CN114539388A - 一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法 - Google Patents

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CN114539388A CN202210068075.8A CN202210068075A CN114539388A CN 114539388 A CN114539388 A CN 114539388A CN 202210068075 A CN202210068075 A CN 202210068075A CN 114539388 A CN114539388 A CN 114539388A
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Abstract

本发明属于胶原蛋白制备技术领域，公开了一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法。包括鲑鱼皮成粉、制备发酵所用菌培养基、制备半固体发酵培养基、发酵培养。采用微生物发酵法制备胶原蛋白，相比于生物酶法可产生具有活性的酶，并且操作简单，条件温和，成本低廉，得到的蛋白多肽具有良好的功能性，在一定程度上还能达到除腥、除臭的效果，使最终发酵产品更具营养价值。

Description

一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法
技术领域
本发明属于胶原蛋白制备技术领域，具体涉及一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法。
背景技术
鲑鱼具有很高营养价值且口感好，最受欢迎的食用鱼品种之一。全球每年鲑鱼产量达到260多万t，但鲑鱼加工过程中产生的大量鱼皮、鱼骨、鱼头等副产物被作为制作鱼粉和饲料的原料进行回收或被丢弃造成环境污染，对其中的有价值成分尚需进一步开发利用。鲑鱼鱼皮是丰富的海洋蛋白资源，含有丰富的胶原蛋白。由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得水产动物的胶原蛋白具有很多陆地畜类胶原蛋白所没有的优点，且水产动物的胶原蛋白具有更高的生物活性及生物相容性，广泛应用于食品、化妆品和医药用品领域。因此，对于水产胶原蛋白的研究日益广泛。
目前有研究使用物理、化学或生物酶法提取鱼皮中的胶原蛋白，其中物理和化学法提取效果不佳，且加工过程及化学试剂对胶原蛋白的活性影响较大。生物酶法提取鱼皮胶原蛋白的得率较高，且具有提高蛋白活性的作用。但生物酶法的提取成本相对较高。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，以鲑鱼皮为原料，采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白，通过筛选发酵菌株，采用单因素和响应面法优化微生物发酵条件，评价发酵后鲑鱼皮蛋白抗氧化活性，分析氨基酸组成含量及发酵对挥发性物质和风味物质的影响，为后续发酵鱼皮蛋白在食品、保健品领域应用研究提供实验数据基础。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，步骤如下：
1.将新鲜鲑鱼鱼皮于65℃烘干5d，然后使用粉碎机打成粉状，过筛后于干燥器保藏备用；
2.根据发酵所用菌制作相应培养基，将发酵所用菌接种于相应培养基中，在温度30℃、转速30r/min的条件下培养48h而后放入恒温箱培养72h备用；
3.制备半固体发酵培养基：步骤1制得的干鱼皮粉与蒸馏水混合，高压灭菌后备用；
4.将发酵所用菌接入步骤3所述的半固体发酵培养基中进行发酵培养，培养处理后的发酵液经温度为4℃、转速为8000r/min的条件下离心20min后取其上清液。
进一步的，所述步骤1中筛目数为60目。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌为细菌、酵母菌、霉菌中的一种。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌接种于相应培养基的接种量为相应培养基体积分数的4％、6％、8％、10％、12％中任一种。
