剂给环境带来污染的问题；同时，本发明提供的方法中，不需要加入昂贵的商品蛋白酶，显著降低了生产成本。

Description

利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法。

背景技术

胶原蛋白在化学作用如酸、碱或细菌、酶的作用下，发生分子链解体、断裂后，形成一种介于氨基酸和蛋白质之间的产物，该产物即为胶原寡肽，胶原寡肽的分子量一般分布在100-10000Da。胶原寡肽肽链越短、分子量越低，就越容易有效被人体吸收，目前市场上主要推出的胶原寡肽粉的分子量一般在3000Da-5000 Da的范围内。胶原寡肽分子量的大小主要取决于反应的方式、时间以及温度等。胶原寡肽可以广泛应用于食品、医药、化妆品、生物医疗材料等领域，如，在食品方面，胶原寡肽可以用作食品添加剂，改善食品的风味和营养，还可以用于功能食品和药品，调节人体代谢，加强人体健康；利用胶原寡肽的抗氧化作用，将其添加到化妆品中，可以淡化色斑，使皮肤更加湿润有弹性，延缓衰老；此外，胶原寡肽还具有多种生理功能，如抗氧化剂，抑制血管紧张素，抗凝剂和抗菌活性。目前，我国胶原寡肽通常处于供不应求的状态。

中国畜牧业资源和水产资源丰富，每年猪肉和鱼肉的产量巨大，由此产生了大量的猪皮、鱼皮等加工副产物，这些副产物如果利用不完全，不仅会造成资源的浪费，而且自然环境也会受到严重的威胁。猪皮、鱼皮等动物皮中富含胶原蛋白，是天然的提取胶原蛋白和胶原寡肽的原材料。利用动物皮提取胶原蛋白和胶原寡肽，不仅有利于减少畜牧和水产品加工副产物造成的环境污染，而且可以将清洁生产、资源综合利用、生态设计和可持续性消费融为一体，建立一条新型的加工生产线。

关于利用猪皮、鱼皮等动物皮制备胶原寡肽，现有技术中已有一些相关的研究和报道，目前公开的制备方法主要有热水浸提法、盐提取法、碱提取法、酸提取法、酶法以及上述方法的混合使用等。动物皮中一般会含有脂肪、非胶原蛋白及其他杂质，这些物质的存在对于胶原寡肽的提取率和性质都有非常大的影响。所以，提取胶原寡肽时，一般要先对原材料进行预处理，利用盐法、碱法、酸法以及热水浸提法中的一种或多种除去脂肪以及杂蛋白后，再利用酶法提取胶原寡肽。但是经盐法、碱法、酸法等化学方法预处理后，提取得到的胶原寡肽分子量分布不均匀且具有多种副产物，不利于人体的吸收利用。经研究发现，部分副产物还具有致癌致畸等毒性。此外，现在大多数提取胶原寡肽的酶采用的都是成品蛋白酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶等，这些蛋白酶的价格的价格比较昂贵，酶解过程中用量多，这样就使得整个生产流程下来，得到的胶原寡肽产品的成本较高，不利于生产。

因此，为了得到更安全实惠的胶原寡肽产品，还需要发现一种新的水解动物皮制备胶原寡肽的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用动物皮制备胶原寡肽的方法。通过对可以发酵产生胶原蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到富含胶原蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵液，然后利用枯草芽孢杆菌发酵液对没有进行脱脂以及杂蛋白处理的动物皮进行水解，制得了分子量小、易于被人体吸收利用的胶原寡肽。本发提供的利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法，以畜牧业和海洋水产废弃物中的动物皮为原料，不需要进行利用化学试剂对动物皮进行脱脂以及除杂蛋白的预处理，不需要利用昂贵的成品蛋白酶，实现了在降低成本且无污染的情况下制得人体易于吸收的小分子胶原寡肽，大大提高了畜牧业和海洋水产废弃物的高附加值利用。

根据本发明的一个方面，提供了一种利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法，包括如下步骤：

(1)对枯草芽孢杆菌进行发酵培养，收集枯草芽孢杆菌发酵液；

(2)去除动物皮表面杂质，然后将动物皮绞碎，干燥，得动物皮粉；

(3)将动物皮粉和水混合，灭菌，得动物皮混合液；

(4)加入动物皮混合液体积10-60％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间为3-8h，水解温度为30-60℃，水解结束后减压过滤，收集滤液，得动物皮水解液；