进一步的，所述步骤3中干鱼皮粉与蒸馏水质量比为1：1.5、1：2、1：3、1：4中任一种。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌细菌具体为凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌为细菌时，相应培养基为LB液体培养基，LB液体培养基成分具体为胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，LB液体培养基中细菌浓度为108cfu/mL，步骤2中恒温箱温度为37℃。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌酵母菌具体为酿酒酵母、面包酵母中的一种。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌为酵母菌时，相应培养基为YPD液体培养基，YPD液体培养基成分具体为葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，YPD液体培养基中酵母菌浓度为106cfu/mL，步骤2中恒温箱温度为25℃。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌霉菌具体为米曲霉菌、红曲霉菌中的一种。
进一步的，所述步骤2中发酵所用菌为霉菌时，相应培养基为PD液体培养基，PD液体培养基成分具体为葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，PD液体培养基中霉菌浓度为106个孢子/mL，步骤2中恒温箱温度为25℃。
本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明制备胶原蛋白原料为鲑鱼皮，相较于现有制备胶原蛋白的原料在不降低产出的前提下具有价格低廉的优势；本发明采用微生物发酵法制备胶原蛋白，相比于生物酶法可产生具有活性的酶，并且操作简单，条件温和，成本低廉，得到的蛋白多肽具有良好的功能性，在一定程度上还能达到除腥、除臭的效果，使最终发酵产品更具营养价值；使用本发明制备方法制备出的胶原蛋白具有口感丰富、可持续性鲜味、可溶性蛋白含量高、可清除DPPH自由基、可清楚羟自由基、可清除超氧阴离子的优点。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
图1为不同菌株发酵对鲑鱼皮蛋白提取率的影响示意图；
图2为不同料液比对蛋白提取率的影响示意图；
图3为不同接种量对蛋白提取率的影响示意图；
图4为不同发酵时间对蛋白提取率的影响示意图；
图5为不同发酵温度对蛋白提取率的影响示意图；
图6为发酵前后鲑鱼皮挥发性物质变化雷达图；
图7为发酵对鲑鱼皮的滋味影响变化雷达图；
图8为发酵前后不同分子量范围鲑鱼皮蛋白的含量变化示意图；
图9为不同分子量范围鲑鱼皮胶原多肽和Vc清除DPPH的IC50示意图；
图10为不同分子量范围鲑鱼皮胶原多肽和Vc清除羟自由基的IC50示意图；
图11为不同分子量范围鲑鱼皮胶原多肽和Vc清除超氧阴离子的IC50。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
实验菌种：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae B1、面包酵母Saccharomycescerevisiae A1、米曲霉Aspergillus oryzae、红曲霉Monacus anka、保加利亚乳杆菌:Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，以上菌种均可从商业途径获得。
制备原料粉鲑鱼鱼皮由大连本利食品有限公司提供，鲑鱼鱼皮的基础成分见表1，将新鲜的鱼皮于65℃烘干5d，然后用粉碎机打成粉状并过60目筛子，于干燥器保藏备用。
表1鲑鱼鱼皮的基础成分
Figure BDA0003480952820000041
培养基：LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L)、YPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，)和PD液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L)，凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌分别接种于LB液体培养基，酿酒酵母、面包酵母分别接种于YPD液体培养基，米曲霉、红曲霉分别接种于PD液体培养基中，PD液体培养基和YPD液体培养基放入25℃的恒温箱培养72h，LB液体培养基放入37℃的恒温箱中培养72h后备用。
半固体发酵培养基：干鱼皮粉10g，蒸馏水20mL混合，于高压灭菌后备用。
单菌种发酵：将凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、面包酵母、米曲霉、红曲霉、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌接入不同的半固体发酵培养基进行发酵培养，其中凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌浓度为108cfu/mL，酿酒酵母、面包酵母浓度为106cfu/mL，米曲霉、红曲霉浓度为106个孢子/mL，上述菌种以半固体发酵培养基体积的6％的接种量分别接入到不同的半固体发酵培养基中，在温度30℃、转速30r/min条件下培养48h，将各处理的发酵液经温度4℃、转速8000r/min条件下离心20min后，取其上清液。
成分分析：上述水分、蛋白质含量、粗脂肪、灰分的测定采用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法、凯氏定氮法、索氏抽提法、马弗炉灼烧法。胶原蛋白的测定采用GB/T 9695.23-2008《食品安全国家标准肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》的测定方法；
通过计算羟脯氨酸含量后换算得到单菌种发酵中测定的胶原蛋白含量。根据公式2.1计算胶原蛋白提取率。
Figure BDA0003480952820000042
采用福林-酚法得到单菌种发酵中测定的可溶性蛋白含量，根据公式2.2计算可溶性蛋白提取率。
Figure BDA0003480952820000051
8种微生物发酵鲑鱼鱼皮的结果见图1。8种菌发酵鲑鱼皮的发酵产物中可溶性蛋白和胶原蛋白有显著差异(P＜0.05)。未发酵过的鱼皮粉(空白对照组)，经水提后可溶性蛋白和胶原蛋白提取率分别达到51.36％和45.98％。而经过不同的菌株发酵后，发酵上清液的蛋白含量都有明显增加，其中酿酒酵母、红曲霉和凝结芽孢杆菌的发酵效果最优，可溶性蛋白的提取率分别为90.34％、84.45％和82.41％。从可溶性蛋白提取率的差异性分析中可以看出，酿酒酵母、红曲霉、凝结芽孢杆菌三株菌之间的差异性不显著，但与其它菌株的差异性均显著。但胶原蛋白提取率的差异性分析中可以看出，酿酒酵母提取率最高，为71.8±1.29％，与其他菌株的差异性均显著。所以选择酿酒酵母进行下一步发酵试验。
检测不同料液比对蛋白提取率的影响：将鱼皮：水按1:1.5、1:2、1:3、1:4的比例分别配制不同发酵培养基，将酿酒酵母种子液按6％接种量接种发酵培养基，于30℃，30r/min培养24h，发酵产物4℃，8000r/min离心20min后测上清液中可溶性蛋白和胶原蛋白含量，结果如图2。当鱼皮与水的比例为1:2时，胶原蛋白提取率达到了72.12％，明显高于其他3种料液比且差异性显著。当料液比为1:3和1:4时，蛋白提取率差异不显著。
检测不同接种量对蛋白提取率的影响：将酿酒酵母种子液按4％、6％、8％、10％、12％的接种量，接种发酵培养基，于30℃，30r/min条件下培养24h，将发酵产物4℃，8000r/min离心20min后测定上清液蛋白含量，结果如图3。蛋白提取率随着接种量的增加逐渐升高，当接种量为8％时，达到最高值。此时，可溶性蛋白和胶原蛋白的提取率最高达到了93％和76％，可得知种子液的最适接种量为8％。初始接种量会影响微生物的生长和代谢。接种量过小时，微生物生物量小，同等条件下生长量小，产生的蛋白酶数量也会减少。接种量过大时，生长周期缩短使得生物量增加，过大的生物量需要营养物质，反而会消耗发酵液中的蛋白。所以接种量过低或过高都会影响蛋白的提取率。
检测不同发酵时间对蛋白提取率的影响：将种子液按8％的接种量接种发酵培养基，于30℃，30r/min分别培养12h、18h、24h、36h、42h、48h后取样测定蛋白含量。由图4可见，蛋白提取率随着发酵时间的延长先升高，达到峰值后呈下降趋势。当发酵时间为24h时，可溶性蛋白和胶原蛋白提取率最高，可得出发酵的最佳时间为24h。超过24h后，蛋白提取率降低的原因可能是随着发酵时间的延长，菌生长过多将分解出来的可溶性蛋白重新利用，从而使发酵液中的蛋白含量减少。
检测不同发酵温度对蛋白提取率的影响：将已接种的发酵培养基分别置于20℃、25℃、30℃、35℃的恒温培养箱中培养，24h后取样测定蛋白含量。由图5结果可知，当温度为30℃时，蛋白提取率最高，可知发酵的最适温度为30℃。过低的温度和过高的温度都会使菌的活性降低，并且不利于菌的生长繁殖进而影响产酶量。因此，适宜的温度能使菌更好地利用鱼皮进行发酵，有利于提高目的产物的提取率。
在上述单因素检测筛选的基础上，利用响应面实验进一步优化酿酒酵母发酵制备鲑鱼皮胶原蛋白的最佳发酵条件。因素水平及实验结果见表2。
表2响应面实验结果
Figure BDA0003480952820000061
Figure BDA0003480952820000071
采用Design-Expert软件，以胶原蛋白提取率为响应值，对该模型进行分析后可得到如下回归方程：Y＝+75.66-0.77A-0.37B-1.08C-1.10D+0.56AB+0.87AC-1.99AD-0.31BC+0.62BD+0.93CD-11.29A2-8.09B2-6.22C2-6.44D2。其中Y为胶原蛋白提取率，A、B、C、D分别为料液比、温度、时间和接种量。对响应面二次模型的方差分析见表3。