(5)对动物皮水解液进行超滤，收集滤液进行干燥，即得动物皮胶原寡肽。

本发明提供的方法中，动物皮的预处理仅需要进行简单的去除表面杂质的机械处理而不需要利用盐、碱、酸等化学试剂进行脱脂和除杂蛋白的化学预处理，避免了制备胶原寡肽的过程中使用化学试剂给环境带来污染的问题；同时，本发明提供的方法中，不需要加入昂贵的成品蛋白酶，显著降低了生产成本。本发明制得的胶原寡肽分子量分布均匀，蛋白质含量在90％以上，脂肪含量小于1.5％，胶原寡肽纯度高。

在一些实施方式中，枯草芽孢杆菌发酵液中，胶原蛋白酶活力可以为450-550U/mL。

本发明中，酶活力的定义为：在37℃、pH 7.0的反应条件下，每分钟水解酪蛋白并生成1μg酪氨酸所需要的蛋白酶的用量，即为1个酶活力单位(U)。

在一些实施方式中，步骤(1)中，对枯草芽孢杆菌进行发酵培养的步骤可以包括：取枯草芽孢杆菌单个菌落接种在种子培养基中，在温度为25-35℃、转速为120-180r/min的条件下培养10-15h，然后按4-8％的接种量接种于发酵培养基，在温度为25-35℃、转速为120-180r/min的条件下培养30-60h。

本发明中，接种量是指种子液与发酵培养基的体积百分比。

在一些实施方式中，步骤(1)中，对枯草芽孢杆菌进行发酵培养的步骤可以包括：取枯草芽孢杆菌单个菌落接种在种子培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养12h，然后按6％的接种量接种于发酵培养基，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养48h。在该发酵培养条件下，制得的枯草芽孢杆菌发酵液中的胶原蛋白酶的酶活大小为509U/mL。

在一些实施方式中，动物皮可以为猪皮或鱼皮。其中，鱼皮可以为罗非鱼鱼皮、鳕鱼鱼皮、鱿鱼鱼皮、石斑鱼鱼皮等。

在一些实施方式中，动物皮可以为猪皮。

当动物皮为猪皮时，在一些实施方式中，步骤(3)中，可以将猪皮粉和水按猪皮粉干燥前的湿重和水的体积的料液比1:0.5-1:2g/mL混合。在一些实施方式中，料液比可以为1:0.8g/mL。

当动物皮为猪皮、料液比为1:0.8g/mL时，在一些实施方式中，步骤(4)中，可以加入猪皮混合液体积56.7％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间可以为5h，水解温度可以为50℃。在此水解条件下，猪皮胶原蛋白的水解度可达15.23％。

在一些实施方式中，动物皮可以为鱼皮。

当动物皮为鱼皮时，步骤(3)中，可以将鱼皮粉和水按1:3-1:8g/mL的料液比混合。在一些实施方式中，料液比可以为1:6.8g/mL。

当动物皮为鱼皮、料液比为1:6.8g/mL时，步骤(4)中，可以加入鱼皮混合液体积34.3％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间可以为5h，水解温度可以为45℃。在此水解条件下，鱼皮胶原蛋白的水解度可达35.28％。

在一些实施方式中，步骤(5)中，进行超滤所用的超滤膜的截留分子量为5000Da。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明采用动物皮为原料，在没有采用任何化学方法对原料进行脱脂、脱杂蛋白的情况下，利用枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解制备胶原寡肽，避免了制备胶原寡肽的过程中使用化学试剂给环境带来污染的问题，提高了畜牧业和海洋水产废弃物的高附加值利用，实现了资源的充分利用；

(2)本发明对动物皮进行水解时，利用的是对可以发酵产生胶原蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到的富含胶原蛋白酶的枯草芽孢杆菌发酵液，没有采用成品蛋白酶，显著降低了生产成本；

(3)本发明制得的胶原寡肽，分子量小且分布均匀，纯度高，易于吸收利用；且本发明制得的胶原寡肽疏水性氨基酸含量高，抗氧化性强。

附图说明

图1为本发明制得的猪皮胶原寡肽的分子量分布图谱；

图2为本发明制得的鱼皮胶原寡肽的分子量分布图谱；

图3表示不同料液比对猪皮胶原蛋白的水解度的影响；

图4表示不同水解时间对猪皮胶原蛋白的水解度的影响；

图5表示不同枯草芽孢杆菌发酵液用量对鱼皮胶原蛋白的水解度的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所用原料和试剂为可以通过市售获得的常规产品；实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件。