表3响应面二次模型的方差分析表(胶原蛋白)
Table 3 Analysis of Variance for Response Surface Quadratic Model(Collagen)
Figure BDA0003480952820000072
Figure BDA0003480952820000081
注：*显著性(P＜0.05)，**极显著性(P＜0.01)，△不显著，R2＝0.9371
对回归方程的显著性分析结果表明，模型R2＝0.9371，P≤0.01表示该模型的回归方程极其显著，用该模型模拟提取过程是有效的。可以采用该模型对不同条件下鲑鱼皮胶原蛋白的提取进行预测和分析。通过响应面和回归方程分析确定酿酒酵母发酵制备鲑鱼皮胶原蛋白的最优发酵条件为：料液比1:1.99，温度29.87℃，时间22.86h，接种量7.82％，预测的胶原蛋白提取率为75.77％。根据预测最优发酵条件，进行了验证实验，3次平行验证实验所得到的实际的胶原蛋白提取率为76.11％，与预测值的相对误差≤0.4％，说明该模型可应用于预测酿酒酵母发酵制备鲑鱼皮胶原蛋白的提取率。考虑便于实际生产控制，取条件：料液比1:2，温度30℃，时间23h，接种量8％为最佳发酵条件。
发酵前后样品的氨基酸测定结果见表4，从两种样品中测出了16种氨基酸，其中7种为必需氨基酸。经过发酵，发酵样品中的甘氨酸、精氨酸含量增加，其他氨基酸含量差异性不大。通过比较得知，发酵后发酵样品中的氨基酸总含量明显增加，比未发酵样品中的氨基酸总含量增加了7.36g/100g，说明发酵后的样品营养成分的含量更高，更具有营养价值。
表4鲑鱼皮不同处理样品中氨基酸的含量分析 单位：g/100g
Figure BDA0003480952820000082
Figure BDA0003480952820000091
对鲑鱼皮发酵产品进行风味评价：采用德国AIRSENSE-PEN3型电子鼻，测定鲑鱼皮中主要10种挥发性风味物质含量。准确量取10mL鲑鱼皮粉发酵液于50mL进样瓶中密封，并在室温下留存30min使其瓶内气体平衡。安装好活性炭过滤装置和进样探头后，先抽取60s空气，随后插入电子鼻探头，与液面保持1-2cm的距离，开始测定香气物质。电子鼻实验条件：采样时间间隔1s/组，传感器清洗时间为120s，传感器归零时间为5s，样品准备时间为5s，进样流量为600mL/min，试验测试分析时间为60s；通过电子舌模拟人舌头的感受机制测定感受味觉。其味觉信息主要包括5个基本味(酸味、苦味、涩味、鲜味、咸味、甜味)，3个回味(苦味回味、涩味回味、鲜味回味)。
鱼类的挥发性主要为羰基类、醇类、烃类、脂类和含硫、含氮化合物等，其中对鱼的香气特征起到重要作用的是羰基和醇类。如表5所示，发酵前鲑鱼皮粉蛋白提取液中的10种挥发性物质的响应值差异均显著。发酵前后W3S(烷类和脂肪族)、W1C(芳烃化合物)、W3C(氨方向分子)、W6S(氢化物)、W5C(烯烃、芳族、极性分子)5种挥发性物质的响应值变化较小，说明经过微生物发酵，这些挥发性物质没有发生量的改变，这几种物质是鱼皮中稳定存在的物质。经过发酵，W1S(烷类)、W1W(硫化合物)、W2S(醇和部分芳香化合物)、W2W(芳烃化合物、硫的有机化合物)、W5S(氮氧化物)的响应值明显升高，说明发酵对这5种挥发性物质的影响较大。
表5发酵前后鲑鱼皮挥发性物质变化的差异性分析
Figure BDA0003480952820000101
鱼类挥发性成分中的含硫化合物主要有二甲基二硫、甲硫醇等，二甲基硫在低浓度时表现出的是一种类似蟹香的气味，而含氮化合物主要为三甲胺、2-甲基吡啶等，这些化合物具有烤香和肉香。从图5中可以看出经过发酵，含硫、含氮化合物的响应值的小幅增加说明了发酵后产生的是香味而不是异味。从图5中还可以看出，发酵对醇类和烷类的产生影响最大，表示经过酿酒酵母的发酵增加了鲑鱼皮发酵液酒的香气，能够一定程度地缓解鱼皮本身的鱼腥味，更有利于鱼皮在食品加工生产方面的应用。其中，W1C表示芳香化合物，W5S表示氮氧化物，W3C表示氨方向分子，W6S表示氢化物，W5C表示烯烃和芳族的极性分子，W1S表示烷类(S6及以下)，W1W表示硫化合物，W2S表示醇及部分芳香族化合物，W2W表示芳烃和硫有机化合物，W3S表示烷类和脂肪族。
电子舌根据8味觉传感器对发酵液进行检测，得到了发酵前后发酵液的鲜味回味、咸味、酸味、苦味、涩味、苦味回味、涩味回味、鲜味8个滋味指标的响应值(图7)结果显示，8个味觉传感器对发酵液的滋味均有响应，但是敏感度存在一定差异。发酵前后鲜味、酸味、苦味、涩味、苦味回味、涩味回味的差异不显著，说明发酵并没有使这些滋味的表现更明显。发酵后咸味略有增加，鲜味回味明显增加，说明经过发酵，鲜味的可持续性表现更突出，其感官特性在一定程度上表现优于发酵前。
发酵前后不同分子量可溶性蛋白的含量测定：鲑鱼鱼皮干粉经过酵母菌发酵后，4℃10000xg离心20min，取上清液，经0.45μm滤膜初步过滤，去除发酵上清液中的杂蛋白和杂质，再采用截留分子量3kDa和10kDa的超滤离心管依次对鲑鱼皮的未发酵上清液和发酵后上清液进行超滤分级，最终分别获得发酵前后不同分子量范围的蛋白，标记为：CSP I(<3kDa)，CSP II(3～10kDa)和CSP III(>10kDa)3组样品。经过计算，发酵前后不同分子量范围蛋白含量的变化如图8所示。从图中可以看出，发酵后不同分子量范围的样品CSP I(<3kDa)、CSP II(3～10kDa)和CSP III(>10kDa)中的蛋白含量均有明显提高。经过发酵后样品CSP I(<3kDa)的蛋白含量由182.72mg提高到了263.26mg，蛋白含量增加了44.07％。经过发酵，样品CSP II(3～10kDa)和CSP III(>10kDa)中的蛋白含量几乎增加了1倍。发酵后3个分子量范围的蛋白含量的提高都说明了经过微生物作用鱼皮中的蛋白被分解成可溶性蛋白，并且微生物能一定程度地将大分子蛋白分解成小分子蛋白，所以低分子量低的蛋白含量也有所增加。
检测提取的胶原蛋白对DPPH自由基的清除作用：将发酵制备的不同分子量的鲑鱼皮蛋白肽测定DPPH自由基清除率，空白对照组A0：取2mL不同分子量的截留液与混匀。样液组AX：加入2mL不同分子量的鱼皮蛋白肽截留液与2mL DPPH溶液充分混匀。分别以95％乙醇代替DPPH溶液(A0)和以蒸馏水代替截留液(Ax0)为对照，DPPH自由基清除率计算公式如下。实验重复三次。以Vc的DPPH清除率为对照，比较不同组分的IC50值(半数清除率浓度)，IC50值为自由基清除率为50％时所需要的样品浓度为参比，IC50值越低，则表示自由基的清除率越高，抗氧化性能越强。
Figure BDA0003480952820000121
天然抗氧化剂Vc清除DPPH自由基的IC50值为0.0054mg/mL(图9)，说明当DPPH清除率为50％，只需要0.0054μg/mL的Vc，表示Vc的抗氧化性很强。发酵前后的CSP I(<3kDa)和CSP II(3～10kDa)2种蛋白样品清除DPPH自由基的IC50值差异不显著，说明发酵前后发酵液中的分子量小于10kDa的蛋白对DPPH自由基的清除能力差异很小。对于样品CSP III(>10kDa)，发酵前的清除DPPH自由基的IC50值是发酵后的两倍，说明发酵后发酵液中的大分子蛋白抗氧化性能更强，这可能是由于经过微生物的分解，大分子蛋白中的一部分蛋白被分解成了相对分子量较小的蛋白。从图9也可以看出，鲑鱼皮经发酵后制备的蛋白其抗氧化活性显著提高。
检测提取的胶原蛋白对羟自由基的清除作用：采用水杨酸法对鲑鱼皮蛋白的羟自由基清除率进行测定。样液组AX：先加入2mL 2mmol/L FeSO4、2mL1mmol/LH2O2，再加入0.5mL不同分子量的鱼皮蛋白肽，充分混匀后最后加入2mL 6mmol/L水杨酸再次混匀。于37℃水浴锅中水浴加热反应15min，在510nm处测定吸光值，分别以不添加H2O2(AX0)和以蒸馏水代替截留液(A0)为对照，根据下列公式计算其羟自由基清除率。实验重复三次。同理，以Vc的羟自由基清除率为对照，比较不同组分的IC50值。
Figure BDA0003480952820000122
以Vc的羟自由基清除率为对照，比较不同组分的IC50值。
如图10，发酵前的样品CSP II(3～10kDa)和CSP III(>10kDa)清除羟自由基的IC50值明显低于发酵后的IC50值，说明在通过发酵，这2个分子量范围中的蛋白可能发生变化，导致对于羟自由基的清除能力减弱。但是对于蛋白样品CSP I(<3kDa)来说，发酵后的IC50值为0.5502mg/mL，而发酵前的IC50值为0.7323mg/mL，说明发酵后的分子量低于3kDa的清除羟自由基能力更强。以Vc的IC50值作为对照，3个分子量段的蛋白对羟自由基的清除能力均强于Vc的清除能力，由图10中也可以明显看出，蛋白分子量越小，对羟自由基的清除能力也越强。
检测提取的胶原蛋白对超氧阴离子的清除作用：按照如下方法对鲑鱼皮蛋白的超氧阴离子自由基清除率进行测定。样液组A1：取截留液0.1mL，加入2.8mL50mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)充分混匀，进行25℃水浴反应10min，最后加入0.1mL 3mmol/L焦性没食子酸溶液(25℃水浴预热好)。放置反应4min后立即在320nm处测吸光值。分别以蒸馏水代替截留液(A2)，HCl代替焦性没食子酸溶液(A3)为对照，根据下列公式计算出超氧阴离子自由基清除率。实验重复3次。同理，以Vc的超氧阴离子自由基清除率为对照，比较不同组分的IC50值。