本发明实施例中，所用枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌As 1398，由华南农业大学生命科学学院微生物实验室提供。

本发明实施例中，新鲜猪皮、鱼皮(罗非鱼鱼皮)购于广州瑞谷生物技术有限公司，-20℃保存备用。

本发明实施例中，种子培养基的配方为：牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L；pH7.2-7.5，121℃灭菌20min备用。

本发明实施例中，发酵培养基的配方为：蔗糖1.5％、胰蛋白胨1.5％、明胶0.2％、酵母粉0.25％、氯化钠0.2％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、KH₂PO₄·2H₂O 0.1％、MgSO₄·7H₂O0.01％，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min备用。

实施例1猪皮胶原寡肽的制备

包括如下步骤：

(1)挑取枯草芽孢杆菌单个菌落接种在种子培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下摇床培养12h，然后按6％的接种量接种于发酵培养基，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养48h；收集枯草芽孢杆菌发酵培养液，以酪蛋白为底物、采用酪氨酸测定法测定胶原蛋白酶的酶活，测得枯草芽孢杆菌发酵液中，胶原蛋白酶酶活大小为509U/mL；

(2)将猪皮简单清洗后，去除猪皮表面猪毛并用刀刮去猪皮表面脂肪，然后用绞肉机将猪皮绞碎，最后用烘箱将绞碎后的猪皮烘干，-20℃保存备用，得猪皮粉；烘干时，温度太高，蛋白质易变性；温度太低，不利于猪皮的烘干，本实施例中，烘干温度优选为50℃；

(3)取猪皮粉，按其干燥前的湿重与蒸馏水的料液比1:0.8g/mL加入蒸馏水，混合后将混合液121℃灭菌15min，得猪皮混合液；

(4)加入猪皮混合液体积56.7％的步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液对猪皮进行水解，水解时间为5h，水解温度为50℃，水解结束后利用孔径为0.22μm的微孔滤膜减压过滤，收集滤液，得含大分子肽的猪皮水解液；

(5)将猪皮水解液通过截流分子量为5000Da的超滤膜，其中需控制进口阀压力不大于30psi以免对膜造成损坏，出口阀压力为10psi，最后收集滤液，真空冷冻干燥48h，即得猪皮胶原寡肽，其中，冷冻干燥的温度为-50℃，压强为0.37mbar。

采用甲醛滴定法对猪皮胶原蛋白的水解度进行测定，测得本实施例中，猪皮胶原蛋白的水解度为15.23％。其中，水解度(％)＝[(蛋白水解后消耗碱量-蛋白不水解消耗碱量)/(蛋白完全水解消耗碱量-蛋白不水解消耗碱量)]×100。动物皮完全水解方法：脱脂后的猪皮在105℃下6mol/L的HCL中水解24h。

实施例2鱼皮胶原寡肽的制备

包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法同实施例1，胶原蛋白酶酶活大小为509U/mL；

(2)鱼皮简单清洗后，去除鱼皮表面脂肪以及残留的少许鱼鳞，然后用绞肉机将鱼皮绞碎，绞碎后的鱼皮置于50℃烘箱烘干，-20℃保存备用，得鱼皮粉；

(3)取鱼皮粉，按干燥的鱼皮粉与蒸馏水的料液比1:6.8g/mL加入蒸馏水，混合后将混合液121℃灭菌15min，得鱼皮混合液；

(4)加入鱼皮混合液体积34.3％的步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液对鱼皮进行水解，水解时间为5h，水解温度为45℃，水解结束后利用孔径为0.22μm的微孔滤膜减压过滤，收集滤液，得含大分子肽的鱼皮水解液；

(5)将鱼皮水解液通过截流分子量为5000Da的超滤膜，其中需控制进口阀压力不大于30psi以免对膜造成损坏，出口阀压力为10psi，最后收集滤液，真空冷冻干燥48h，即得鱼皮胶原寡肽，其中，冷冻干燥的温度为-50℃，压强为0.37mbar。

采用甲醛滴定法对鱼皮胶原蛋白的水解度进行测定，测得本实施例中，猪皮胶原蛋白的水解度为35.28％。

试验例1胶原寡肽的理化指标

取实施例1制得的猪皮胶原寡肽和实施例2制得的鱼皮胶原寡肽，对其外观、水分含量、蛋白质含量等理化指标进行测定，结果如表1所示。其中，相关测试方法如下：

水分含量的测定：参考GB/T 5009.3-2010中《食品安全国家标准食品中水分的测定》；

蛋白质含量的测定：参考GB/T 5009.5-2010中《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；