Figure BDA0003480952820000131
以天然抗氧化剂Vc做阳性对照不同分子量段的鲑鱼皮蛋白均具有清除超氧阴离子的能力，发酵后的CSP I(<3kDa)、CSP II(3～10kDa)和CSP III(>10kDa)的超氧阴离子清除能力均强于发酵前，其中发酵后分子量低于3kDa的蛋白的清除超氧阴离子的IC50值为0.1163mg/mL，低于Vc的IC50值(图11)。由图11可以看出，蛋白的分子量越小，其IC50值越低，表示其抗氧化活性越强，且发酵后的蛋白抗氧化活性强于发酵前。
结论：
(1)酿酒酵母菌发酵鲑鱼皮制备胶原蛋白的最优发酵条件为：料液比1:2，温度30℃，时间23h，接种量8％。在此条件下，胶原蛋白提取率为76.11％，比未发酵鲑鱼皮的胶原蛋白提取率提高了30％。
(2)发酵后3个分子量范围的蛋白抗氧化活性均高于发酵前的IC50值，说明发酵后的蛋白抗氧化活性更强。其中，3个分子量范围的蛋白对羟自由基的清除能力优于Vc的清除能力；进一步验证了蛋白分子量越小，其抗氧化活性越强。
(3)发酵样品中各类氨基酸含量与未发酵样品差异性不大，发酵样品的氨基酸总含量比未发酵样品增加了7.36g/100g。
(4)发酵对W1S(烷类)、W1W(硫化合物)、W2S(醇和部分芳香化合物)、W2W(芳烃化合物、硫的有机化合物)、W5S(氮氧化物)5种挥发性物质的影响均显著，说明了发酵可能使发酵液产生酒的香气从而缓解鱼本身带有的腥味。
(5)发酵提高了鲜味的可持续性，使口感更丰富。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将新鲜鲑鱼鱼皮于65℃烘干5d，然后使用粉碎机打成粉状，过筛后于干燥器保藏备用；
(2)根据发酵所用菌制作相应培养基，将发酵所用菌接种于相应培养基中，在温度30℃、转速30r/min的条件下培养48h而后放入恒温箱培养72h备用；
(3)制备半固体发酵培养基：步骤1制得的干鱼皮粉与蒸馏水混合，高压灭菌后备用；
(4)将发酵所用菌接入步骤3所述的半固体发酵培养基中进行发酵培养，培养处理后的发酵液经温度为4℃、转速为8000r/min的条件下离心20min后取其上清液。
2.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1中筛目数为60目。
3.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵所用菌为细菌、酵母菌、霉菌中的一种。
4.根据权利要求2所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述细菌具体为凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种；酵母菌具体为酿酒酵母、面包酵母中的一种；霉菌具体为米曲霉菌、红曲霉菌中的一种。
5.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵所用菌接种于相应培养基的接种量为相应培养基体积分数的4％、6％、8％、10％、12％中任一种。
6.根据权利要求2所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵所用菌为细菌时，相应培养基为LB液体培养基，LB液体培养基成分具体为胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，LB液体培养基中细菌浓度为108cfu/mL，步骤2中恒温箱温度为37℃。
7.根据权利要求2所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵所用菌为酵母菌时，相应培养基为YPD液体培养基，YPD液体培养基成分具体为葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，YPD液体培养基中酵母菌浓度为106cfu/mL，步骤2中恒温箱温度为25℃。
8.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中发酵所用菌为霉菌时，相应培养基为PD液体培养基，PD液体培养基成分具体为葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，PD液体培养基中霉菌浓度为106个孢子/mL，步骤2中恒温箱温度为25℃。
9.根据权利要求1所述的采用微生物发酵法制备鲑鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3中干鱼皮粉与蒸馏水质量比为1：1.5、1：2、1：3、1：4中任一种。
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