脂肪含量的测定：参考GB/T 5009.6-2003中《食品中脂肪的测定》；

灰分含量的测定：参考GB 5009.4-2010中《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；

铬、砷、铅含量的测定：参考GB/T 5009.123-2003中第一法原子吸收石墨炉法测定；

其余指标的测定参考QB 2732-2005。

表1本发明制得的胶原寡肽与QB 2732-2005标准的理化指标的对比

由表1的结果可知，本发明制得的胶原寡肽粉，色泽均与QB 2732-2005标准要求一致，都带有轻微的多肽特有的气味，不含有肉眼可见的杂质或者异物，溶解性能较好，在搅拌下能在1min内全部溶解于冷水或者热水中，成为淡黄色透明的液体。且本发明制得的胶原寡肽粉，蛋白质含量都高于90％，说明肽粉的纯度较高，同时，本发明提供的胶原寡肽粉中都不含有二氧化硫和过氧化物，铬(Cr)、砷(As)、重金属(以Pb计)含量也在QB 2732-2005标准范围内且远低于QB 2732-2005标准的限值，说明利用本发明方法制得的胶原寡肽粉安全性高。由于猪皮和鱼皮在水解前没有进行脱脂处理，因此，相对于其他经过脱脂处理的肽粉，本发明制得的胶原寡肽粉含有一定的脂肪，但含量极低，小于2％。

试验例2胶原寡肽分子量分布

取实施例1制得的猪皮胶原寡肽和实施例2制得的鱼皮胶原寡肽，由中山大学蛋白质组实验室对其相对分子质量及其分布进行测定。方法如下：

取1mg的样品溶解于1mL乙腈/0.1％TFA 1:1，配制好的样品与基质CHCA(10mg/mL,乙腈/0.1％TFA ,1:1)按1μL∶1μL的比例共2μL点在MALDI靶板上，于室温自然干燥后，将样品板放进布鲁克质谱Ultraflex III TOF/TOF，利用反射模式，采集范围小于10000Da，累加得到为最终图谱，结果如图1和图2所示。

由图1的结果可知，本发明制得的猪皮胶原寡肽的分子量主要分布在1466-4699Da，其中分子量在2379、3261、3427、4311Da所占比例最大，但主要集中在4311Da。

由图2的结果可知，本发明制得的鱼皮胶原寡肽的分子量主要分布在1468-4452Da，其中分子量在2113、2721、3402Da所占比例最大，但主要集中在2721Da。

试验例3胶原寡肽氨基酸含量

取实施例1制得的猪皮胶原寡肽和实施例2制得的鱼皮胶原寡肽，参考GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》的方法测定其氨基酸的组成，样品分析在日立L-8800型氨基酸自动分析仪中进行，具体操作：准确称取15mg样品于水解管中，加入10mL6mol/L浓盐酸溶解样品，充氮气，隔绝空气下110℃水解22h，过滤，取1mL滤液，蒸干，再用1～2mL双蒸水溶解，再蒸干，反复进行三次，最后用4mL pH 2.2的缓冲液溶解，用带过滤器的针孔过滤溶液，上机分析。样品中氨基酸含量的计算公式如下：

X＝C×1/20×F×V/M×10-3×100；

其中，X为样品中氨基酸含量(g/100g)；

C为样品测定液中氨基酸含量(ng/20μL)

F为样品稀释倍数(4倍)

V为水解液体积(mL)

M为样品质量(mg)

结果如表2和表3所示。

表2猪皮胶原寡肽氨基酸组成分析

注：“*”表示疏水性氨基酸，“#”表示芳香族氨基酸。

由表2的结果可知，猪皮胶原寡肽中，甘氨酸的含量最高，约占25.50％，疏水性氨基酸所占比例较高，达到20.09％，研究表明，肽的疏水作用与酶解产物的抗氧化性呈显著的正比例关系，由此，说明本发明制得的猪皮胶原寡肽具有较高的抗氧化性。

表3鱼皮胶原寡肽氨基酸组成分析

注：“*”表示疏水性氨基酸，“#”表示芳香族氨基酸。

由表3的结果可知，在鱼皮胶原寡肽中，氨基酸组成中甘氨酸含量是最高的，为22.40％，接近1/4，脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，占11.62％，不含有色氨酸，利用本发明的方法制得到的鱼皮胶原寡肽氨基酸的组成与胶原蛋白的一级结构特征非常吻合。疏水性氨基酸所占比例为32.92％，芳香族氨基酸所占比例为2.81％，这说明本发明提供的鱼皮胶原寡肽具有抗氧化作用。

试验例4料液比对猪皮胶原蛋白水解度的影响

称取6g(湿重)猪皮，在枯草芽孢杆菌发酵液用量为2mL，水解温度为45℃，水解时间为5h的条件下，料液比分别取1:0.6、1:0.8、1:1、1：1.2、1:1.4、1:1.6(g/mL)，其他步骤和条件同实施例1，对猪皮进行水解，然后测定猪皮胶原蛋白的水解度，结果如图3所示。由图3的结果可知，当料液比为1:0.8时，猪皮胶原蛋白的水解度最高。

试验例5水解时间对猪皮胶原蛋白水解度的影响

称取6g(湿重)猪皮，在料液比为1:1，枯草芽孢杆菌发酵液用量为2mL，水解温度为45℃的条件下分别水解1、2、3、4、5、6h，然后测定猪皮胶原蛋白的水解度，结果如图4所示。其中，其他步骤和条件同实施例1。

由图4的结果可知，水解时间为5h时，猪皮胶原蛋白的水解度最高。

此外，通过响应曲面试验确定猪皮胶原寡肽的最佳提取条件时发现，利用本发明提供的方法制备猪皮胶原寡肽的过程中，水解温度、水解时间、料液比以及枯草芽孢杆菌发酵液用量这四个因素之间的相互影响很复杂，可能是枯草芽孢杆菌发酵液中的枯草芽孢杆菌或其他酶类物质对猪皮胶原蛋白的水解过程产生了抑制作用。

试验例6枯草芽孢杆菌发酵液用量对鱼皮胶原蛋白水解度的影响

取3g鱼皮粉(干重)，在料液比为1:7，枯草芽孢杆菌发酵液用量分别为3、4、5、6、7、8、9mL，水解温度为45℃的条件下水解5h后测定鱼皮胶原蛋白的水解度，结果如图5所示。由图5的结果可知，当枯草芽孢杆菌发酵液用量为5mL时，鱼皮胶原蛋白的水解度最高，随着酶浓度的升高，反而会抑制水解的进行从而使水解度下降。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.利用枯草芽孢杆菌水解动物皮制备胶原寡肽的方法，包括如下步骤：

(1)对枯草芽孢杆菌进行发酵培养，收集枯草芽孢杆菌发酵液；

(2)去除动物皮表面杂质，然后将动物皮绞碎，干燥，得动物皮粉；

(3)将动物皮粉和水混合，灭菌，得动物皮混合液；

(4)加入动物皮混合液体积10-60％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间为3-8h，水解温度为30-60℃，水解结束后减压过滤，收集滤液，得动物皮水解液；

(5)对动物皮水解液进行超滤，收集滤液进行干燥，即得动物皮胶原寡肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌发酵液中，胶原蛋白酶活力为450-550U/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述对枯草芽孢杆菌进行发酵培养的步骤包括：取枯草芽孢杆菌单个菌落接种在种子培养基中，在温度为25-35℃、转速为120-180r/min的条件下培养10-15h，然后按4-8％的接种量接种于发酵培养基，在温度为25-35℃、转速为120-180r/min的条件下培养30-60h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述对枯草芽孢杆菌进行发酵培养的步骤包括：取枯草芽孢杆菌单个菌落接种在种子培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养12h，然后按6％的接种量接种于发酵培养基，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养48h。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述动物皮为猪皮或鱼皮。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述动物皮为猪皮；所述步骤(3)中，将猪皮粉和水按猪皮粉干燥前的湿重和水的体积的料液比1:0.5-1:2g/mL混合；优选的，所述料液比为1:0.8g/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入猪皮混合液体积56.7％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间为5h，水解温度为50℃。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述动物皮为鱼皮，所述步骤(3)中，将鱼皮粉和水按1:3-1:8g/mL的料液比混合；优选的，所述料液比为1:6.8g/mL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入鱼皮混合液体积34.3％的枯草芽孢杆菌发酵液对动物皮进行水解，水解时间为5h，水解温度为45℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，进行超滤所用的超滤膜的截留分子量为5000Da。

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